Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Этиологическая структура болезней органов пищеварения телят, вызываемых патогенными энтеробактериями 7
1.2. Особенности формирования биопленок бактерий при болезнях органов пищеварения телят 19
1.3. Патогенные свойства и фенотипические признаки энтеробактерий, связанные с плазмидами вирулентности 23
1.4. Чувствительность энтеробактерий к антибактериальным препаратам 32
1.5. Заключение по обзору литературы 39
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Эпизоотологические и клинико-морфологические методы исследований 49
2.2. Методы индикации и идентификации энтеробактерий 56
2.3. Методы изучения биопленок бактерий 62
2.4. Методы изучения патогенных свойств бактерий 64
2.5. Методы статистической обработки результатов исследований 69
Глава 3. Результаты исследований 81
3.1. Результаты эпизоотологических и клинико-морфологических исследований болезней органов пищеварения телят 82
3.2. Результаты индикации и идентификации бактерий при снижении колонизационной резистентности кишечника телят 91
3.3. Исследование формирования биопленок бактерий при болезнях органов пищеварения телят 95
3.4. Результаты изучения патогенных свойств и фенотипических признаков энтеробактерий, связанных с плазмидами вирулентности 98
3.5. Результаты изучения чувствительности энтеробактерий к антибактериальным препаратам 104
Обсуждение результатов 104
Выводы 104
Практические предложения 123
Список литературы 126
- Особенности формирования биопленок бактерий при болезнях органов пищеварения телят
- Методы изучения патогенных свойств бактерий
- Результаты эпизоотологических и клинико-морфологических исследований болезней органов пищеварения телят
- Результаты изучения патогенных свойств и фенотипических признаков энтеробактерий, связанных с плазмидами вирулентности
Введение к работе
Актуальность темы. При реализации системы содержания крупного
рогатого скота, концентрации поголовья на ограниченных площадях,
комплектовании хозяйств животными одного вида и возраста, наличие
морфофункциональных особенностей организма раннего постнатального
периода, увеличение числа и спектра патогенных убиквитарных
микроорганизмов способствуют распространению инфекционной патологии телят, массовая доля сальмонеллеза составляет 2,3–3,8 %, эшерихиоза – 70,0 – 82,0 % (Каврук Л.С., 1994; Сидоров М.А. и соавт., 1998; Макаров В.В., 2009; 2017; Пирожков М. К., 2011; Сидорчук А.А., 2012; Субботин В. В., 2013; Ленченко Е. М. и соавт., 2014; Шахов А.Г., 2015; Джупина С.И., 2016; Маннапова Р.Т., 2016).
Социальная значимость проблемы определяется тем, что при
многократных пассажах возбудителей через восприимчивый организм,
атипическом проявлении клинико-морфологических признаков болезней, персистенция бактерий сопровождается контаминацией пищевого сырья, например, говядины – 19,0 – 33,6 %, в том числе Salmonella spp. – 19,0 –
27.3 %; энтерогеморрагические эшерихии – 7,3 – 8,4 %; БГКП – 17,8–31,2 %
(Шадрова Н.Б., 2012; Быков Г.Т. и соавт., 2016; Костенко Ю.Г., 2016;
Татарникова Н.А., Чугунова Е.О., 2016).
Наличие сходных ферментов, популяционная изменчивость,
множественность факторов вирулентности, разнообразие лабораторных
моделей обусловливают трудоемкость, продолжительность, ретроспективность
дифференциации эпизоотических штаммов. Серологическая идентификация
сопряжена с вариабельностью поверхностных антигенов: род Salmonella
объединяет более 2200 серовариантов; E. coli – 180 серогрупп – О-антиген, 104
– K-антиген, 56 – H-антиген; молекулярно-генетическая диагностика – с
гомологией нуклеотидных последовательностей энтеробактерий (92,0 %),
селекцией и трансмиссией генетических элементов (Самуйленко А.Я. и соавт., 2014; Пирожков М. К., 2016; Афонюшкин В.Н. и соавт., 2017; Ленченко Е. М. и соавт., 2017; Gast R.K., 2016).
Степень разработанности темы. Снижение колонизационной
резистентности кишечника животных и адгезия бактерий, формирующих биопленки, замедляют диффузию антибактериальных препаратов, наблюдается тенденция роста множественной лекарственной устойчивости бактерий (Ленченко Е. М. и соавт., 2017; Пахомов Ю.Д., 2016; Raczkowska A., 2011; Кot B. et al., 2011). Устойчивость к антибиотикам группы пенициллинов достигает
42.4 – 57,6%; аминогликозидов – 77,8–100,0 %, фторхинолонов – 56,1 – 80,0 %,
тетрациклинов – 14,8 – 81,5 %; рифампицинов – 7,4 – 85,2 % (Пименов Н.В.,
2016; Куликовский А.В., Панин А.Н., 2017; Kumar T.S., 2015).
Для практической реализации научных достижений, в том числе,
разработки препаратов антигенной и иммуногенной активности, широкого
спектра действия, универсальных для животных разных видов и регионов,
приоритетным направлением научных изысканий, является исследование
этиологической структуры патологии животных, систематическая
идентификация микроорганизмов, оценка и управление опасными факторами, при организации контроля критических точек технологии животноводства, пищевых и биотехнологических производств.
Цель исследований: изучить этиологическую значимость факторов
вирулентности энтеробактерий, доминирующих в микробиоценозах кишечника телят и циркулирующих в животноводческих хозяйствах, для оптимизации схемы бактериологической диагностики сальмонеллеза и эшерихиоза.
Задачи исследований:
- изучить этиологическую структуру, напряженность эпизоотического
процесса, временные и географические границы распространения
сальмонеллеза и эшерихиоза при территориальном ранжировании Тамбовской
области;
- оценить эффективность диагностических и противоэпизоотических
мероприятий для предупреждения распространения возбудителей
сальмонеллеза и эшерихиоза телят;
- изучить структурно-функциональные особенности формирования
биопленок, популяционную изменчивость, патогенные свойства
энтеробактерий, доминирующих в микробиоценозах кишечника при болезнях
органов пищеварения телят;
- определить чувствительность микроорганизмов к антибактериальным
препаратам различных классов и профилей антибиотикорезистентности
бактерий различных таксономических групп.
Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность применения селективной среды, специфичность – 80,6 – 97,4 %, для оценки колонизационной резистентности кишечника телят. Установлены структурно-функциональные особенности гетерогенной структуры популяции и формирования биопленок бактерий, выявлена коррелятивная зависимость (r=0,89) показателей оптической плотности биопленок и степени адгезивности бактерий, циркулирующих в животноводческих хозяйствах при массовых болезнях органов пищеварения телят. При территориальном ранжировании Тамбовской области установлена напряженность эпизоотического процесса, характеризующаяся тенденцией возрастания индекса эпизоотичности (1,0), коэффициента очаговости (18,97), летальности (100,0 %); массовая доля сальмонеллеза – 8,1–14,9 %; эшерихиоза – 83,1 – 97,9 %; этиологическая структура: S.dublin (9,5 %); S.typhimurium (1,7 %); S.enteritidis (1,5 %); E. coli (52,8 %): О86:А20; О26:А20; О86:F41; О20:К99; О9:А20; О26:F41; О78:К99; О119:А20.
Теоретическая и практическая значимость работы. Апробирован
алгоритм определения профилей устойчивости к антибиотикам эпизоотических
штаммов с определением корреляции результатов тестов (r=0,87 – 0,90), для
проведения мониторинга распространения антибиотикорезистентных
микроорганизмов; 55,8 – 77,3 % штаммов, циркулирующих среди поголовья
животных и объектов репродукторных помещений, были устойчивы к
полусинтетическим пенициллинам и цефалоспоринам III поколения за счет
продукции -лактамаз расширенного спектра, обусловливающих тенденцию
роста множественной лекарственной резистентности. Разработаны
«Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации болезней органов
пищеварения телят, вызываемых патогенными энтеробактериями»,
утвержденные УМО РАЕ по классическому университетскому и техническому образованию.
Методология и методы исследования. При апробации методов
исследования и анализе результатов репрезентативных выборок
животноводческих объектов, соблюдая принципы рандомизации, учитывали
критерии, имеющие эпизоотологическое значение, временные и
географические границы распространения инфекционной патологии телят.
Методологические подходы основаны на применении многоуровневых алгоритмов диагностики с использованием комплекса бактериологических, биохимических, иммунохимических тестов, применяемых в виде микроанализа, электронно-микроскопических, морфометрических, и статистических методов.
Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты изучения этиологической структуры, многолетней
динамики показателей напряженность эпизоотического процесса, факторов
риска, временных и географических границ распространения сальмонеллеза и
эшерихиоза, и оценки эффективности диагностических и
противоэпизоотических мероприятий, направленных на предупреждение
распространения возбудителей инфекционных болезней среди восприимчивых
животных, объектов внешней среды репродукторных помещений, пищевого
сырья;
- результаты изучения адаптационного потенциала, структурно-
функциональных особенностей формирования биопленок и процессов
диссоциации однородной популяции энтеробактерий;
- результаты изучения профилей антибиотикорезистентности, продукции
-лактамаз расширенного спектра бактерий различных таксономических групп,
циркулирующих в животноводческих хозяйствах среди поголовья животных и
объектов репродукторных помещений при болезнях органов пищеварения
телят.
Апробация материалов диссертации. Результаты диссертационной
работы доложены и одобрены на заседании кафедры «Ветеринарная медицина»
ФГБОУ ВО МГУПП; Международной научно-практической конференции
«Разработка инновационных инструментальных методов исследования
внутренних болезней животных» (М., 2015); Международной научной
конференции «Научные основы производства и обеспечения качества
биологических препаратов для АПК (М., 2016); Международной научно-практической конференции «Развитие пищевой и перерабатывающей промышленности России: кадры и наука» (Москва, 2017).
Публикация результатов исследований. По материалам
диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в т. ч. 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложений; изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 39 рисунков. Библиографический список включает 207 источников, из них 91 иностранных автора.
Особенности формирования биопленок бактерий при болезнях органов пищеварения телят
Микрофлора желудочно-кишечного тракта телят представлена молочнокислыми, пропионовокислыми бактериями, бифидобактериями, эшерихиями, энтерококками, стрептококками, клостридиями, микроскопическими грибами, при нарушении эволюционно сложившихся микробиоценозов отмечается преобладание потенциально-патогенных микроорганизмов (Herrera-Luna C. et al., 2009). Изменение состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушение секреции поджелудочного и кишечного соков, желчи, процессов всасывания и выделения, а также синтеза иммуноглобулинов класса А (IgA) являются предрасполагающими факторами при развитии патологий системы органов пищеварения телят (Кot B. et al., 2012; Alugongo G.M. et al., 2017). Широкое распространение микроорганизмов в природе и способность к колонизации различных экологических ниш связаны с особенностями метаболизма (например, получение энергии из неорганических соединений), строением генома и принципами реализации генетической информации (гаплоидный набор хромосом, обеспечивающий проявление и быстрое закрепление мутаций в первой генерации), а также способностью осуществлять межклеточную коммуникацию и формировать сложные сообщества – биоплёнки (Abidi Syed H. et al., 2014). Реализация и передача факторов вирулентности наиболее эффективно происходит биопленках, формирующихся на границе раздела фаз в виде сложных по химическому и видовому составу трёхмерных структур как на различных субстратах, так и в макроорганизме (Alexander S.A. et al., 2017).
В составе биоплёнок различают два компонента – биомасса клеток и экзополисахаридный матрикс, равномерно покрывающий прикреплённые к поверхности субстрата клетки (Ленченко Е.М., 2017; Maya-Hoyos M. et al., 2015; Rossi E. et al., 2017). В зависимости видового состава микроорганизмов различают моновидовые и поливидовые биопленки.
Моновидовые биоплёнки представлены одним видом микроорганизмов, в природных условиях встречаются редко и формируются некоторыми патогенными микроорганизмами в органах и тканях макроорганизма, которые в норме являются стерильными, например, биоплёнки бактерий P.aeruginosa, формируемые в лёгких (Павлова И.Б. и соавт., 2016; Schaake J. et al., 2013; Scott J.Р., 2014). Большинство биоплёнок, формирующихся в окружающей среде, относится к поливидовым и состоит из нескольких видов микроорганизмов – бактерий, дрожжевых и плесневых грибов (Романова Ю.М., 2015; Кot B. et al., 2012; Rossi E. et al., 2017).
Биополимеры матрикса – экзополисахариды, составляющие 50,0 – 90,0 % общей сухой массы веществ, полисахаридные компоненты представлены гомополисахаридами, например, целлюлоза бактерий S. typhimurium, или гетерополисахаридами – жирные кислоты бактерий E. coli (Johansen T.B. et al., 2009; Kumar T.S. et al., 2015).
Формирование биопленок бактерий in vivo в тонком отделе кишечника (КОЕ – 103 – 108 клеток в 1,0 мл содержимого) осложняется за счет синтеза антибактериальных пептидов и способности дендритных клеток фагоцитировать микроорганизмы, при этом контакт бактериальных клеток и клеток макроорганизма обусловлен формированием прерывистого тонкого слоя слизи, покрывающего ворсинки (Johansen T.B. et al., 2009). В толстом отделе кишечника (КОЕ 1012 клеток в 1,0 мл содержимого) выявлено формирование двух слоев слизи: нижнего, препятствующего контакту бактериальных клеток и клеток макроорганизма, и верхнего, являющегося субстратом для адгезии микроорганизмов. Компоненты матрикса являются резервными источниками биогенных элементов, что позволяет клеткам существовать в условиях сокращающегося притока питательных веществ (El Mouali Y., et al., 2017). Структурная и пространственная организация бактерий в биопленках обеспечивается за счет синтезируемого клетками экзополисахаридного матрикса, состоящего из полисахаридов, структурных белков, экзоферментов, нуклеиновых кислот (рис. 2, 3).
Белки матрикса подразделяются на две группы: структурные белки и экзоферменты. Структурные белки (например, глюкансодержащий белок бактерий S. mutans) обеспечивают стабилизацию и поддержание структуры биоплёнки, формирование полисахаридных сетей (Martn-Rodrguez A.J. et al., 2017).
Процессы адгезии к абиотическим поверхностям и клеткам живых организмов осуществляются за счет амилоидов, представленных упорядоченными белковыми молекулами, формирующими жгутики, фимбрии, пили, которые обеспечивают взаимодействие клеток с компонентами матрикса (Biaas N. et al., 2012). Бактерии S. typhimurium, E. coli синтезируют тонкие аггрегативные фимбрии и целлюлозу, что способствует быстрому формированию ригидного гидрофобного матрикса (Biyashev K.B. et al., 2016).
Экзоферменты матрикса разрушают водорастворимые компоненты (полисахариды, нуклеиновые кислоты, белки) и некоторые водонерастворимые полимеры (целлюлоза, хитин, липиды) с образованием низкомолекулярных продуктов, которые используются клетками в качестве источника углерода и энергии. Липиды биопленок (в частности, группа липидов бактерий S. marcescens – серраветины) обладают поверхностно-активными свойствами, разрушают и повышают биодоступность гидрофобных соединений, обеспечивают агрегацию клеток, формирование зрелых биоплёнок, регулируют газообмен путём предотвращения колонизации матричных пустот, регулируют численность популяции клеток, обладают свойствами гемолизинов (Sugano M. et al., 2016).
Динамика процесса формирования биопленок включает пять стадий: адгезия, формирование монослоя, формирование микроколоний, зрелая биопленка, разрушение (дисперсия). Адгезия – процесс перехода от подвижного к прикреплённому способу существования, что сопровождается седиментацией и последующим закреплением клеток на поверхности. Адгезия бактерий E.coli осуществляется с помошью фимбрий I типа, которые, в отличие от сокращающихся фимбрий IV типа P. aeruginosa, не обеспечивают поверхностное движение и не участвуют в стадии формирования микроколоний.
Другим компонентом, обеспечивающим адгезию бактериальных клеток к субстрату, является липополисахарид (ЛПС). Установлено, что снижение синтеза ЛПС бактериями E.coli приводит к нарушению образования жгутиков и фимбрий I типа и снижению эффективности процесса адгезии (Uliczka F.et al., 2011). На завершающих этапах адгезия осуществляется с участием стабилизирующих факторов, чаще всего представленных белками или полисахаридами. Стабилизирующим фактором бактерий E.coli является белок белок-агглютинин внешней мембраны, обеспечивающий стабилизацию адгезированных клеток на поверхности, а также формирование межклеточных связей. Процесс адгезии микроорганизмов к субстрату завершается формированием на поверхности монослоя клеток, который впоследствии подвергается реорганизации и реструктурированию с формированием структурно-функциональных единиц биоплёнки – микроколоний (коаггрегация). По мере созревания микроколоний часть клеток мигрирует из глубинных слоёв зрелых микрколоний в свободное пространство, формируя вторичные микроколонии, связанные с первичными. Процессы коагрегации реализуются за счет коаггрегативных адгезинов – группа сложных белков, различающиеся по химической структуре (Raczkowska A. et al., 2011).
Коаггрегациия клеток в микроколонии завершается формированием зрелой биоплёнки. В процессе созревания выделяют две стадии: синтез компонентов матрикса и формирование архитектоники биоплёнки. Синтез компонентов матрикса может начинаться на ранних этапах формирования биоплёнки, например, бактерии P. aeruginosa синтезируют альгинат при формировании первичных микроколоний (Singh S. et al., 2017). Поддержание архитектоники биоплёнки обусловлено межклеточной коммуникацией микроорганизмов, а также наличием сетей матрикса. Нарушение биосинтеза некоторых компонентов матрикса приводит к нарушению архитектоники биоплёнки. Так, штаммы E.coli, не синтезирующие колановую кислоту, не способны формировать биоплёнки со сложной архитектоникой (Cimdins A. et al., 2017).
Существование биоплёнки завершается разрушением (дисперсией), приводящим к гибели клеток, составлявших биоплёнку, и появлению свободноживущих клеток, способных к формированию новых биоплёнок (Павлова И.Б.. 2016).
Методы изучения патогенных свойств бактерий
При изучении факторов вирулентности и признаков бактерий, связанных с плазмидой вирулентности, применяли общепринятые методы.
Для идентификации бактерий, не типируемых по О-антигену, проводили внутрибрюшинное заражение белых беспородных мышей массой 14,0–16,0 г по 0,5 см3 взвесью микроорганизмов в концентрации 1 млрд/см3 бактериальных клеток. Для изучения токсигенных свойств микроорганизмы культивировали в жидкой среде Хоттингера при 37С, иерсинии – при 22 С в течение 24 ч. Культуры микроорганизмов центрифугировали при 6000 об\мин 20 мин, надосадочную жидкость использовали для определения наличия токсина – опыт; жидкая среда Хоттингера – контроль. Наличие токсинов определяли, учитывая достоверность разности отека лап белых лабораторных мышей (oedema) – «эдематозный тест»; массы тонкого кишечника с содержимым к массе тела – тест «дилатация кишечника»; разность массы легких опытных и контрольных животных – тест «проницаемость сосудов» (Биргер М.О., 1982; Светоч Э.А. 1992; Ленченко Е.М., 2014).
Определение D-маннозорезистентной активности бактерий проводили в реакции гемагглютинации в полистироловых планшетах при внесении в лунки суспензии исследуемых культур микроорганизмов, содержащих 109 кл /мл, 3,0 % взвеси эритроцитов барана и 1,5% D-маннозы, компоненты перемешивали покачиванием планшета и выдерживали при 37С в течение 30 – 60 мин.
Результаты оценивали в крестах: «++++» – 100,0 % эритроцитов агглютинированы, равномерно покрывают дно лунок; «+++» – 75,0 % эритроцитов агглютинированы, сформировано малозаметное кольцо осевших неагглютинированных эритроцитов; «++» или «+» – 25,0 – 50,0 % эритроцитов агглютинированы, заметен осадок неагглюинированных эритроцитов в виде кольца; «–» – эритроциты не склеены, оседают на дно лунок в виде кольца с ровными краями или компактного осадка. При наличии торможения агглютинации в присутствии D-маннозы реакцию гемагглютинации оценивали как маннозочувствительную, при отсутствии торможения –маннозорезистентную гемагглютинацию (Скородумов Д.И. и соавт., 2008).
Для выявления продукции гемолизинов исследуемые культуры микроорганизмы засевали в чашки Петри с 5,0 % кровяным агаром и культивировали при 37 С 24 ч. При наличии гемолизинов, диффундирующих в питательной среде и вызывающих лизис эритроцитов, выявляли светло-желтые, прозрачные, четко очерченные (-гемолиз) или полупрозрачные зеленоватые (-гемолиз) зоны вокруг колоний. При определении гемолитической активности посевом в 1,0 ...5,0 % кровяной бульон отмечали просветление среды за счет лизиса эритроцитов. Тиолзависимые гемолизины выявляли посевом на 5,0 % кровяной агар, содержащий 0,002 % L-цистеина, результаты учитывали через 24 – 48 часов. Энтерогемолитическую активность бактерий E.coli, P. vulgaris определяли на кровяном агаре, содержащем 5,0 мл дефибринированной крови барана и 10,0 М CaCl2. Культуры микрооганизмов высевали в одном секторе чашки Петри вертикальным и горизонтальным штрихами, в другом – в виде креста, культивировали при 37 С в течение 24 часов. Формирование вокруг колоний зон двойного гемолиза указывало на продукцию энтерогемолизинов (Габидуллин Ю.З., 2014).
Гемолитическую активность бактерий считали высокой при формировании зон гемолиза d= 5,0 – 8,0 мм, средней – d= 3,0–5,0 мм, слабой – 1,0–3,0 мм, отрицательной – при отсутствии зон гемолиза.
Для выявления бактериофагов в сточных водах животноводческих хозяйств исследуемый материал фильтровали через фильтр Зейтца и вносили в пробирки, содержащие 18 – 24-часовые культуры микроорганизмов, культивировали при 30 – 35С в течение 24 ч. При наличии бактериофагов выявляли просветление среды. Для определения литической активности бактериофагов в бактериологические пробирки вносили по 4,5 мл МПБ, в 1-ю пробирку – 0,5 мл суспензии исследуемых бактериофагов, после чего готовили десятикратные разведения 10-1 – 10 -10 и добавляли по капле 24-часовых чувствительных культур микроорганизмов, культивировали при 37С 24 ч. Титр бактериофагов определяли как максимальное разведение, вызывающее лизи бактерий; бактериофаги считали активными при установлении титра 10-7 – 10 -8.
При нанесении капель бактериофагов на чувствительные культуры микроорганизмов, засеянные «газоном» на МПА, оценивали наличие зон лизиса.
Методы изучения наличия бактериоцинов. Наличие бактериоцинов определяли культивированием на твердых питательных средах – диффузии в агар (методы «штриховой посев», «агаровые блочки», «мембранные фильтры») и жидких питательных средах – «серийные разведения», «микрокультура», «наслоение».
«Штриховой посев». Экспоненциальные культуры микроорганизмов высевали штрихом поверхность плотных питательных сред и культивировали при 30 – 37 С в течение 24 – 48 ч для продукции и диффузии биологически активных веществ, затем перпендикулярно штриху исследуемых культур микроорганизмов подсевали тест-культуры микроорганизмов и культивировали при условиях, благоприятных для роста тест-штаммов. Наличие и степень антагонистической активности оценивали по величине зоны задержки роста тест штаммов. На одной чашке Петри культивировали несколько тест-культур микроорганизмов в аэробных условиях или в анаэростате. При изучении антагонистической активности лактобактерий для исключения воздействия молочной кислоты и снижения рН на исследуемые микроорганизмы в агаровые среды вносили буферные соли (СН3СООNa, NaНСО3). Чувствительные тест культуры микроорганизмов растут вдали от штриха штаммов-антагонистов, нечувствительные микроорганизмы – в непосредственной близости от штрихов.
«Агаровые блочки». Исследуемые штаммы микроорганизмов засевали на поверхность плотных сред в чашки Петри «газоном», распределяя по 0,1–0,2 мл суспензии бактерий шпателем по поверхности сред (метод Коха), культивировали при 30 – 37 С в течение 24 – 48, затем стерильным пробочным сверлом (d=6,0–8,0 мм) из слоя среды вырезали агаровые блоки и переносили на поверхность среды, засеянной шпателем, методом глубинного посева или на поверхность двухслойного агара (15 см3 расплавленного 2,0 % агара – нижний слой, 5 см3 0,35 % агара, содержащего тест-культуры микроорганизмов – верхний слой, что обеспечивает равномерное распределение по всей поверхности чашки). Агаровые блоки размещали на равном расстоянии друг от друга и от краев чашки, плотно прижимая к поверхности среды. На одной чашке Петри размещали 4–6 агаровых блочков. Чашки Петри выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре для диффузии биологически активных веществ в агар, затем культивировали при 37 С 18–24 ч. Если биологически активные вещества, продуцируемые микроорганизмами, подавляли развитие тест штаммов, то вокруг агаровых блочков формировались зоны задержки роста.
«Мембранные фильтры». Изучаемые культуры микроорганизмов в количестве 0,5 мкл и концентрации 107–108 кл/мл наносили в виде капли в центр мембранного фильтра, помещенного на поверхность плотной питательной среды, и культивировали при оптимальных для данного микроорганизма условиях. Затем мембранные фильтры удаляли с поверхности плотной питательной среды и на то же место помещали новые мембранные фильтры, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых тест-штаммов патогенных бактерий в той же концентрации; контроль – рост культур, не подвергшихся воздействию БАВ. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявлялся рост культуры бактерий в виде пятен различной плотности и величины.
«Серийные разведения». Исследуемые культуры микроорганизмов культивировали в жидких питательных средах при 37 С в течение 24 – 48 ч, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин для получения культуральной жидкости, содержащей биологически активные вещества. Тест-штаммы микроорганизмов культивировали в оптимальной жидкой питательной среде с добавлением бесклеточной культуральной жидкости исследуемых штаммов-антагонистов (опыт) и в МПБ (контроль).
Результаты эпизоотологических и клинико-морфологических исследований болезней органов пищеварения телят
Анализ эпизоотической ситуации в животноводческих хозяйствах Тамбовской области свидетельствует, что удельный вес болезней бактериальной этиологии за 2011 – 2016 годы составляет 85,2 – 94,1 %; массовая доля сальмонеллеза – 8,1–14,9 %; эшерихиоз – 83,1 – 97,9 %.
При определении широты распространения по распределению административно-территориальных единиц установили, что удельный вес неблагополучных пунктов составляет 36,97 – 63,27 %, удельный вес больных животных – 61,28 – 75,72 % (рис. 11).
Формирование сопряженных очагов обусловлено природными и хозяйственно-экономическими факторами специализированных хозяйств, в структуре деятельности которых удельный вес крупного рогатого скота составляет не менее 66,6 - 75,0 %.
Оценка факторов эпизоотологического риска выявила избыточную заболеваемость, относительный риск - 0,098; степень отношения между воздействием фактора риска и заболеваемостью - непосредственный риск - 0,93. Учитывая отношение числа лет, в течение которых на данной территории регистрировались вспышки болезней, к общему числу лет в исследуемом периоде, установили возрастание показателей индекса эпизоотичности: 0,2- 2011 год; 0,3 -2012; 0,6 - 2013; 0,6- 2014; 0,7- 2015; 1,0 - 2016.
При учете интенсивных показателей напряженности эпизоотического процесса выявлено возрастание показателей заболеваемости, смертности, летальности, инцидентности, превалентности (табл. 6).
Формирование стационарных очагов, в которых вспышки болезней повторялись через различные промежутки времени, связано с сохранением условий, обеспечивающих циркуляцию эпизоотических штаммов S.dublin, S.typhimurium, S.enteritidis; E.coli K99 – 7,75 %; K99:А20–6,44 %; K99:F41– 3,80 %; F41:А20 – 2,17 %, продуцирующих адгезивные антигены, токсины, гемолизины, бактериоцины.
Контаминированные объекты территории хозяйства, конструкции помещений, корма, канализационные лотки способствуют распространению микроорганизмов в окружающей среде.
В хозяйствах с промышленной технологией кормления и содержания животных по интенсивности эпизоотического процесса энзоотии проявлялись в виде спорадической заболеваемости – единичные случаи проявления болезней в связи с наличием единого источника возбудителя инфекции. В частности, удельный вес крупного рогатого скота составляет 75,4 % (рис. 12).
Удельный вес болезней органов пищеварения, являющихся наиболее распространенными из числа общей патологии, составляет 85,2 – 94,1 %, заболеваемость телят до 10-суточного возраста – 60,7 – 71,2 %. Наблюдалась прямая коррелятивная зависимость (r=0,86) между распространенностью болезней органов размножения маток – 34,54% и болезнями органов пищеварения и дыхания, составляющими 26,76 % и 64,98 %, соответственно (рис. 14).
При остром течении болезней органов пищеварения наблюдалась депрессия, сменяющая возбуждением, судорогами, парезами и параличами конечностей, слабостью, адинамией, нарушением сердечной деятельности, учащенным и поверхностным дыханием, интоксикацией.
При подостром и хроническом течении инфекционного процесса, как правило, наблюдали диарею, дегидратацию, истощение, отеки подкожной клетчатки, конъюнктивиты, артриты. Глаза животных запавшие, сухой нос, наблюдается отсутствие аппетита, фекалии желто-серого цвета, жидкие с наличием пузырьков и комочков, конечности холодные, тело дрожит, кожа теряет чувствительность (рис. 15).
Многочисленные кровоизлияния выявляли на эпи- и эндокарде, ткань легких серо-белого цвета, с участками темно-красного, серо-красного или серого цвета.
Некротизированная ткань легких представлена бесструктурной массой, содержащей фибрин, глыбки хроматина и клетки микроорганизмов, выявляли скопления лейкоцитов, гистиоцитов, плазматических клеток между альвеолоцитами, сосуды подслизистого слоя инъецированы, тромбированы. Наблюдали признаки катарально-геморрагического воспаления легких, слизистая оболочка трахеи, бронхов была отечной, гиперемированной, с кровоизлияниями, обильно покрыта слизью, фибринозными пленками, выявлялись некротические участки (рис. 16).
Наблюдали катарально-геморрагическое воспаление желудочно кишечного тракта. Слизистая оболочка сычуга, тонкого отдела, илеоцекального клапана, толстого кишечника отечная, гиперемированная, с кровоизлияниями, покрыта слизью, фибринозными пленками, с некротическими участками, некротизированная ткань представлена бесструктурной массой, содержащей фибрин, глыбки хроматина и клетки микроорганизмов. Выявляли скопления лейкоцитов, гистиоцитов, плазматических клеток между криптами, сосуды подслизистого слоя инъецированы, тромбированы (рис.17).
В тканях и органах иммунной системы выявляли диссеминированный тромбоз, периваскулярный отек, признаки макрофагальных реакций, застойной гиперемии. Как правило, развивались признаки гиперплазии лимфатических узлов, пейеровы бляшки и солитарные фолликулы набухшие, серо-красного цвета. Мезентериальные и брыжеечные лимфатические узлы на разрезе серо-красного, темно-вишневого цвета, с точечными кровоизлияниями; между корковой и мозговой зоной не выявляли четко очерченных границ. Корковое вещество имело темную окраску, обнаруживались близкорасположенные лимфоциты, объем ядра преобладал над объемом цитоплазмы. Мозговое вещество светлое, лимфоциты имели бобовидные ядра и широкий ободок цитоплазмы, в строме участки разрежения, а также скопления плазматических клеток (рис. 18, 19).
При развитии признаков гиперплазии селезенки (см. рис. 19), в белой и красной пульпе органа выявляли диссеминированный тромбоз, периваскулярный отек, признаки макрофагальных реакций, застойной гиперемии.
Заключение. На основании анализа географических и временных границ распространения инфекционной патологии телят установили, что за 2011 – 2016 год удельный вес болезней бактериальной этиологии составляет 85,2 – 94,1 %; массовая доля сальмонеллеза – 8,1–14,9 %; эшерихиоза – 83,1 – 97,9 %. При учете расположения неблагополучных пунктов, установили тенденцию возрастания: индекса эпизоотичности – 1,0; коэффициента очаговости – 18, 97; летальности – 100,0 %, что свидетельствует об активизации эпизоотического процесса, возможности возникновения новых случаев болезней, угрозе формирования энзоотичной зоны и снижении эффективности диагностических и противоэпизоотических мероприятий. Развивались признаки гиперплазии селезенки, лимфатических узлов, пейеровы бляшки и солитарные фолликулы набухшие, серо-красного цвета.
Результаты изучения патогенных свойств и фенотипических признаков энтеробактерий, связанных с плазмидами вирулентности
При идентификации бактерий, не типируемых по О-антигену, установили, что 84,9 % изолятов были патогенными.
Штаммы S.typhimurium, E.coliО138:K81, K.pneumoniae, P.vulgaris, Y.enterocolitica S-форма продуцировали термостабильные токсины (61,3 %).
Показатели коэффициента средних величинотек лап мышей (К40,0) колебались в пределах от 40,12±2,90 до 69,17±5,42.
Средние показатели коэффициента расширения кишечника (К0,090) – от 0,106±0,003 до 0,123±0,005, коэффициент проницаемости кровеносных сосудов (К1,07) – 1,07±0,12 – 1,29±0,17. Штаммы E. coli, P.vulgaris продуцировали термолабильные токсины (23,5 %).
Из числа изученных микроорганизмов 12,8 % продуцировали и термостабильные и термолабильные токсины, E.coli – цитотоксины, 54,8 % (рис. 31, 32).
При внесении суспензии патматериала телят в лунки микропланшета тест-системы «VET-RPLA», основанной на реакции обратной пассивной латекс-агглютинации, выявляли агрегаты латексных частиц, что позволяло в составе комплекса дифференциальной диагностики проводить индикацию токсинов с чувствительностью 100 мг в течение 15 - 20 мин.
Выявлена коррелятивная зависимость токсигенных свойств и D-маннозорезистентной активности энтеробактерий: при добавлении к взвеси эритроцитов крупного рогатого скота суспензии изучаемых штаммов и 1,5 % D-маннозы отмечали агрегацию эритроцитов (рис. 30, б). Бактерии продуцировали
- Я.со//(61,6 %) - а-, -гемолизины;
- K.pneumoniae(73,4 %) - а-гемолизины;
- P.vulgans (58,9%) - -гемолизины
Тиолзависимые гемолизины продуцировали:
- Бактерии E.coli(45,5%);
- C.freundn(52,0 %)
При воздействии бактериоцинов колонии тест-штаммов выявляли на поверхности мембранных фильтров в виде пятен различного диаметра (d - 1,0 -3,0 мм). Показатели оптической плотности составляли D = 0,109 - 0,134 (опыт); D=0,507 - 0,744 (контроль). Зоны задержки роста бактерий составляли 4,0 - 11,0 мм (рис. 33).
При апробации способа «наслоения» в пробирки, содержащие 0,3 мл среды и 90,0 мл гумивита, высевали 10,0 мкл суспензии исследуемых штаммов, содержащих 5106 м клеток в 1,0 мл, культивировали при 37С 96 часов, затем прогревали при 100С в течение 5 минут. На поверхность среды наслаивали 1,0 мл среды с добавлением гумивита и культивировали 18 – 20 часов, затем высевали 10,0 мкл суспензии индикаторных штаммов, культивировали 37С в течение 3 суток. Исследуемые штаммы E. coli ингибировали рост указанных выше энтеробактерий,зоны задержки роста – 6,7 – 10,1 мм. Вместе с тем энтеробактерии не вызывали зоны задержки роста псевдомонад, стафилококков, микобактерий (рис. 34).
Наличие бактериофагов в опытах с фильтратами исследуемого материала сопровождалось просветлением жидких питательных сред; на плотных питательных средах отмечали прозрачные зоны лизиса с прозрачным центром, ореолом частичного просветления и ровными краями, количество негативных колоний составило 7,1x107–1,2x108. Оценивая литическую активность бактериофагов методом серийных разведений установили, что лизис исследуемых культур микроорганизмов наблюдался в разведениях 10-6 – 10-5 (рис. 35).
Выявляли несколько типов негативных колоний:
- колонии с прозрачным центром, окруженным зоной неполного лизиса, d=0,6 - 0,8 мм;
- колонии прозрачные, d=1,2 - 1,4 мм, зоны лизиса не наблюдались;
- колонии прозрачные, окруженные зонами неполного лизиса, d=0,4 -0,6 мм;
- колонии прозрачные без зон лизиса; d=0,l - 0,3 мм;
- колонии с прозрачным центром, окруженные зонами неполного лизиса, d=0,8 - 1,1 мм.
Наличие аутоагглютинации - характерный признак иерсиний, при 37 C отмечали образование рыхлого хлопьевидного осадка, при 22 - 28 C небольшой компактный осадок. При нанесении на поверхность среды, содержащей пиразинкарбоксиамид, 1,0%-ного водного раствора железистого сульфата аммония иерсинии, не дезаминирующие пиразинамид до пиразиновой кислоты, не изменяли цвет колоний. При 37С иерсинии формировали на поверхности кальцийдефицитной среды выпуклые, прозрачные, зернистые, колонии в 1,5 - 3,0 раза мельче колоний, выросших при 22 С, td 4,6; р=0,01.
Заключение. Из числа изученных микроорганизмов 12,8 % продуцировали и термостабильные и термолабильные токсины, E.coli - цитотоксины, 54,8 %. При изучении фенотипических признаков, связанных с плазмидами вирулентности, энтеробактерий установлено, что бактерии Е. Coli (61,6 %) продуцировали а-,р гемолизины; Klebsiella pneumoniae (73,4 %) а-гемолизины; P.vulgaris (58,9%) - -гемолизины; колицины, продуцируемые бактериями , coli, ингибировали рост бактерий S.enteritidis, C.fremdii, Y.enterocolitica, (d - 1,0 - 3,0 мм), показатели оптической плотности D = 0,109 - 0,134 (опыт); D=0,507 - 0,744 (контроль).