Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
Актуальность темы 5
Степень разработанности темы 7
Цель и задачи исследования 7
Научная новизна исследований 8
Теоретическая и практическая значимость 8
Методология и методы исследования 9
Основные положения диссертации, выносимые на защиту : 10
Степень достоверности и апробация материалов исследований 10
Публикация результатов исследований 11
Объем и структура диссертации 11
2.Обзор литературы 12
2.1. История изучения пролиферативной энтеропатии у свиней 12
2.2. Морфологическая, культуральная и физико – химическая характеристика Lawsonia intracellularis 15
2.3. Классификация бактерии Lawsonia intracellularis 16
2.4. Эпизоотология пролиферативной энтеропатии у свиней 17
2.5. Патогенез пролиферативной энтеропатии у свиней 23
2.6. Некоторые аспекты резистентности организма при пролиферативной энтеропатии 27
2.7. Клиническое течение и патоморфологическое проявление пролиферативной энтеропатии у свиней 29
2.8. Диагностика пролиферативной энтеропатии у свиней 33
2.8.1.Методы прямого обнаружения Lawsonia intracellularis 35
2.8.2. Методы выявления антигенов Lawsonia intracellularis 36
2.8.3.Серологическая диагностика Lawsonia intracellularis 36
2.8.4. Молекулярно-генетические методы 38
2.9.Способы коррекции пролиферативной энтеропатии у свиней в хозяйстве 39
2.9.2. Применение антибиотиков для контроля пролиферативной энтеропатии свиней 41
2.9.3. Вакцинопрофилактика пролиферативной энтеропатии у свиней 44
Заключение по обзору литературы 45
3.Собственные исследования 46
3.1. Материалы и методы 46
4.1. Состояние свиноводческой отрасли Омской области в период с 2009 по 2013 гг. 50
4.2. Эпизоотологическая ситуация в Омской области по бактериальным и вирусным инфекциям свиней 51
4.3. Ретроспективный анализ падежа свиней по причине патологии органов пищеварения 59
4.4. Серологический мониторинг поголовья животных свиноводческих хозяйств Омской и Тюменской областей на предмет циркуляции в них Lawsonia intracellularis 63
4.5. Изучение клинического проявления инфекционного процесса, обусловленного Lawsonia intracellularis у свиней в хозяйствах Омской и Тюменской областей
4.5.1. Клинические проявления пролиферативной энтеропатии свиней 72
4.5.2. Патоморфологические изменения в органах свиней при пролиферативной энтеропатии 76
4.6. Обнаружение нуклеиновой кислоты Lawsonia intracellularis в пробах из пораженных участков тонкого кишечника свиней с субклинической и клинической формами пролиферативной энтеропатии 81
4.7.Опыт применения вакцины Энтеризол Илеитис как средства этиотропной вакцинопрофилактики пролиферативной энтеропатии свиней 82
4.8. Расчет экономической эффективности применения специфической вакцинопрофилактики для коррекции пролиферативной энтеропатии у свиней 91
4.9. Схема контроля пролиферативной энтеропатии у свиней на свиноводческих предприятиях различной производственной интенсивности 92
4.10. Практическое применение разработанной схемы контроля пролиферативной энтеропатии свиней на свинокомплексе 96
5. Заключение 98
6. Выводы 107
7. Практические предложения 109
8. Список сокращений: 111
9. Список литературы 112
- Основные положения диссертации, выносимые на защиту
- Морфологическая, культуральная и физико – химическая характеристика Lawsonia intracellularis
- Эпизоотологическая ситуация в Омской области по бактериальным и вирусным инфекциям свиней
- Практическое применение разработанной схемы контроля пролиферативной энтеропатии свиней на свинокомплексе
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Получены новые данные о состоянии свиноводческой отрасли Омской области и о наиболее часто регистрируемых инфекционных болезнях свиней на ее территории, а также о причинах их падежа, в том числе от поражения органов пищеварения.
Впервые в России проведен серологический мониторинг поголовья животных свиноводческих хозяйств, находящихся на территории Уральского и Сибирского Федеральных округов, на предмет циркуляции L. intracellularis.
В эксперименте изучены протективные свойства коммерческой вакцины Энтеризол Илеитис в условиях свиноводческого хозяйства и проведен расчет экономической эффективности специальных мероприятий по профилактике энтеропатии свиней с использованием данной вакцины.
Разработан комплексный метод контроля инфекции, вызванной L.intracellularis в хозяйствах с различной производственной мощностью. Теоретическая и практическая значимость Полученные данные позволяют дополнить новыми сведениями вопросы этиологии и патогенеза пролиферативной энтеропатии свиней применительно к региональным условиям.
Результаты экспериментальных исследований служат основой для разработки методов контроля пролиферативной энтеропатии свиней, обусловленной L.intracellularis. Разработаны методические рекомендации «Контроль пролиферативной энтеропатии свиней» (Омск, 2015), утвержденные Ученым советом Института ветеринарной медицины и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина» (протокол № 7 от 16 апреля 2015 г.), на научно-техническом совете Омского государственного аграрного университета имени П.А. Столыпина (протокол № 4 от 28 апреля 2015 г.).
Материал, представленный в диссертационой работе, может быть использован при составлении соответствующих разделов учебников, руководств по ветеринарной микробиологии и эпизоотологии. Методология и методы исследования Методология исследований основана на анализе и синтезе информации по проблеме пролиферативной энтеропатии у свиней, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной цели был осуществлен анализ эпизоотической обстановки по желудочно-кишечным инфекциям в Омской области, а также проведен серологический мониторинг поголовья животных свиноводческих хозяйств, находящихся на территории Омской и Тюменской областей, на предмет циркуляции L.intracellularis.
В работе использованы следующие методы исследований: эпизоотологические, клинические, патологоанатомические и лабораторные (ИФА, ПЦР). Предложенная схема контроля пролиферативной энтеропатии свиней, вызванной L.intracellularis, нашла свое применение на свинокомплексе ООО "Согласие" (Заводоуковский район, Тюменская область). Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Степень распространения энтеропатий у свиней в свиноводческих хозяйствах Омской и Тюменской областей на основании серологического мониторинга. Роль инфекционной патологии, вызванной L. intracellularis в структуре заболеваемости и падежа свиней; 2. Особенности течения пролиферативной энтеропатии у свиней в хозяйствах региона; 3. Методы контроля пролиферативной энтеропатии свиней в хозяйствах с различной производственной интенсивностью и оценка экономической эффективности предложенной схемы профилактики болезни, обусловленной L. intracellularis, на примере свинокомплекса ООО "Согласие" Тюменской области. Степень достоверности и апробация материалов исследований При выполнении исследований были использованы современные методы, принятые при проведении научно-исследовательской работы. Цифровой материал подвергался статистической обработке на персональном компьютере по общепринятым методам вариационной статистики с использованием программы Microsoft Exel.
Отдельные положения диссертационной работы используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по дисциплинам: эпизоотология и инфекционные болезни животных, ветеринарная микробиология и иммунология на факультете ветеринарной медицины в ФГБОУ ВПО Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина; ФГБОУ ВО Башкирский государственный аграрный университет; ФГБОУ ВПО Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. академика Д.Н. Прянишникова; ФГБОУ ВПО ГАУ Северного Зауралья; ФГБОУ ВПО Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана; ФГБОУ ВПО Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова; ФГБОУ ВПО Красноярский государственный аграрный университет; ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина; ФГБОУ ВО Алтайский государственный аграрный университет.
Материалы диссертационной работы обсуждены и доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Инновации молодых ученых аграрных вузов – агропромышленному комплексу Сибирского региона» (Омск, 2011 г.); научно - практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири» (Улан-Удэ, 2013 г.).
Морфологическая, культуральная и физико – химическая характеристика Lawsonia intracellularis
С установлением факта обнаружения нового возбудителя начались работы по изучению его морфологических, культуральных и физико-химических свойств с целью последующей классификации данного микроорганизма.
Rowland A.S., Lawson G.H. (1992) при модифицированной окраске по Циль-Нильсену определили, что L. intracellularis является Грамотрицательной бактерией.
В 1995 году McOrist S., Gebhart C.J., описали морфологию возбудителя, согласно которой L. intracellularis является облигатным внутриклеточным микроорганизмом и представляет собой закругленную палочку размером 1,25-1,75мкм х 0,5-1,5 мкм. Форма микроорганизма варьирует от запятой до сигмовидной. Бактерия покрыта трехслойной оболочкой, которая по своему составу схожа с цитоплазматической мембраной клетки (C.J. Gebhart, S.M. Barns, S. McOrist et al., 1993). На обычных бактериальных питательных средах L. intracellularis роста не образует. Культивирование этой бактерии происходит в пермиссивных эукариотических клетках, а именно в культуре клеток кишечника крысы (IEC-18), человеческих эмбриональных клетках кишечника, клетках почки свиньи (PK-15) (G.H. Lawson, S. McOrist, S. Jasni et al., 1993), эпителиальных клетках кишечника поросят (IPEC-J2) (S.McOrist, C.J. Gebhart, R. Boid et al., 1995), клетках фибробластов мыши (J.P. Knittel, M.B. Roof, 1999). По данным McOrist S., Gebhart C.J., Boid R. et al. (1995), Lawson G.H., McOrist S., Jasni S. et al. (1993), Jones G., Ward G.E., Murtaugh M.P. et al. (1993), возбудитель растет в культуре клеток, в микроаэрофильных условиях с содержанием в атмосфере (5,0 – 18,0%) кислорода и максимальной высотой культуральной среды над монослоем 2-5 мм (T.K. Jensen, K. Mller, R. Lindecrona et al.,2000; R.M. Guedes, C.J. Gebhart, 2003б). Оптимальное время накопления бактерии в культуре клеток составляет 3-6 суток (S. McOrist, R.A. Mackie, G.H. Lawson, 1995).
Бактерия не образует пигмента и спор, продуцирует капсулу, не формирует жгутики или фимбрии (S. McOrist, C.J. Gebhart,R. Boid et al., 1995).
По данным Jones G.F., Ward G.E., Collins J.E. et al. (1993) культивирование L. intracellularis возможно в куриных эмбрионах. Авторам удалось воспроизвести илеит у свиней и наблюдать пролиферативные поражения кишечника в период с 10 по 29 сутки после скармливания им инфицированных куриных эмбрионов.
L. intracellularis инактивируются формалином, при температуре ниже 50С, рН среды от 7 и выше повреждает бактерию. В фекалиях бактерии сохраняют свою активность в течение двух недель при температуре от 5 до 15oC (Lawson G.H.K. et al., 1988; Кукушкин С.А., 2010).
По совокупности генетических (16 S rДНК) и биологических свойств вновь обнаруженный внутриклеточный микроорганизм, ответственный за пролиферативные изменения в слизистой оболочке подвздошной кишки свиней, отнесли к царству Bacteriae, типу Proteobacteriae, подтипу Delta/ehsilon subdivisions, классу Deltaрroteobacteriae, порядку Desulfovibrionalae, семейству Desulfovibrionaceae, роду Lawsonia, виду Intracellularis (Хоулт Дж., 1997).
Наименование возбудителя как L. intracellularis было формально дано в 1995 г. в честь шотландского ученого G.H. Lawson как исследователя, внесшего значительный вклад в изучение новой бактерии (S. McOrist, C.J. Gebhart, R. Boid et al.,1995).
В доступной литературе имеется немногочисленная информация об эпизоотологии пролиферативной энтеропатии свиней. Главная причина состоит в отсутствии манифестных признаков инфекции, за исключением пролиферативного воспаления слизистой оболочки подвздошной и тощей кишок, отмечаемого при интестинальном аденоматозе (S. McOrist, C.J. Gebhart, 1999). При этом тяжесть развития патологического процесса зависит от состава микрофлоры кишечника, который способен влиять на проникновение L. intracellularis внутрь восприимчивой клетки (S.McOrist, G.H.K. Lawson, 1989; S. McOris, S. Jasni, R.A. Mackie et al., 1993; S.H. Smith, G.H. Lawson, 2001) и от инфицирующей дозы возбудителя (A.M.Collins, R.J. Love, 2007).
Существующие на сегодняшний день сведения о пролиферативной энтеропатии свиней указывают на то, что данное заболевание распространено повсеместно в странах, занятых производством свинины (McOrist S., Hardge T., Gebhart K. et al., 2011).
Оно причиняет весьма значительный экономический ущерб свиноводческой отрасли животноводства, слагаемый из гибели животных, которая может достигать 20,0 – 40,0% (A.M. Pointon, 1989); снижения мясной продуктивности у поросят-отъемышей на 8,0 – 31,0% (S. McOrist, S.H. Smith, L.E. Green, 1997) и на 24,0% у свиней на откорме (R.P. Godolewsky, R.W.Cook, E.S. Batterham, 1991); увеличения конверсии корма на 6,0 – 33,0% (S. McOrist, S.H. Smith, L.E. Green, 1997); возрастания периода откорма до 6-10 суток (Г. Кано, Х. Санмартин, 2012); затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий. Суммарно ежегодные потери, причиненные пролиферативной энтеропатией свиноводству США, составляли 100 миллионов долларов (S. McOrist, C.J. Gebhart, 1999). По данным Г. Поллок, Г.В. Марр (2012), экономический ущерб от заболевания не геморрагической формой пролиферативной энтеропатии свиней составляет в Австралии 15 австралийских долларов на свиноматку в год и 141 австралийский доллар - для геморрагической формы заболевания (P.K.Holyoake, R.S. Cutler et al., 1995).
Согласно наблюдениям, проведенным в период с 1978 по 2000 гг. (таблица 1), наиболее неблагополучными по пролиферативной энтеропатии свиней из западных стран, в которых процент серопозитивных животных колеблется от 40,5% до 96,2%, являлись США, Дания, Германия, Бразилия. По мнению Jensen T.K., Mller K., R. Lindecrona et al. (2000), причина столь широкого охвата поголовья в Дании заключалась в том, что в этой стране был введен запрет на антибиотикотерапию.
Несколько лучше положение по пролиферативной энтеропатии свиней выявлено в таких странах, как Испания, Италия, Франция, Великобритания, Венесуэла, Швеция, Норвегия, где число серопозитивных животных в свиноводческих хозяйствах в отношении L. intracellularis варьирует от 22,0% до 37,9%.
Эпизоотологическая ситуация в Омской области по бактериальным и вирусным инфекциям свиней
Экспериментальная часть диссертационной работы выполнена в период с 2010 по 2013 гг. в ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина» на кафедре микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней, в клинике мелких копытных животных Ганноверской высшей ветеринарной школы (Германия), РОАО «Росагробиопром» ОАО «Покровский завод биопрепаратов», ГНУ ИЭВСиДВ, а также в свиноводческих хозяйствах Омской и Тюменской областей.
Изучение динамики развития свиноводства в Омской области осуществляли на основании данных зоотехнической и ветеринарной отчетности за период с 2009 по 2013 гг.
Ретроспективный анализ ситуации в отношении превалирующих болезней свиней на территории Омской области проводили по результатам статистической отчетности (по форме №1-ВЕТ, №1-ВЕТ-А) Главного управления ветеринарии Омской области.
Объектом исследования служили поросята групп доращивания, откорма, а также свиноматки, принадлежащие свиноводческим хозяйствам Омской и Тюменской областей. Всего клиническому осмотру было подвергнуто 2419 свиней, из них в секторе доращивания - 1367 гол, в секторе откорма - 765 гол, ремонтных свинок - 170 гол, а также свиноматок - 117 гол.
Для выявления серопозитивных животных использовали сыворотки от свиней разных половозрастных производственных групп. Забор крови осуществляли из краниальной полой вены свиней (n=925).
Для получения сыворотки в стерильные пробирки асептически отбирали кровь и выдерживали при 37С в течение 60 мин, после чего проводили ретракцию сгустка при 4С в течение 18 часов. Полученную сыворотку осветляли при 2000 g в течение 15-20 мин. Надосадок декантировали, аликвотировали и хранили до использования при минус 20С.
При проведении серологического мониторинга свиноводческих хозяйств Омской и Тюменской областей использовали набор на основе ТФ ИФА для выявления антител, специфичных к L. intracellularis, BioScreen Ileitis Antibody (производство Германия), согласно рекомендациям производителя. При этом проба сыворотки крови считалась положительной, если процент ингибиции был равен или больше 30,0 и отрицательной, если процент ингибиции составлял менее 30,0.
Течение и клинические проявления болезни изучали на больных свиньях различного возраста с использованием общих клинических методов обследования животных.
Патологоанатомические исследования проводили согласно методическим рекомендациям Жарова А.В., Иванова И.В., Стрельникова А.П. (2000). Метод диагностики включал в себя анализ макроскопических изменений в органах и тканях павших, вынужденно убитых или убитых с диагностической целью свиней. Всего были проведены вскрытия 182 гол свиней, из которых 60 гол относились к технологической группе доращивания, 116 гол к группе откорма, а шесть гол к ремонтным и проверяемым свинкам.
При проведении этиотропной вакцинопрофилактики применяли коммерческую вакцину Энтеризол Илеитис компании Boehringer-Ingelheim в соответствии с наставлением к иммунобиологическому препарату.
Выделение ДНК L. intracellularis и подтверждения специфичности гибели поросят от пролиферативной энтеропатии свиней осуществляли с помощью набора для обнаружения ДНК Lawsonia intracellularis фирмы Qiagen GmbH (Hilden) - «DNA Stool Mini kit». Использование данного набора проводили в соответствии с рекомендациями к нему фирмы-производителя. Объектом для исследования служили фекалии и образцы кишечника павших свиней, полученные при патологоанатомическом вскрытии и во время эксперимента (животные контрольной и опытной групп) по этиотропной вакцинопрофилактике.
Экстракцию и очистку ДНК проводили общепринятыми методами (С. Херрингтон, Дж. Магки, 1999). Постановку ПЦР осуществляли с использованием двух пар праймеров: праймер А (5-ТАТ GGCTGTCAAACACTCCG-3); праймер В (5TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3); праймер С (5 TTACAGGTGAAGTTATTGGG-3) и праймер D (5-CTTTCTCATGTCCCATAAGC 3), фланкирующих нуклеотидные последовательности bP-сегмента, специфичного для р78-ДНК-клона L. intracellularis, в позициях 5-24 и 304-323 п.о. (Gebhart и др. 1991). Информация о последовательности вышеуказанного фрагмента нуклеиновой кислоты L. intracellularis находится в банке генов под номером L08049. Амплификацию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация 94 оС – 10 мин, затем 35 основных циклов: денатурация 94 оС – 40 сек, отжиг праймеров 55 оС – 40 сек, элонгация 72 оС – 40 сек. финальная элонгация при 72 оС в течение 7 мин.
Результаты амплификации учитывали путем анализа полученных продуктов методом электрофореза в геле агарозы. Из - под масла отбирали 10 мкл пробы, смешивали с 5 мкл буферного раствора для нанесения проб (0,25% - ный бромфеноловый синий, 30,0% - ный водный раствор глицерина), смесь вносили в лунки геля. Электрофорез проводили в 2,0% - ной агарозе при 100 - 120 мВ на 1 см длины геля. Результаты электрофореза учитывали в ультарафиолетовом свете в трансиллюминаторе с длиной волны 312 нм, c помощью компьютерной программы Gelproanalyser проводили считывание результатов. При этом цифровая камера фотографировала и выводила на экран компьютера точные данные. Расчет экономической эффективности проведения этиотропной вакцинопрофилактики проводили в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.1997 г. Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно методикам, рекомендованным Лакиным Г.Ф. (1990), и с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007.
Практическое применение разработанной схемы контроля пролиферативной энтеропатии свиней на свинокомплексе
Для изыскания способа профилактики пролиферативной энтеропатии у свиней в хозяйстве, а также применения этиотропной вакцинопрофилактики как метода дифференциальной диагностики пролиферативной энтеропатии свиней от других схожих болезней, проводили иммунизацию животных вакциной Энтеризол Илеитис компании Boehringer-Ingelheim в соответствии с наставлением по применению препарата.
Исследования проводили на базе свиноводческого хозяйства промышленного типа в Тюменской области, которое, как было установлено ранее является неблагополучным по пролиферативной энтеропатии свиней.
Для изучения эффективности вакцинации против пролиферативной энтеропатии было сформировано две группы свиней в возрасте 17 сут. (опыт и контроль) по 700 голов каждая.
Перед постановкой опыта из первой и второй групп свиней, используя метод случайной выборки, произвели отбор 10 образцов крови для получения сыворотки крови. Данные сыворотки впоследствии тестировали методом ИФА на наличие специфических антител к L. intracellularis. Результаты исследования сывороток крови имели процент ингибиции менее 20.
При проведении этиотропной вакцинопрофилактики применяли вакцину Энтеризол Илеитис компании Boehringer-Ingelheim в соответствии с наставлением к препарату. Свиней обеих групп вакцинировали в соответствии с утвержденным на предприятии планом ветеринарно-санитарных и противоэпизоотических мероприятий на 2012 год. В группе № 1 животным на 21 сут жизни перорально выпаивали вакцину Энтеризол Илеитис и внутримышечно вводили вакцину Циркофлекс. Все остальные мероприятия проводили в соответствии с утвержденным на предприятии планом противоэпизоотических мероприятий.
Животных группы № 2 (контроль) иммунизировали по традиционной схеме вакцинации. Оценочными критериями служили клинико-эпизоотологические показатели свиней в секторах доращивания (57- 117 сут) и откорма (118- 180 сут) (таблица 9 и таблица 11), а также зоотехнические показатели, такие как средний вес и среднесуточный прирост живой массы животного за период нахождения в секторе. В дальнейшем учитывали среднесуточный прирост живой массы за весь жизненный цикл свиньи, средний возраст животного при сдаче на убой (таблица 10 и таблица 12). Кроме того, проводили оценку иммунного ответа (через 3 мес после иммунизации) на введение вакцины и анализ причин гибели животных в опытной и контрольной группах.
Наблюдение за клиническим состоянием животных первой и второй групп вели до их убоя согласно технологии выращивания.
В ходе проведенного эксперимента были получены следующие результаты. При наблюдении за клиническим состоянием здоровья животных установлено, что в первой и второй группах количество заболевших свиней на доращивании (таблица 9) за весь период наблюдения составило 127 (18,14%) и 200 (28,57%) голов, соответственно. При этом патология свиней в опытной группе составила: 68,5% прочие болезни, 24,4% болезни органов дыхания и 7,1% болезни органов пищеварения. В контрольной – 43% прочие болезни, 38% болезни органов пищеварения и 19% болезни органов дыхания. В санитарную секцию на лечение было передано 49 и 150 голов, что составляет 7,00% и 21,43% от общего числа животных опытной и контрольной групп. В опытной группе перевода поросят с признаками расстройства желудочно-кишечного тракта не регистрировали, тогда как в контрольной эта цифра составила 75 гол (50%). Гибель среди поросят сектора доращивания первой и второй групп составила 11 (1,57%) и 42 (6,00%) головы, соответственно.
При проведении патологоанатомического исследования павших поросят из опытной группы характерных изменений свойственных пролиферативной энтеропатии свиней не наблюдали.
В тоже время у павших поросят контрольной группы в 76,04% случаев наблюдали складчатость слизистой оболочки подвздошной кишки, у 7 поросят отмечали серозно-геморрагические инфильтраты, а также увеличение селезенки (52,0%), печень дряблой консистенции (36,0%), увеличение объема миокарда (80,0%). У трех поросят были обнаружены язвенные поражения подвздошной и тощей кишок, а в 2 случаях – с прободением стенки тонкого кишечника.