Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Социально-экономическая сущность туберкулеза 12
1.2 Взаимосвязь туберкулеза животных и человека 19
1.3 Неспецифическая реактивность крупного рогатого скота к туберкулину в эпизоотологии туберкулеза 21
1.4 Методы диагностики туберкулеза 39
1.5 Специфическая профилактика туберкулеза крупного рогатого скота использованием вакцины БЦЖ 50
1.6 Пробиотики как альтернатива антибиотикам, в том числе при туберкулезе 60
2 Собственные исследования 62
2.1 Материал и методы исследований 62
2.2 Результаты исследований 70
2.2.1 Особенности эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в природно-климатических условиях Якутии 70
2.2.1.1 Краткая характеристика территории 70
2.2.1.2 Естественная резистентность крупного рогатого скота 75
2.2.1.3 Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации 78
2.2.1.3.1 Динамика неблагополучия 78
2.2.1.3.2 Экономический ущерб
2.2.1.4 Особенности проявления неспецифических реакций на туберкулин 90
2.2.1.5 Гематологический и иммунный статус крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах 101
2.2.1.6 Экономическое значение неспецифических реакций на туберкулин 106
2.2.1.7 Этиологические факторы неспецифической реактивности к туберкулину 111
2.2.1.8 Схема дифференциации туберкулиновых реакций 115
2.2.1.9 Противоэпизоотическая и экономическая эффективность дифференциальной диагностики туберкулеза 119
2.2.2 Усовершенствование диагностики туберкулеза животных 121
2.2.2.1 Влияние аэрации на эффективность культивирования микобактерий 121
2.2.2.2 Информативность питательных сред при культивировании микобактерий 124
2.2.2.3 Молекулярная диагностика туберкулеза 127
2.2.2.4 Информативность ПЦР-диагностики туберкулеза из различного биоматериала от реагирующих на туберкулин животных 131
2.2.2.5 Особенности прижизненной диагностики туберкулеза у северных оленей и лесных бизонов 133
2.2.3 Взаимосвязь туберкулеза крупного рогатого скота и человека в Республике Саха (Якутия) 138
2.2.3.1 Эпидемическая ситуация по туберкулезу 138
2.2.3.2 Взаимное заражение крупного рогатого скота и людей возбудителем туберкулеза 145
2.2.3.3 Характеристика эпидемических очагов риска туберкулеза для крупного рогатого скота 153
2.2.3.4 Комплексные медико-ветеринарные мероприятия 158
2.2.4 Антагонистическое действие пробиотиков из штаммов Bacillus subtilis к микобактериям туберкулеза 162
2.2.5 Специфическая профилактика туберкулеза крупного рогатого скота с использованием вакцины БЦЖ и иммуномодулятора полирибоната 174
2.2.5.1 Титрация заражающей дозы М. bovis (шт. 14, ВНИИБТЖ) 175
Влияние полирибоната на протективные свойства вакцины БЦЖ при экспериментальном туберкулезе морских свинок 178
2.2.5.3 Протективные свойства вакцины БЦЖ при экспериментальном туберкулезе молодняка крупного рогатого скота 184
2.2.5.4 Аллергическая реактивность к ППД туберкулину для млекопитающих 185
2.2.5.5 Влияние полирибоната на иммуногенность вакцины БЦЖ
и напряженность поствакцинального иммунитета 189
2.2.5.5.1 Гиперчувствительность замедленного типа к ППД туберкулину для млекопитающих 189
2.2.5.5.2 Пораженность туберкулезом внутренних органов 192
2.2.5.6 Иммунобиологическое состояние организма при сочетанном применении вакцины БЦЖ и полирибоната 194
2.2.5.6.1 Реакция связывания комплемента 194
2.2.5.6.2 Реакция бластгрансформации лейкоцитов 198
2.2.5.6.3. Реакция специфического лизиса лейкоцитов 199
2.2.5.6.4 Опсоно-фагоцитарная реакция 200
2.2.5.6.5 Уровень общего белка и его фракций 203
2.2.5.7 Результаты производственного испытания профилактики туберкулеза у молодняка крупного рогатого скота с применением вакцины БЦЖ и полирибоната 207
2.3. Обсуждение результатов 211
Заключение 230
Список литературы
- Неспецифическая реактивность крупного рогатого скота к туберкулину в эпизоотологии туберкулеза
- Специфическая профилактика туберкулеза крупного рогатого скота использованием вакцины БЦЖ
- Особенности проявления неспецифических реакций на туберкулин
- Взаимосвязь туберкулеза крупного рогатого скота и человека в Республике Саха (Якутия)
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи, туберкулез, как животных, так и человека, остается одним из наиболее сложных, социально опасных и экономических значимых инфекций в мире, в том числе в России, и включен в перечень карантинных и особо опасных болезней животных (Приказ МСХ РФ № 81 от 17.05.2005).
Экстремальные природно-климатические условия Республики Саха (Якутия) в значительной мере влияют на гомеостаз сельскохозяйственных животных и обуславливают особенности проявления эпизоотического процесса инфекционных болезней, в том числе туберкулеза крупного рогатого скота.
В настоящий период в Якутии при содержании крупного рогатого скота в крестьянских, фермерских хозяйствах и подворьях граждан многократно возрос контакт населения с животными, что повысило риск взаимного заражения возбудителями болезней, свойственных животным и человеку, в том числе туберкулеза. При этом продукты питания не подвергаются ветеринарно-санитарному контролю и обработке, что приводит к заражению населения, особенно детей. И, наоборот, животным постоянно скармливаются остатки пищи, контаминиро-ванные возбудителем туберкулеза, если семья представляет собой эпидемический очаг, в котором проживают больные люди. Взаимное заражение туберкулезом крупного рогатого скота и их владельцев в период относительного эпизоотического благополучия вызывает необходимость постоянного мониторинга за эпизоотическим и эпидемическим состоянием в тесном взаимодействии медицинской и ветеринарной служб.
В настоящее время в эпизоотологии туберкулеза на территории региона актуальной остается проблема неспецифической реактивности крупного рогатого скота к туберкулину, обуславливающей необоснованный убой продуктивных животных и большие экономические потери, что требует разработки методов дифференциальной диагностики.
В проблеме туберкулеза не до конца решены вопросы прижизненной диагностики для некоторых видов животных (северные олени, лесные бизоны), бактериологической, молекулярно-генетической на фоне неспецифической реактивности животных к туберкулину, а также специфической профилактики с использованием вакцины БЦЖ, решение которых актуально для науки и практики. В последние годы сформировалось новое направление профилактики инфекционных болезней с помощью пробиотиков, являющихся антагонистами ряда возбудителей, в том числе микобактерий, в связи с чем актуально развитие этого направления.
Степень разработанности проблемы. Неоспоримо доказана тесная взаимосвязь заболеваемости туберкулезом животных, в том числе крупного рогатого скота, и человека (Р.В. Тузова, 1975; Я.А. Благодарный, 1984; А.С. Донченко, 1992; Е.Н. Писаренко, 1992; D. Cousins, D. Dawson, 1999; A. Sanami, 1999; L. Legout., 2001; I. Pavlic, 2004; I. Kanter, 2004). С учетом новых условий хозяйствования требуется разработка комплексных региональных программ профилактики взаимного заражения патогенными возбудителями туберкулеза.
Одним из основных звеньев эпизоотической цепи при инфекционных болезнях является восприимчивое животное, в связи с чем ведущую роль играет специфическая профилактика (А.И. Бакулов, 1979), основы которой при туберкулезе животных с применением вакцины БЦЖ заложены М.М. Авербахом (1970), Б.Я. Хайкиным (1972), М.А. Сафиным (1981), В.И. Пионтковским (1982). Однако, как показала практика, ее эффективность не превышает 70%.
Предприняты попытки повышения иммуногенности вакцины БЦЖ с помощью иммуностимулирующих и иммунокоррегирующих препаратов (В.И. Литвинов и др., 1982; Б.М. Туякбаева и др., 1986; Л.А. Шарашенидзе, 1988; Г.Н. Спиридонов, 1988; С.Д. Басыбекова, 1995; А.С. Жумаш и др., 1995; 1995-2000; 2001; Р.А. Хамзин, 2006), но они не нашли практического применения. Перспективным является повышение протективных свойств вакцины БЦЖ с сочетанным применением иммуномодуляторов (Ю.С. Аликин, 1988; Н.А. Александров и др., 1995-2000; А.С. Донченко, Н.А. Донченко, 2000; И.П. Хабузов, 2001), в том числе препаратов РНК, способных усиливать специфический иммунитет (Э.Н. Шляхов, 1984; М.Н. Блинов, 1987; В.А. Фадина и др., 1988; A.M. Земсков и др., 1989; Ю.С. Аликин, 1998; А.С. Донченко, 2004).
Установлено антагонистическое действие пробиотиков на возбудителей ряда инфекционных болезней (И.Б. Павлова, 2005; А.Л. Лазовская и др., 2009; Н.Д. Архипова, 2009; М.П. Неустроев и др., 2010; А.Н. Панин, 2012), а также предложен способ повышения антагонистической активности пробиотика из штамма бактерий Bacillus subtilis к патогенным микобактериям туберкулеза (М.А. Кульчицкая и др., 2008), однако способ предусматривает определение активности путем установления индекса блокирования роста микобактерий в течение длительного времени и отличается трудоемкостью.
Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось эпизоотоло-гическое и эпидемиологическое обоснование и разработка комплекса мероприятий по профилактике взаимного заражения туберкулезом животных и человека в Якутии, усовершенствование методов диагностики и специфической профилактики туберкулеза.
В задачи исследований входило:
изучить особенности эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в природно-климатических условиях Якутии;
усовершенствовать комплекс диагностических мероприятий при туберкулезе животных;
определить взаимосвязь заражения крупного рогатого скота и населения возбудителями туберкулеза М. bovis и М. tuberculosis, разработать медико-ветеринарные мероприятия в эпидемических очагах риска туберкулеза;
разработать способ профилактики туберкулеза животных с использованием вакцины БЦЖ и иммуномодулятора полирибоната;
изучить антагонистическое действие бактерий Bacillus subtilis к патогенным микобактериям.
Научная новизна. Дан ретроспективный анализ эпизоотической и эпидемической ситуации по туберкулезу Республики Саха (Якутия). Установлена взаимосвязь заболеваемости крупного рогатого скота и населения туберкулезом
в PC (Я). Определены и взяты на учет эпидемические очаги туберкулеза, как потенциальные источники заражения крупного рогатого скота М. tuberculosis.
Предложены оптимальные технологические методы прижизненной диагностики туберкулеза северных оленей и лесных бизонов при содержании в природных парках.
Изучено влияние аэрации питательных сред на скорость роста разных видов патогенных и атипичных микобактерий, дана оценка информативности плотных и жидких питательных сред при культивировании микобактерий.
Определена диагностическая ценность детекции ДНК микобактерий туберкулеза методом ПЦР в биоматериале от крупного рогатого скота благополучных по туберкулезу хозяйств, ранее являвшихся неблагополучными, а также информативность теста при исследовании разного вида биоматериала.
Впервые установлена активизация эпизоотического процесса туберкулеза и неспецифической реактивности животных к туберкулину через 6-8 лет после всплеска солнечной активности, выраженной в числах Вольфа.
Установлена взаимосвязь неспецифических реакций на туберкулин с рядом болезней и патологическими процессами во внутренних органах.
Дано теоретическое обоснование и экспериментально установлена возможность повышения иммуногенных свойств вакцины БЦЖ при сочетанном применении с иммуномодулятором полирибонатом.
Экспериментально испытаны штаммы бактерий Bacillus subtilis, выделенных из мерзлотных почв Якутии. Установлены их антагонистические свойства к микобактериям туберкулеза и обуславливающего снижение вирулентности за счет задержки образования корд-фактора.
Научная новизна исследований подтверждена патентами РФ на изобретения: «Способ профилактики туберкулеза животных» № 1790414 от 23.01.1993 г. и «Способ подавления корд-фактора микобактерий туберкулеза», №2422150 от 27.06.2011г.
Теоретическая и практическая значимость. Установленные региональные особенности эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота во взаимосвязи с эпидемической ситуацией в PC (Я) дополняют и расширяют имеющиеся данные и вносят определенный вклад в теорию и практику проблемы профилактики и ликвидации туберкулеза. Результаты исследований могут быть реализованы в системе противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий, а также в учебном процессе ВУЗов и нашли отражение в нормативно-технических и научно-методических документах, регламентирующих мероприятия при туберкулезе.
Комплексные медико-ветеринарные мероприятия в очагах туберкулезной инфекции реализуются во всех подсобных и крестьянских хозяйствах (подворьях) Якутии, в которых при профилактических аллергических исследованиях на туберкулез выявляются реагирующие на туберкулин животные или, по данным Роспотребнадзора - больные туберкулезом люди.
Мероприятия по дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота с применением уменьшенной дозы ППД туберкулина для млекопитающих и ПНР-диагностики внедрены в хозяйствах улусов Якутии.
Схема специфической профилактики туберкулеза с использованием вакцины БЦЖ и иммуномодулятора полирибоната (использована при разработке «Наставления по применению полирибоната в ветеринарии в качестве иммуномодулятора») позволяет эффективно защитить молодняк крупного рогатого скота от заражения. Схема внедрена на 37 фермах (21,1 тыс. телят) модельного района Новосибирской области.
Результаты исследований явились основой учебно-методических пособий «Краевая эпизоотология Республики Саха (Якутия)» и «Лабораторная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота», рекомендованных УМО высших учебных заведений РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии, а также учебного пособия «Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота», зарегистрированного в качестве электронного ресурса Российской Академией образования, как отвечающее требованиям новизны и приоритетности.
Методология и методы исследований. Объектом исследований явились статистические данные, экспериментальные препараты, лабораторные и сельскохозяйственные животные, биологический материал, культуры патогенных и атипичных микобактерии, питательные среды для культивирования микобакте-рий, методы диагностики туберкулеза. Предмет исследований - научное обоснование, разработка и усовершенствование методов диагностики, специфической профилактики и взаимодействия ветеринарной и медицинской служб в системе противоэпизоотических мероприятий при туберкулезе.
В работе использовали аналитический, эпизоотологический, эпидемиологический, аллергический, патологоанатомический, бактериологический, серологический, иммунологический, гематологический, молекулярно-генетический, статистический и экономический методы исследований.
Основные положения, выносимые на защиту:
особенности эпизоотического и эпидемического процесса туберкулеза на территории Республики Саха (Якутия), их взаимосвязь и мероприятия по профилактике;
усовершенствованный комплекс диагностических исследований при туберкулезе животных;
способ профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с сочетанным применением вакцины БЦЖ и иммуномодулятора полирибоната;
антагонистическое действие пробиотика «Сахабактисубтил» на биологические свойства микобактерии туберкулеза.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обусловлена большим объемом статистического и экспериментального материала, использованием современных методов и методик исследований, производственным испытанием и статистической обработкой данных.
Результаты исследований доложены на международных, всероссийских и региональных научно-практических конференциях и симпозиумах: «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Л., 1989), III Всесоюзной конференции по эпизоотологии (Новосибирск, 1991), «Основные научные исследования по туберкулезу с.-х. животных в Сибири» (Новосибирск, 1995), «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной про-
дукции» (М., 1997), «Региональные проблемы сельскохозяйственного производства в PC (Я)» (Якутск, 1999), «Современные проблемы туберкулеза XXI века» (Томск, 1999), «Проблемы стандартизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии» (Алма-Ата, 2000), молодых ученых аграрных ВУЗов России (Якутск, 2003), симпозиуме Японо-Российского медицинского обмена (Ниигата, 2004), «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2004), «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004), «Проблемы и перспективы ветеринарии в XXI веке» (Улан-Удэ, 2005), «Наука в аграрном вузе: инновации, проблемы и перспективы» (Якутск, 2006), «Энтузиазм и творчество молодых ученых в развитии фундаментальной и прикладной науки» (Троицк, 2006), XII Международной конференции по арктическим животным (Якутск, 2007), «Актуальные проблемы инфекционных болезней животных, рыб и пчел» (М., 2011), «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (С.-Пб., 2011), Польша (Пшемысль, 2012), «Здоровьесбережение народа: интеграция Восток-Запад» (Якутск, 2014), «Найновите научни постижения» (София, 2014).
Публикация материалов исследований. По теме диссертации опубликованы 63 научные работы, в том числе 14 статей, в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Аграрная наук», «Ветеринарная патология», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Зоотехния», «Аграрный вестник Урала», «Вестник ветеринарии», «Вестник РАСХН», «Ветеринарная медицина», «Якутский медицинский журнал»). Получено 2 патента на изобретения РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 49 таблицами, 21 рисунком и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, списка использованной литературы (664 источника, из них 104 зарубежных авторов) и 15 приложений.
Неспецифическая реактивность крупного рогатого скота к туберкулину в эпизоотологии туберкулеза
По уровню смертности от инфекционных болезней туберкулез занимает одно из первых мест в мире. В странах Европы смертность составляет 0,9-2,7 чел. в расчете на 100 тыс. населения и 6,5 чел. в странах Латинской Америки. В Российской Федерации смертность от туберкулеза и ранее составляла в среднем 7,7 чел. на 100 тыс. населения, однако к 1999 году возросла до 16,7 чел., или более чем в два раза.
С учетом крайне неблагоприятной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России были предприняты соответствующие государственные меры и принят ряд нормативных документов. Так, вступил в силу федеральный закон от 18 июня 2001 г. № 77-83 «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации». Стратегические направления определены также подпрограммой «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России», являющейся составной частью федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера (2002-2006 гг.)», утвержденной Постановлением Правительства РФ от 13 ноября 2001 г., № 790. Кроме того, издан новый приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003 г., № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».
Не менее важен эпизоотологический аспект и экономическая составляющая проблемы туберкулеза сельскохозяйственных животных, особенно круп-ного рогатого скота.
В начале XXI века туберкулез сельскохозяйственных животных, имея глобальное распространение на всех континентах мира, остается весьма актуальной международной проблемой. Только в странах Европы в 2002 г. среди разных видов сельскохозяйственных животных, с преобладанием крупного рогато 14 го скота, зарегистрировано свыше 13 тыс. очагов туберкулеза, в которых выявлено почти 29 тыс. больных туберкулезом животных (Н.П. Овдиенко и др., 2004).
Рассматривая эпизоотическую ситуацию по туберкулезу животных в некоторых зарубежных странах, можно констатировать, что показатель заболеваемости (по абсолютному значению) в ряде стран относительно сопоставим с показателем по Российской Федерации (для сравнения: в РФ в 2001 г. заболело туберкулезом 13543 гол. крупного рогатого скота, в 2002 г. - 6595 гол). Особенно широко распространен туберкулез в таких странах как Северная Ирландии, Италия, Мексика, Новая Зеландия, Бразилия.
Тенденция устойчивого снижения напряженности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в целом по Российской Федерации наметилась с конца 80-х-начале 90-х годов прошлого столетия в условиях реформирования сельскохозяйственного производства по всем основным показателям - количеству неблагополучных пунктов, заболеваемости, очаговости и пораженное туш (А.С. Донченко, 2002; Ю.И. Смолянинов и др., 2003; Н.А. Яременко, В.Н. Абрамов, 2004; А.Х Найманов, 2004; В.Г. Ощепков, 2004), однако в ряде крупных экономических регионах страны (Поволжье, Западная Сибирь, Северный Кавказ) она продолжает оставаться сложной (A.M. Смирнов, 2004).
Туберкулез сельскохозяйственных животных, особенно крупного рогатого скота, причиняет огромный ущерб экономике животноводства. По объемам экономических потерь, которые в десятки и сотни раз могут превышать ущерб от стихийных бедствий и катастроф техногенного характера, отдельные инфекционные болезни животных следует относить к катастрофам биологического характера (А.А. Бойко, Б.А. Кругликов, 1994). С полным основанием к такой катастрофе можно отнести и туберкулез, как животных, так и человека (Ю.И. Смолянинов и др., 2006).
Приведем примеры, раскрывающих огромное значение туберкулеза крупного рогатого скота в экономике животноводстве ряда стран мира. В США ежегодно экономические потери от туберкулеза всех видов сельскохозяйственных животных достигали 80 млн., Великобритании - 20 млн., Франции - 15 млн. и ФРГ - 33 млн. марок (D. Villegas, 1965). В Германии еще перед первой мировой войной ущерб от туберкулеза животных ежегодно составлял свыше 40 млн. золотых марок (А. Меуп, 1952). При этом экономические потери только от утилизации на бойнях туш крупного рогатого скота и свиней, а также внутренних органов с генерализованными формами туберкулезных поражений и от снижения качества мясной продукции от больных животных равнялись 6,5 млн. марок (Ф. Гутира, И. Марек, 1931). В ГДР лишь по одной Тюрингии экономический ущерб от туберкулеза животных составлял 12-13 млн., а в целом по стране - 93,6 млн. марок (W. Kruger, 1954). В округе Карл-Маркс-Штадт экономические потери от убоя больного туберкулезом крупного рогатого скота в 1965-1967 гг. исчислялись в размере 8,2 млн. марок (G. Meisinger, 1970).
В Болгарии годовые экономические потери, причиняемые туберкулезом крупного рогатого скота, свиней и птицы, вычисленные на основании приблизительной рыночной стоимости животноводческой продукции, за 4 года (1960-1963) составили 2,2 млн. левов (С. Георгиев, Б. Божилов, 1967).
В Швейцарии до 1950 г. экономический ущерб, причиняемый туберкулезом крупного рогатого скота, ежегодно превышал 20 млн. франков (G. Fluckiger, 1956; V. Allenspach, 1960), а в последующие годы достигал 50 млн. франков (I. Andres, 1962). В Венгрии за 1965 г. ущерб составил 1 млрд. форинтов (L. Denes, 1966, 1983); в США за отдельные годы - 60-80 млн. долларов (I. Stelle, A. Ranney, 1958); Польше в 1956 г. - 12 млн. злотых (S. Kraus, A. Sluzewski, 1962). В этом же году в Польше потери только мясной, молочной продукции и приплода от больного туберкулезом поголовья крупного рогатого скота исчислялись в 9,6 млн. злотых.
Специфическая профилактика туберкулеза крупного рогатого скота использованием вакцины БЦЖ
Эпизоотологический и эпидемиологический - при анализе эпизоотической и эпидемической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота и населения по интенсивным и экстенсивным показателям в пространственно-временном диапазоне (В.Д. Беляков, Яфаев Р.Х., 1979; СИ. Джупина, В.А. Ведерников, 1981; СИ.Джупина, А.А. Колосов, 1991; Б.Л. Черкасский, 1994; И.А. Бакулов с соавт., 2001).
Первичные статистические сведения в качестве фоновой информации по эпизоотологии и эпидемиологии туберкулеза получены в Департаменте ветеринарии МСХ PC (Я), Министерстве Здравоохранения PC (Я), Якутском НИИ туберкулеза МЗ РФ. Использованы также результаты собственных диагностических (аллергических, патологоанатомических, иммунологических, бактериологических) исследований.
Аллергический - при изучении гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ) у лабораторных животных, крупного рогатого скота, северных оленей в соответствии с «Наставлением по применению (ППД) туберкулинов для млекопитающих и для птиц» (1999). Для аллергической диагностики туберкулеза использовали различные серии туберкулинов производства ФГУП «Курская биофабрика».
Туберкулин крупному рогатому скоту вводили внутрикожно безыгольным инъектором типа БИ (МБИ) -7 «Овод», морским свинкам, кроликам, курам, северным оленям - шприцем с иглами для туберкулинизации.
Патологоанатомический. На крупном рогатом скоте - для послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы внутренних органов и лимфатических уз 66 лов реагирующих на туберкулин, на лабораторных животных - в опытах с заражением культурами микобактерий и суспензией биоматериала согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (1986, 2002).
Патологоанатомические исследования осуществляли в условиях экспериментальных хозяйств и мясоперерабатывающих предприятий. Экспертизе подвергали пробы внутренних паренхиматозных органов (печень, легкие, селезенка, почки), кишечника и лимфатических узлов (бронхиальные, средостенные, заглоточные, подчелюстные, предлопаточные, мезентериальные, надвымянные, коленной складки, паховые и др.). Индекс пораженности туберкулезом внутренних органов определяли по методикам и их модификациям, изложенным в работах Feldman, 1943; В. Войтека, 1963; А.И. Тогуновой, 1965; Ю.К. Вейс-фейлера 1975), А.А. Триус (1976).
Бактериологический. Бактериологические исследования (микроскопический, культуральный и биологический методы) проводили согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (2002), и «Методам лабораторной диагностики туберкулеза», ГОСТ 26072-89, СТ СЭВ 3457-81). Биологическую пробу ставили на морских свинках, кроликах и курах.
Мазки для прямой микроскопии окрашивали по Цилю-Нильсену и просматривали под микроскопом «Микмед 6» (увеличение хЮОО). Ряд препаратов фотографировали с помощью цифровой камеры микроскопа (модель DCM 500, 5 МПикс, USB 2.0) с использованием программы MiniSee. Из флюорохромных красителей для люминесцентной микроскопии (марка «Биомед-5ПР ЛЮМ, Россия) использовали аурамин.
В культуральном методе исследований использовали наиболее распространенные в бактериологической диагностике туберкулеза специальные питательные среды для культивирования микобактерий: плотные - Левенштейна-Иенсена, Финн-2, Гельберга, Павловского и жидкие - ВКЛ, Сотона, Моделя, ГДР, Школьниковой. Питательные среды использовали в опытах по изучению ростовых свойств при культивировании разных видов микобактерий, в том числе в различных моделируемых условиях аэрации; индикации и идентификации патогенных и атипичных микобактерий, для получения биомассы бактерий, изучению проявления феномена корд-фактора.
Предпосевную обработку биоматериала от убитых животных (пробы паренхиматозных органов и лимфатических узлов) проводили по методу А.П. Аликаевой, а также методу обогащения путем флотации и седиментации (Л.К. Сидорова, 1969; С.Г. Субботина, 1977) в модификации А.С. Донченко с соавт., 1988).
Суспензии различных концентраций микобактерий готовили методом последовательных разведений биомассы в физиологическом растворе (Методические рекомендации МЗ РСФСР «Современные методы микробиоло-гической диагностики туберкулеза». М., 1975). Учет и оценку колоний культур микобактерий проводили по схеме Г.Н. Першина (1971).
Микобактерий дифференцировали с использованием схемы, разработанной в ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (1976) в модификациях А.Л Лазовской и И.Н. Бло-хиной (1976), М.П. Зыковой, Т.Б. Ильиной (1981), Н.М. Макаревича, Я.А. Благодарного (1985). При этом у культур микобактерий изучали скорость роста на питательных средах (W. Kappler, 1968), рост при различных температурах (22, 37, 45 и 52 С, морфологию колоний, тинкториальные свойства при окраске по Цилю-Нильсену, пигментообразование в темноте и на свету (J. Cubica, 1973), активность каталазы (L. Wayne, 1972), амидазную активность (R. Boniche, 1962), реакцию нитратов (М. Tsukamura, 1965), формамидазную активность (М. Tsukamura, 1966), лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратом (метод абсолютных концентраций на плотных питательных средах), аураминовую дисковую пробу в модификации В.М. Карташовой (1973).
Особенности проявления неспецифических реакций на туберкулин
Диагностика туберкулеза у северных оленей. В последний период, в связи с социально-экономическими преобразованиями, резко сократилось поголовье одомашненных северных оленей на территории Якутии. Одним из путей восстановления и развития оленеводства в таежной зоне Центральной Якутии было создание в 1997 г. экспериментальной оленеводческой фермы - резервата северных оленей при Якутской государственной сельскохозяйственной академии. Резерват «Табсылын» находится в 45 км от г. Якутска, где олени эвенкийской породы содержатся в огороженных парках.
В естественных условиях клинические признаки туберкулеза регистрируются у северных оленей, однако по имеющимся сообщениям судить о распространении данной инфекции трудно (В.А. Поляков, 2006). О случаях заболевания туберкулезом диких и одомашненных северных оленей сообщали ранее СИ. Драчинский (1913), С.А. Грюнер (1929), И.Н. Свистунов (1938), В.А. Забродин с соавт. (1980), но более современные данные отсутствуют.
О проявлении туберкулеза у северных оленей можно судить также по следующим данным. Так, при аллергическом исследовании (туберкулинизация) 300 клинически здоровых ездовых оленей выявлено 49, или 16,3% реагирующих на туберкулин, а из 10 культур микобактерий, изолированных из биоматериала от них после убоя, 7 отнесены к возбудителю человеческого вида (А.Ф. Гончаров, 1951). В дальнейшем эти данные подтверждены результатами исследований А.И. Дмитриева (1953). Клинические признаки туберкулеза, а также характерные для туберкулеза поражения во внутренних органах при патолого-анатомическом исследовании убитых животных наблюдали в популяциях диких тундровых карибу (американский подвид северного оленя) на Канадском Севере (J. Kelsall, 1968).
Установлено широкое распространение туберкулеза с выделением возбудителя бычьего и человеческого видов у животных семейства оленьих при парко 134 вом содержании среди поголовья маралов (С.Я. Любашенко, Е.П. Данилов, 1954; В.Г. Луницын, 1988, 1989; А.С. Донченко, В.Г. Луницын, 1994) и пятнистых оленей (Н.М. Мандро, 1990, 2000; Ю.А. Данко с соавт., 2006).
Целью исследований явилась разработка технологии прижизненной диагностики туберкулеза у северных оленей в условиях паркового содержания. Исследования проводили на 150 северных оленях резервата «Табсылын» Якутской Государственной сельскохозяйственной академии.
Попытки внутрикожного введения (средняя треть шеи) оленям ППД туберкулина для млекопитающих с помощью механического безыгольного инъекто-ра МБИ-7 «Овод» показали, что аллерген проникает через все слои кожи и локализуется в подкожной клетчатке и более глубоких мышечных тканях, что обусловлено создаваемым высоким давлением инъектора. Следует отметить, что кожа у северного оленя очень тонкая, а в области шеи ее толщина не превышает 1 мм (В.Г. Шелепов и др., 2003). Технологически приемлемым оказалось внутрикожное введение туберкулина с помощью шприца с иглами для ту-беркулинизации. Технически возможно также использованием пальпебральной и офтальмопробы.
При оценке реакции на введение туберкулина положительная реакция (увеличение толщины кожной складки на 5 мм) установлена у одного оленя (хор в возрасте 6 лет, инв. № 9438). При повторном исследовании животного через 30 дней туберкулином в уменьшенной дозе (5000 ME) реакция не проявилась. В дальнейшем, при плановом убое оленей, в том числе реагирующего на туберкулин, патологоанатомическими исследованиями внутренних органов и лабораторным исследованием биоматериала (посев на питательные среды, биопроба на лабораторных животных) туберкулез не подтвержден. При исследовании проб крови всего поголовья резервата северных оленей (150 проб) в ПЦР ДНК микобактерий также не обнаружены.
Таким образом, в технологическом отношении внутрикожное введение ту-беркулинов в аллергической диагностике туберкулеза у северных оленей с помощью механических безыгольных инъекторов не приемлемо. Оптимальным является использованием малообъемного (1-2 мл) шприца с бегунком и иглами для туберкулинизации (№ 0606 ТУ 46-22-607). Кроме того, технически возможно использование для аллергической диагностики туберкулеза у северных оленей пальпебральной туберкулиновой пробы и офтальмопробы.
Диагностика туберкулеза у лесных бизонов.
Расселение американских бизонов в Якутии, в частности лесных бизонов (Bison bison athabascae), рассматривается как реинтродукция (восстановление) исторического ареала этого вида животных, живших на территории региона более 20-30 млн. лет назад и исчезнувшего в период формирования современной таежной и тундровой экосистемы (В.Е. Соколов, 1989; А.А. Данилкин, 2005). Лесной бизон - крупнейшее из наземных млекопитающих животных (рис. 8), масса самцов которых достигает 1200 кг, является отдельным северным подвидом или экотипом американского бизона (V. Geist, 1987, Е. Charles, A. Cliffod, 1991).
Согласно программы «Реакклиматизация лесного бизона на территории Республики Саха (Якутия)», разработанной Министерством охраны природы республики, в Якутии был создан природный парк «Ленские столбы» и специальный питомник-бизонарий «Усть-Буотама». В 1996 г. из национального парка «ЭлкАйленд» Канады были завезены 30 лесных бизонов. В последующем завоз партий животных продолжался. В связи с успешной акклиматизацией и быстрыми темпами самовоспроизводства стада завезенных в Якутию лесных бизонов, был создан второй питомник-бизонарий «Тымпанай» в природном парке «Сиинэ». В настоящее время поголовье бизонов различных половозрастных групп в обоих парках превышает 130 гол.
Туберкулез (и одновременно бруцеллез) среди лесных бизонов, причиной которого явился возбудитель туберкулеза бычьего вида (М bovis) был зарегистрирован в парке «ВУД-Баффоло» Канады. По мнению специалистов туберкулез хотя и остается эндемичным в пределах ареала распространения вида, однако создает серьезную проблему как на правительственном уровне, так и для местных коренных народов (Anchorage Loily News, 2008).
Взаимосвязь туберкулеза крупного рогатого скота и человека в Республике Саха (Якутия)
Учитывая невысокие протективные свойства, предпринимались попытки повышения иммуногенности вакцины БЦЖ с помощью различных препаратов (В.И. Кудрявцев, Э.С. Раскина, 1963; В.И. Литвинов и др., 1982; Б.М. Туякбаева с соавт., 1986; Л.А. Шарашенидзе, 1988; Г.Н. Спиридонов, 1988), однако они не нашли практического применения.
На основании экспериментальных исследований Ю.С. Аликина (1988), А.С. Донченко, Н.А. Донченко (1996, 2000), Н.Д. Александров и др. (1995— 2000), И.П. Хабузова (2001) перспективным является повышение протективных свойств вакцины БЦЖ с сочетанным применением иммуномодуляторов, в частности препаратов РНК, являющиеся мощными стимуляторами неспецифической резистентности и способны усиливать специфический иммунитет, (В.А. Фадина с соавт. 1988; A.M. Земсков с соавт., 1989; Ю.С. Аликин, 1998; А.С. Донченко, 2004).
С этой целью нами при иммунизации лабораторных животных и молодняка крупного рогатого скота всесторонне экспериментально испытан иммуномоду-лирующий препарат полирибонат, представляющий собой односпиральную РНК (получен в НИКТИ БАВ ГНЦ БВ «Вектор», г. Бердск). В опытах с иммунизацией телят БЦЖ с полирибонатом в различных схемах применения нами получены следующие результаты.
По показателям гиперчувствительности замедленного типа на введение ППД туберкулина для млекопитающих, пораженности туберкулезом внутренних ор 227 ганов, протективных свойств БЦЖ по результатам различных диагностических тестов, иммунобиологического состояния организма (РСК, реакция бласт-трансформации лейкоцитов, реакция специфического лизиса лейкоцитов, опсо-но-фагоцитарная реакция), уровень общего белка и его фракций установлено усиление иммуногенных свойств вакцины БЦЖ с одновременным использованием полирибоната. Наибольший защитный эффект получен при иммунизации БЦЖ с дробным введением полирибоната по схеме: первично в дозе 0,5 мг/кг живой массы одновременно с БЦЖ, повторно в той же дозе через 14 сут.) возрастают до 100%. Эффективность метода подтверждается результатами широкого производственного испытания.
Способ профилактики туберкулеза у молодняка крупного рогатого скота явился предметом изобретения, на что получен патент.
В последние годы разработан ряд пробиотиков, полученных из штаммов Bacillus subtilis, уникальных тем, что их споровые формы, выделенных из мерзлотных почв Якутии, обладают чрезвычайной устойчивостью к низкой температуре (М.П. Неустроев с соавт., 2010). Целью наших исследований явилось изучение антагонистическое действие бактерий Bacillus subtilis на биологические свойства микобактерий туберкулеза.
Рядом исследователей (М.А. Кульчицкая, И.Г. Осипова, А.Л. Лазовская и др., 2008) разработан способ повышения антагонистической активности про-биотика из споровых бактерий «Сахабактисубтил» к микобактериям. Однако способ предусматривает определение антагонистической активности пробиотиков путем установления индекса блокирования роста микобактерий в течение длительного времени (45 дней). При этом механизм действия антагониста не раскрывается. Кроме того, способ отличается большой трудоемкостью с использованием твердых питательных веществ.
Нами же разработан способ подавления образования корд-фактора, выступающего в роли основного фактора патогенности микобактерий. Одним из важных биологических свойств микобактерий является образование корд-фактора (образование в скоплении культивируемых в жидкой пита 228 тельной среде микобактерий нитей, «кос» и «жгутов») выступающего в роли основного фактора вирулентности. Корд-фактор обусловлен наличием поверхностного антигена, защищающего микобактерий от фагоцитоза.
Опыты in vitro показали, что при микроскопии мазков кордообразование в контрольных пробирках как с М. tuberculosis, так и М. bovis особенно наглядно проявляется на 14-й день культивирования. В мазках из опытных пробирок характерные для вирулентных штаммов «тяжи» были не сформированы, т.е. корд-фактор отсутствовал. При этом количество микобактерий не увеличивалось во все сроки наблюдения, что свидетельствует об отсутствии процесса деления и размножения. В опытах in vivo продолжительность жизни мышей контрольной группы (только заражение) составила 68,9 дней, зараженных, с предварительной дачей пробиотика она достоверно увеличилась на 18,3 дня. Еще большие различия получены во 2-й опытной группе (пробиотик + заражение + пробио-тик), в которой все мыши остались живы в срок до 90-го дня наблюдений. Кроме того, если у мышей контрольной группы снижение живой массы составило 16,1%, то у опытных 9,1 и 3,7%.
Пробиотик оказал также влияние на способность микобактерий к росту и размножению. Индекс высеваемости микобактерий на питательной среде Финн-2 из легких павших белых мышей опытной группы (пробиотик + заражение) составил 20 КОЕ, а из селезенки не проявлялся. Из биоматериала контрольных животных высеваемость составляла 100 и более КОЕ.
Кроме того, установлено, что пробиотик «Сахабактисубтил» повышает антиоксидантную защиту организма белых мышей. Определение активности ферментов каталазы и пероксидазы, участвующих в антиоксидантной защите, в том числе против микобактерий туберкулеза показало более низкую активность культуры М. bovis после пассажа на белых мышах, которым задавали «Сахабактисубтил».
Результаты исследований свидетельствуют о глубоком морфологическом изменении клетки микобактерий при воздействии экспериментальных пробиоти-ков и открывают большие перспективы во фтизиатрии и клинической медицине для повышения эффективности терапии больных туберкулезом людей путем сочетанного применения лекарственных препаратов и штаммов бактерий Bacillus subtilis. Полученные данные в определенной степени согласуются с данными И.Б. Павловой, Н.Д. Архиповой, 2009; А.Л. Лазовской с соавт., 2008, 2009), указывающих, что микобактерии под воздействием различных веществ теряют свои липидные покровы, что приводит к деформации клеток за счет нарушения структуры клеточной стенки, что свидетельствует об антагонистической активности пробиотиков в отношении микобактерии.
Результаты исследований, открывают большие перспективы во фтизиатрии и клинической медицине для повышения эффективности терапии больных туберкулезом людей путем сочетанного применения лекарственных препаратов и штаммов бактерий Bacillus subtilis. Результаты исследований могут использоваться в научных экспериментах путем ослабления вирулентности патогенных микобактерии с помощью пробиотика, что необходимо для воспроизведения органного туберкулеза у лабораторных животных.