Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Основные особенности систематики представителей рода Serratia 11
1.2 Распространение серраций
1.2 1.3 Биологические свойства серраций
1.4 Антигенное строениеи плазмиды серраций 27
1.5 Чувствительность серраций к антибиотикам 31
1.6 Бактериофаги серраций 35
ГЛАВА 2 Объекты, материалы и методы 37
2.1. Объекты исследования
2.2 Методы микробиологических исследований 44
2.3 Методы статистической обработки результатов 49
ГЛАВА 3 Эпидемиологические особенности серрациозов на территории чр и основные характеристики возбудителей 50
3.1 Особенности эпизоотического процесса при серрациозах мелкого рогатого скотана территории Чеченской Республики 50
3.2 Изучение биологических свойств серраций, выделенных от животных и из объектов окружающей среды на территории Чеченской республики 55
3.3 Особенности биохимических свойств исследуемых штаммов S. marcescens 58
3.4 Изучение способности исследуемых штаммов S. marcescens к продукции факторов вирулентности и биологически активных веществ 68
3.5 Оценка спектра чувствительности исследуемых штаммов S. marcescens к антимикробным препаратам
ГЛАВА 4 Выделение и изучение спектра действия бактериофагов серраций и обоснование их использования для фагоидентификации штаммов S. Marcescens 79
4.1 Исследование основных биологических свойств серрациозных бактериофагов 79
4.2 Изучение спектра действия серрациозных бактериофагов 82
4.3 Разработка параметров ускоренной фагоидентификации штаммов S. marcescens, циркулирующих на территории ЧР 88
Заключение 91
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список литературы
- Чувствительность серраций к антибиотикам
- Методы микробиологических исследований
- Изучение биологических свойств серраций, выделенных от животных и из объектов окружающей среды на территории Чеченской республики
- Изучение спектра действия серрациозных бактериофагов
Введение к работе
Актуальность темы.В последние годы особое внимание специалистов в области ветеринарной микробиологии и эпизоотологии, а также прикладной микробиологии (в биологии, медицине и ветеринарии) привлечено к проблеме условно-патогенных бактерий, их циркуляции в окружающей среде и к вызываемым ими заболеваний людей и животных (Сидоренко С.В., 2001, 2002; Пхакадзе Т.Я. и др., 2009; Livermore D.M., 2012).
Вопросы, связанные с условно-патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae (родов Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Yersinia и др.) и вызываемыми ими инфекций, отнесены к одним из актуальных и приоритетных в современной микробиологии (Пхакадзе Т.Я. и др., 2009; Моторыгин А.В., Ленченко Е.М., 2011; Севастьянова В.М., Раицкая В.И., 2010; Bor D.H. etal., 2013).
Род Serratia является одним из малоизученных среди энтеробактерий, но возрастающая частота выделения представителей этого рода из клинического материала, изучение их этиологической значимости и эпидемиологических закономерностей при этих инфекциях объясняет интерес к поискам надежных эпидемиологических маркеров, которые дали бы возможность сравнительно быстро и точно проводить идентификацию, а также внутривидовую диагностику. С этой целью можно использовать биологические свойства, антигенные особенности, чувствительность к бактериофагам, бактериоцинам, антибиотикам (Гайрабеков Р.Х. и др., 2004, 2008, 2010; Золотухин С.Н., 2007; Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А., 2013; Молофеева Н.И., Васильев Д.А., Золотухин С.Н., 2014; Садртдинова Г.Р., Васильев Д.А., Золотухин С.Н., 2016).
Степень разработанности проблемы. Впервые роль Serratia marcescens в патологическом процессе отмечена еще в 1913 году (цит. по Verral R. 1983). По данным многочисленных авторов при различных заболеваниях, наряду с Serratia marcescens, выделялись S. liquefaciens, S. plymuthica, S. ficaria. Отмечено возрастание удельного веса представителей этого рода при внутрибольничных инфекциях (Pecarrere J.L. et al., 1979; Harden W.B. et al., 1980; Zbinden R., Blass R., 1985; Horwitz H.W. et al., 1987). Серрации выделяют из воды, почвы, пищевых продуктов, а в последнее время с возрастающей частотой и из различного клинического материала (моча, кровь, фекалии, слизь из носоглотки, мокрота, гной из абсцессов и др.), а также от рыб, птиц, рептилий, различных диких и домашних млекопитающих (Беляев В.И., Индюков А.Л., 2008; Калашникова В.А., 2009; Климентова Е.Г. и др., 2011; Моторыгин А.В., Ленченко Е.М., 2011; Lium E.E., 1977; Tan R.J.S., Lim Е., Ishak В., 1978; Muller R.E., 1986; Armstrong P.J., 1984; Hoff G.L., 1984; Dag A.M. et al., 1988; Graves S.L., et al., 1988; Ibiebele D.D., Sakari T.Y., 1989; Young D.R. et al., 1986).
Известны попытки определения сероваров у серраций (Edwards P.R., Ewing W.H., 1972), разработки системы бактериоцинотипирования серраций (Anderhub B. et al., 1977), использования системы из 10 фагов для их идентификации (Pitt T.L. et al., 1980), а также фаготипирования с использованием бактериофагов, выделенных на территории Чеченской республики РФ (Гайрабеков Р.Х., 1990). Данные о каких-либо других методах идентификации серраций в литературе отсутствуют.
Цель исследований. Изучить основные биологические свойства штаммов Serratia
marcescens, выделенных от больных животных и из объектов окружающей среды на
территории Чеченской Республики РФ, в сравнительном аспекте с музейными культурами и разработать параметры ускоренной фагоидентификации возбудителя с помощью выделенных бактериофагов.
Задачи исследования:
-
Изучить этиологическую значимость бактерий рода Serratia в возникновении заболеваний мелкого рогатого скота и распространенность возбудителя в объектах окружающей среды на территории Чеченской Республики.
-
Установить основные биологические свойства Serratia marcescens, выделенных от больных животных на территории Чеченской Республики, определить оптимальные условия культивирования и способность к продукции ими пигмента продигиозина.
-
Провести оценку способности выделенных штаммов серраций к продукции основных факторов вирулентности, а также степени их чувствительности к антимикробным препаратам.
-
Провести сравнительный анализ основных характеристик выделенных на территории Чеченской Республики серраций с музейными культурами, полученными из различных лабораторий России и Украины.
-
Выделить бактериофаги из объектов окружающей среды на территории Чеченской Республики и лизогенных культур серраций и изучить из свойства.
-
Исследовать возможность ускоренной фагоидентификации бактерий рода Serratia, выделенных от больных животных и объектов окружающей среды на территории Чеченской Республики.
Научная новизна. На территории Чеченской Республики выделены от больных животных и из объектов окружающей среды 29 штаммов Serratia marcescens, которые охарактеризованы по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам в сравнительном аспекте с 61 музейными культурами, полученными из различных лабораторий России и Украины. Показаны различия в биохимической активности штаммов, выделенных на территории ЧР, и музейных культур.
Впервые установлено, что выделенным штаммам S. marcescens, циркулирующим на территории Чеченской Республики, присущ комплекс факторов патогенности: 82,75 % штаммов обладали гемагглютинирующей способностью как в отсутствии D–маннозы, так и D–маннозорезистентной; 55,17 % были способны адсорбировать конго красный; антилизоцимная активность выявлена у 86,2 % штаммов в диапазоне от 1 до 6 мкг/мл, способность продуцировать гемолизин – у 51,7 %.
Выделены на территории Чеченской Республики и охарактеризованы серрациозные бактериофаги в сравнительном аспекте с ранее описанной Гайрабековым Р.Х. (1996) группой фагов серраций. Установлено, что все исследуемые фаги относятся к морфологической группе А-1 (фаги сперматозоидальной морфологии с длинным отростком и с сокращающимся чехлом). Показана специфичность данных фагов в отношении штаммов S. marcescens, доказано отсутствие лизиса штаммов S.1iquefaciens и 80 штаммов бактерий различных родов семейства Enterobacteriaceaе.
Отобраны 6 серрациозных бактериофагов, на основе которых разработана экспериментальная система ускоренной фагоидентификации S. marcescens. Высокая степень чувствительности серраций к данным бактериофагам (82,5%), в том числе 26 штаммов (89,6%) из циркулирующих на территории ЧР, позволила сократить сроки идентификации S. marcescens в 2 раза по сравнению с бактериологическим исследованием.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты вносят
существенный вклад в понимание роли S. marcescens как этиологического агента в
возникновении энтеробактериозов и проявления факторов вирулентности серраций в
организме сельскохозяйственных животных. Это позволяет обосновать рациональное
проведение профилактических мероприятий мелкого рогатого скота в хозяйствах ЧР, в том
числе дезинфекции объектов окружающей среды. Выявленная устойчивость серраций к
широкому спектру антибиотиков позволит более адекватно составлять схему
антибиотикотерапии для больных животных.
Предложена экспериментальная система из 6 бактериофагов, которая позволяет проводить ускоренную фагоидентификацию S. marcescens в различном патологическом материале и объектах окружающей среды. Предложенные бактериофаги могут быть использованы в диагностических целях, как в ветеринарной, так и в медицинской практике.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре клеточной биологии, морфологии и микробиологии биолого-химического факультета Чеченского государственного университета при чтении лекций и проведении практических занятий по дисциплинам «Микробиология», «Частная микробиология», «Лабораторная диагностика возбудителей болезней», а также при подготовке курсовых и дипломных работ студентов факультета.
Методология и методы исследования. Методологической основой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам изучения биологических свойств и фагоидентификации бактерий Serratia marcescens. Основу диссертационного исследования составляют системный подход в изучении рассматриваемой проблемы и комплексный анализ. При проведении исследований и изложении материала были применены общенаучные и специальные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и математического анализа.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Анализ эпизоотической ситуации в Чеченской Республике показал высокую
этиологическую значимость Serratia marcescens в возникновении заболеваний мелкого
рогатого скота, проявление которых носило сезонный характер и зависело от факторов
внешней среды и условий содержания молодняка.
-
29 штаммов Serratia marcescens, выделенные от больных животных и объектов окружающей среды на территории Чеченской республики, имели отличия по биохимической активности по сравнению с музейными культурами, полученными из различных лабораторий России и Украины.
-
Штаммы Serratia marcescens, циркулирующие на территории ЧР, характеризуются комплексом факторов вирулентности: обладают антилизоцимной активностью, гемагглютинирующей способностью как в отсутствии D–маннозы, так и D–маннозо-резистентной; продукцией гемолизина и способностью адсорбировать конго красный.
4. Выделенные на территории Чеченской республики штаммы S. marcescens
характеризуются множественной антибиотикорезистентностью к большинству антибиотиков
группы -лактамов, аминогликозидов и макролидов.
5. Бактериофаги серраций, выделенные из лизогенных культур и из объектов
окружающей среды на территории ЧР, относятся к морфологической группе А-1 и являются
специфичными в отношении штаммов S. marcescens.
6. Разработанная система ускоренной фагоидентификации S. marcescens сокращает сроки
исследования материала от больных животных и объектов окружающей среды в 2 раза по
сравнению с бактериологическим методом.
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами.
Диссертационная работа выполнялась в рамках НИР «Изучение факторов патогенности
условно-патогенных бактерий, выделенных при заболеваниях сельскохозяйственных
животных» (2002-2007) и «Разработка методических подходов к фагодиагностике и
фаготипированию условно-патогенных бактерий, выделенных при заболеваниях
сельскохозяйственных животных» (2008-2016) кафедры клеточной биологии, морфологии и микробиологии Чеченского государственного университета. Результаты представлены в промежуточных и заключительных отчетах по НИР.
Степень достоверности и апробация работы. Высокая степень достоверности
результатов проведенных исследований подтверждается применением общепринятых и
современных микробиологических и вирусологических методов, эпизоотологического
мониторинга и обработки информации. В работе использовали оборудование научной
биологической лаборатории и Центра коллективного пользования Чеченского
государственного университета. Использование перечисленных методов и статистический анализ экспериментальных данных обеспечили объективность и достоверность полученных результатов и выводов.
Основное содержание и материалы диссертации доложены на научно – практической конференции «Вузовская наука народному хозяйству» (Грозный, 2002); IV Ежегодной Республиканской научно – практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наука и жизнь» (Грозный, 2010); Всероссийской конференции, посвященной 35– летию образования биолого–химического факультета «Естественные науки на службе общества» (Грозный, 2010); XIII Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Грозный, 2011); ежегодных Республиканских научно-практических
конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых (Грозный, 2009-2013); ежегодных итоговых научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Чеченского госуниверситета (Грозный, 2011-2013); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения» (Саратов, 2014; 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 6 – в журналах из списка, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов и предложений, списка литературы из 317 источников, в том числе 226 иностранных авторов, содержит 19 таблиц и 18 рисунков.
В главе представлен анализ отечественной и зарубежной литературы по основным биологическим особенностям бактерий рода Serratia, их распространенности, морфологии, биохимическим свойствам; характеристике основных факторов патогенности: лизоцимной, антилизоцимной, адгезивной, гемолитической активности. Приведены данные о выделении бактериофагов энтеробактерий, изучения их свойств, доказательства специфичности и использования в целях диагностики; обобщены имеющиеся сведения о фагах серраций.
Чувствительность серраций к антибиотикам
D.R. Young с соавт. (1989) описали случай, когда двум лошадям с расстройством сердечной деятельности и респираторным заболеванием было внутривенно введено из одного флакона по 25 мл раствора, содержащего аминокислоты, витамины, электролиты и декстрозу. Через 10 минут у лошадей появился цианоз, одышка, тахикардия и лихорадка, которые сопровождались мышечной слабостью. Несмотря на симптоматическое лечение, состояние лошадей оставалось тяжелым. На основании лабораторных исследований и клинического наблюдения поставлен диагноз эндотоксического шока, а при посеве крови от больных животных была выделена культура Serratia marcescens, а также установлена контаминация данным микроорганизмом введенного раствора.
В работах E.Gutsohic с соавт. (1980) показано развитие эндокардита укроликовпосле введения им трёх выделенных от больных животных штаммов Serratia marcescens: СДС013, SM104 и SM55. Кроме того, часть кроликов, участвующих в эксперименте, погибла.
D. Lyerly с соавт. (1981) проводили экспериментальное заражение роговицы кролика Serratia marcescens. При введении 6х104 клеток этих бактерий и после внутрироговичной инъекции протеазы отмечали острое воспаление и некроз роговицы. Большая часть изменений, характерных для серрациозного кератита, воспроизведена при введении протеазы, что подтверждает ее роль в развитии данного заболевания.
Интратрахеальное введение высокоочищенной протеазы серраций морским свинкам и мышам вызвало обширный отек легких и геморрагию, сходные с проявлением острой пневмонии, обусловленной Serratia (Lyerly D.M., Kreger A.S., 1983). Морские свинки, предварительно подкожно вакцинированные протеазой серраций, а также мыши, вакцинированные интраназально, имели низкие уровни антипротеазных антител и были частично защищены от пневмонии. В экстрактах легочной ткани животных, погибших от серрациозной пневмонии, обнаруживали протеазу серраций.
В работах S.R.Graves соавт. (1988) показано, что на островах Кракатау и Западной Яве (Индонезия) от диких животных из копрокультур наряду с другими микроорганизмами выделяются представители рода Serratia.
За последние годы в печати появилось много работ, указывающих на возросшую роль условно-патогенных микроорганизмов в различных инфекционных процессах: бактериемия, сепсис, менингит, заражение мочевыводящих путей, эндокардит, пневмония и т.п. (Белокрысенко С.С. и др., 1992; Horowitz H.W. et al., 1987; Darbas H. et al., 1994; Carrero P. et al., 1995; Ursua P.R. et al., 1996; Johnson J.S. et al., 1998; EngelhartS. et al., 2003; Vogel T.R. et al., 2009, 2010; Maziad A.A. et al., 2010; Patel A.L. et al., 2013; Shah B.A. et al., 2014).
Современные знания о врожденных пороках сердца и экспериментальное изучение нарушений функционирования сердечных клапанов во многом помогли достижению понимания основных предпосылок развития эндокардитов. Лечение антибиотиками и непосредственные манипуляции на сердце вызвали изменения в соотношении между микроорганизмами, которые известны как возбудители эндокардитов.
Эндокардит вызывают такие микроорганизмы как -гемолитические стрептококки, -гемолитические стрептококки, кишечные стрептококки, Escherichia coli, Serratia marcescens, нокардии, дифтероиды, нейссерии, Brucella spp., лактобактерии, Bacteroides spp.Эти же микроорганизмы становятся значимым этиологическим фактором в развитии септических процессов и хронических легочных заболеваний. Выделение Serratia marcescens при острых или, чаще, при хронических легочных процессах показывает, что в эпоху широкого применения антибиотиков, кортикостероидов и других лекарственных препаратов, а также современных инвазивных методов и манипуляций многие микроорганизмы в определенных условиях могут вызывать заболевания или же обуславливать развитие вторичной инфекции, признаки которой начинают преобладать в клинической картине (Rosenblatt J.E. et al., 1973; Horowitz H.W. et al., 1987; Potel G. et al., 1991; Juvin M.E. et al., 1994; Bugnon D. et al., 1996; Brouqui P., Raoult D. et al., 2001; Daga Sh. et al., 2011; Mahlen S.D., 2011; Bor D.H. et al., 2013).
Установлено, что Serratia marcescens, сальмонеллы и ряд других микроорганизмов способны вызывать гематогенные остеомиелиты при наличии предрасполагающих факторов – лечения кортикостероидами и цитостатиками, при гемодиализе, остеопорозе, а также у диабетиков, алкоголиков, наркоманов (Нейчев С., 1977). Еще одной причиной развития остеомиелитов, обусловленных данными микроорганизмами, является длительная венозная катетеризация, особенно в сочетании с интенсивной терапией антибиотиками.
В работах Е.Г.Климентова с соавт. (2011) было показано, что у мышей при дисбактериозе, обусловленном длительным применением высоких доз -эндотоксинов Bacillus thuringiensis, в составе микробиоценозов толстой кишки с высокой частотой наблюдается появление условно-патогенных микроорганизмов и гемолитических штаммов Escherihia coli.
А.В. Моторыгиным и Е.М. Ленченко (2011) была проведена сравнительная оценка количественного и качественного состава популяций патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при дисбактериозе кишечника у телят голштинской и черно-пёстрой породы с использованием методов прижизненной и посмертной диагностики. Использование хромогенных сред позволило им провести ускоренную дифференциацию энтеробактерий. Применение щадящих методов фиксации и обезвоживания объектов дало им возможность наблюдать за процессами роста и развития популяций микроорганизмов. К объективным критериям, свидетельствующим о нарушении экологического баланса в биотопе желудочно-кишечного тракта, они относили число и процентное соотношение патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, которые неприхотливы и достаточно быстро растут на обычных питательных средах. Количественный учет лактозонегативных энтеробактерий и бактерий со слабой лактозной активностью служит достоверным способом выявления дисбактериоза кишечника. При этом следует отметить, что в этиологии желудочно-кишечных инфекций телят наиболее значимое место принадлежит представителям родов Salmonella, Serratia, Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providencia (Джупина С.И. и др., 1981; Гутковский А.А., Дворкин Г.А., 1989; Авакаянц Б.М. и др., 2003; Григорьева Г.И. и др., 2003).
Наиболее частой причиной массовой гибели животных, содержащихся в условиях неволи, являются острые кишечные инфекции бактериальной этиологии (Калашникова В.А., 2009).
В настоящее время доказана этиологическая роль при острых кишечных заболеваниях обезьян возбудителей из семейства Enterobacteriaceae – Shigella, Salmonella, Serratia. Анализ результатов параллельных бактериологических исследований показал, что от больных обезьян практически во всех случаях выделялись обычные представители нормофлоры кишечника (Escherihia coli, Enterococcus spp.).
Заболевания желудочно-кишечного тракта ягнят по частоте, массовости и величине наносимого ими экономического ущерба занимают первое место (Севастьянова В.М., Раицкая В.И., 2008). Одной из причин падежа ягнят раннего возраста являются энтеробактериозы, вызванные E.coli, Serratia spp., Proteus spp., Klebsiella spp., характеризующиеся тяжёлой интоксикацией, обезвоживанием организма, проявлениями септического процесса и нервными явлениями. При этом до 50% поголовья от 1 до 15-дневного возраста погибает.
Методы микробиологических исследований
Определение спектра чувствительности исследуемых штаммов S. marcescens к антимикробным препаратам проводили с использованием диско диффузного метода (МУК 4.2.1890-04).Для этого из суточной культуры исследуемого микроорганизма готовили взвесь, которая соответствовала стандарту мутности 0,5 по MсFarland, которую засевали «газоном» на поверхность плотной питательной среды. На поверхность посева помещали стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, концентрации которых соответствуют требованиям ВОЗ. В исследованиях использовали антибиотики, относящиеся к группам -лактамов (природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины), тетрациклинов, аминогликозидов, макролидов, рифампицина, амфеникола и полипептидов. Посевы инкубировалив течение 24 часов, после чего оценивали зоны задержки роста микроорганизмов вокруг дисков, по диаметру которых интерпретировали уровень чувствительности серраций, по которому их относили к чувствительным, с промежуточной чувствительностью и устойчивым к антимикробным препаратам.
Лизоцимную активность исследуемых штаммов бактерий определяли микробиологическим методом согласно МУК 4.2.2602-10. 4.2.
Данный метод основан на регистрации способности лизоцима расщеплять b-(1-4)-гликозидные связи мукополисахаридного комплекса клеточной стенки эталонного тест-штамма Micrococcus luteus var. lysodeikticus. Для проведения анализа в стерильные чашки вносили расплавленную плотную питательную среду, содержащую автоклавированную культуру Micrococcus luteus UBCR 2665 в концентрации 2109 м.к./мл. Исследуемые штаммы Serratia marcescens выращивали на плотной питательной среде в течение 24 часов, а затем засевали по одной посевной петле бляшками (диаметром 2-3 мм) на подготовленную подсушенную плотную среду, содержащую убитую культуру микрококка. На одну чашку наносили не более 5 штаммов, посевы инкубировали в течение 48 часов, после чего регистрировали диаметр зоны лизиса микрококка вокруг выросших макроколоний исследуемых штаммов.
В зависимости от ширины зоны просветления судили о степени лизоцимной активности (низкая – 1-3 мм, средняя – 4- 7 мм, 8 мм и более – высокая).
Исследование антилизоцимной активности проводили по методике О.В. Бухарина и соавторов (1984) на питательном агаре, содержащем лизоцим в концентрации от 1 до 6 мкг/мл. Из суточных культур исследуемых штаммов бактерий готовили взвесь по стандарту мутности 10 Ед (ГИСК им.Тарасевича) и наносили на поверхность подготовленной питательной среды методом бляшек. Посевы инкубировали в течение 24 часов, после чего обрабатывали их парами хлороформа в течение 30 минут. Затем в расплавленный и остуженный до45 0С полужидкий агар вносили по 0,1 мл взвеси тестовой культуры Micrococcus luteus var. lysodeikticus с концентрацией 109 м.к./мл, перемешивали и аккуратно наслаивали на поверхность обработанных посевов серраций. Учет результатов проводили через 24 часа экспозиции по наличию или отсутствию роста тестовой культуры в верхнем слое агара вокруг бляшек исследуемых штаммов Serratia marcescens.
Адгезивную активность исследуемых штаммов Serratia marcescens определяли в соответствии с МУК 4.2.2602-10. 4.2. в реакции гемагглютинации с 3% взвесью эритроцитов барана в присутствии D-маннозыи без неё. Для этого из тщательно отмытых эритроцитов готовили взвесь в стерильном физиологическом растворе. Из суточных культур исследуемых штаммов серраций готовили взвесь по стандарту мутности 10 Ед (ГИСК им.Тарасевича). В лунки планшет с U-образным дном помещали по 0,1 мл взвеси эритроцитов и исследуемой культуры бактерий, аккуратно перемешивали и помещали в термостат. Предварительный учет результатов проводили через час, окончательный – через 18 часов. При наличии адгезивыных свойств у бактерий на дне лунки формировался «зонтик», при отсутствии – «пуговка». Для определения маннозочувствительной или маннозорезистентной адгезии в лунки к смеси эритроцитов и исследуемых микроорганизмов добавляется 1% раствор D-маннозы. В случае маннозочувствительной гемагглютинации наблюдалось оседание эритроцитов в виде «пуговки» на дне лунки, положительная реакция гемагглютинации в присутствии D-маннозы рассматривалась как наличие у бактерий D-маннозорезистентной адгезивной активности.
Об адгезивной активности штаммов судили также при учете способности колоний адсорбировать краситель конго красный, которую определяли при выращивании бактерий на 1,5% казеиново-дрожжевом питательном агаре с 0,01% конго красного. Результаты учитывали через 18-24 часа (ChambersC.E., StockmanS.L., NieselD.W., 1985).
Гемолитическую активность бактерий выявляли на питательном агаре с добавлением 3-5% отмытых эритроцитов кролика по «Методическим рекомендациям №28.-6/7(1987)». Для этого взвесь эритроцитов добавляли к расплавленному и охлажденному питательному агару, аккуратно перемешивали и разливали в стерильные чаши Петри. После застывания и подсушивания питательной среды на ее поверхность осуществляли посев взвеси исследуемых штаммов Serratia marcescens. Посевы инкубировали в течение 24 часов и учитывали результаты по величине зон гемолиза, образующихся вокруг колоний бактерий.
Изучение биологических свойств серраций, выделенных от животных и из объектов окружающей среды на территории Чеченской республики
Проведенный нами анализ позволил сделать заключение, что возникновению и течению этих заболеваний у ягнят чаще всего способствовали факторы внешней среды: резкие колебания температуры, повышенная влажность воздуха, интенсивная инсоляция и др. К этим факторам добавлялись и технологические особенности овцеводства, накопление молодняка, концентрация поголовья, ухудшение санитарного состояния овцеводческих ферм, пониженная естественная резистентность животных, снижение уровня кормления и смена типа корма (корма, содержащие недостаточное количество витаминов, питательных веществ и др.).
Зачастую вода и корм могут быть инфицированы патогенными или условно-патогенными бактериями и соответственно служить источником заболевания животных.
Приведенные нами сведения о широком распространении, стационарном характере неблагополучия хозяйств в республике явилось объективным основанием для признания больных и переболевших серрациозом животных в качестве основного источника возбудителя.
При анализе эпизоотической ситуации в ЧР важную роль играет не только выделение культур и установление их видовой принадлежности, а также необходимость доказательства, что именно эти культуры являются возбудителями данных заболеваний, потому что обладают определенным набором факторов, определяющих их вирулентность. Большую практическую значимость представляла разработка методов маркирования серраций, а также определение чувствительности выделенных бактерий к антибиотикам с целью установления схем антибиотикотерапии для заболевших животных по отношению к штаммам, циркулирующим на территории Чеченской Республики
При бактериологических исследованиях фекалий и мочи больных энтеробактериозом овец и коз разных возрастов и категорий и объектов окружающей среды (ООС) были выделены штаммы S. marcescens: 23 – от больных животных; 6 – из подстилок и из воды в поилках в животноводческих хозяйствах.
Из фекалий больных животных были выделены также 187 штаммов Escherichia coli и 123 – Enterobacter cloacae.
Все выделенные штаммы S. marcescens имели типичную морфологию колоний при росте на питательных средах, при микроскопии окрашенных мазков из этих колоний выявлялись беспорядочно расположенные грамотрицательные палочки средней величины. При культивировании исследуемых бактерий на среде Пешкова наблюдался диффузный рост. Ни один из выделенных штаммов пигментобразованием не обладал (рис. 4, А). Выделенные серрации хорошо росли при температуре 370С, за исключением S. marcescens № 18, который хорошо развивался при комнатной температуре, а при температуре 370С его рост полностью ингибировался.
Изучение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств музейных штаммов серраций, полученных из различных лабораторий России и Украины, не выявило принципиальных отличий между музейными и выделенными нами культурами от больных животных и ООС ЧР, за исключением способности музейных штаммов при росте на питательных средах выделять красно-розовый пигмент – продигиозин (рис. 4 Б). Данная способность отмечена для 15 музейных штаммов №№ 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 53 (табл. 6). На рисунке 5 представлен сравнительный анализ способности к образованию пигмента у музейных культур и выделенных на территории ЧР штаммов серраций. Б Рисунок 4 – Рост S.marcescens на 1,5 % питательном агаре: А – штамм S.marcescens № 18, выделенный на территории ЧР; Б – музейный штамм S.marcescens № 38 Таблица 6 – Пигментообразование у серраций
Группа штаммов Число штаммов Числопигментообразующих штаммов Процентпигментообразующихштаммов Музейные культуры 61 15 24,59 Выделенные от больных животных и из ООС ЧР 29 0 0 Всего 90 15 16,66 Рисунок 5 –Сравнительный анализ способности к образованию пигмента у музейных культур и выделенных на территории ЧР штаммов серраций 3.3 Особенности биохимических свойств исследуемых штаммов серраций
Для детального анализа биологических свойств выделенных серраций и выявления их особенностей представляло интерес провести сравнительный анализ их биохимических свойств с музейными штаммами S. marcescens с использованием СИБов. Результаты исследований представлены в таблице 7.
Изучение спектра действия серрациозных бактериофагов
Выделение фагов, активных в отношении штаммов S.marcescens, осуществлялось из лизогенных культур и источников окружающей среды. На лизогенность были проверены отдельно музейные культуры (57) и штаммы серраций, выделенные от больных животных и из различных источников окружающей среды ЧР (29 штаммов).
Из источников окружающей среды нам не удалось выделить бактериофаги, активные по отношению к 29 культурам, выделенным на территории ЧР. Испытание всех 29 штаммов, выделенных от больных животных и из ООС и как «лизогенных», и как индикаторных, позволило отобрать из выделенных нами бактериофагов для дальнейших исследований умеренный бактериофаг 11/17.
Данный бактериофаг 11/17 образовывал на чувствительной культуре негативные колонии с ровными краями, прозрачные без вторичного роста, диаметром 2-3мм. Фаг 11/17 был подвергнут электронномикроскопическому исследованию (рис. 17).
Полученные результаты позволили установить, что выделенный бактериофаг имел сперматозоидальную морфологию, т.е. состоял из головки и отростка. Головка имела в проекции гексагональную форму. Диаметр головки находился в диапазоне 50±2 нм, длина грани головки составляла 25-30 нм. Отросток бактериофага был прямым, длина его колебалась в пределах 80-85 нм, он был покрыт сокращающимся чехлом, диаметр отростка находился в пределах 10-17 нм. Толщина стержня отростка составляла 5±0,5 нм. По своей морфологии выделенный нами фаг 11/17 может быть отнесен к морфологическому типу А1 по классификации Ackermann и Reanney (1974). Электронная микрофотография бактериофага серраций 11/17 (негативное контрастирование препарата фосфорновольфрамовой кислотой, 168000)
Для характеристики выделенного нами бактериофага были изучены его основные биологические свойства и устойчивость к действию инактивирующих агентов.
Устойчивость фага к действию инактивирующих факторов. Была изучена чувствительность выделенного нами бактериофага 11/17 к действию температуры. Для этого концентрированную суспензию исследуемого бактериофага подвергали воздействию температур 45, 50, 55, 60С в течение 10 минут. Оценку сохранения литической исследуемого фага проводили по методу «стекающей капли» на чувсвительной культуре S. marcescens следующим образом: на поверхность 1,5 % питательного агара в чашках Петри засевали «газоном» суточную бульонную культуру S. marcescens. Посевы подсушивали в термостате 15-20, затемделили чашку на два сектора, и на поверхность посевапипеткой наносили термически обработанную суспензию бактериофага, наклоняя чашку Петри таким образом, чтобы капля стекла. На вторую половину чашки аналогично наносили капля мясо-пептонного бульона для контроля. Посевы инкубировали в условиях термостата при температуре 37 0С в течение 18-24 часов. Результаты учитывали по наличию зон лизиса на «газоне» S. marcescens, что свидетельствовало о наличие бактериофага. Полученные результаты представлены в таблице 13. Было установлено, что воздействие температуры 45-50 0С в течение 10 минут не оказывала на бактериофаг 11/17 инактивирующего действия.
Для оценки спектра действия использовали выделенный нами бактериофаг 11/17 и 16 бактериофагов, выделенных и охарактеризованных ранее Гайрабековым Р.Х. (1996): №№ 30/23, 3/3, 5/5, 12/12, 17/23, 20/20, 23/23, 24/24, 25/25, 26/26, 27/21, 28/23, 31/23, 32/23, 2/5, 29/10. Для оценки специфичности исследуемых фагов использовали 90 штаммов бактерий рода Serratia, из которых 86 относились к виду S.marcescens, 4 штамма – S.1iquefaciens, а также 80 штаммов, относящихся к другим родам семейства Enterobacteriaceae: р. Escherichia spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Hafnia spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Yersinia spp.
Для проведения исследования готовили суточную бульонную культуру исследуемого штамма микроорганизмов, которую засевали «газоном» на поверхность плотной питальной среды, подсушивали в термостате в течение 15-20 минут, а затем на заранее подготовленные сектора наносили по 1 капле суспензии соответствующего бактериофага (не более 5-6 вариантов на одной чашке Петри). Чашки инкубировали в течение 24 часов, после чего учитывали результаты.
Было установлено, что все исследуемые бактериофаги вызывали лизис 86 штаммов S. marcescens, и не лизировали 4 штамма S. 1iquefaciens и штаммы, относящиеся к другим родам сем. Enterobacteriaceae (табл. 14). Полученные результаты позволяют судить о высокой специфичности исследуемых бактериофагов в отношении S. marcescens. Из 86 штаммов S. marcescens исследуемые бактериофаги вызывали лизис 70 штаммов, из которых 44 штамма относились к музейным, а 26 были выделены от больных животных и из ООС на территории ЧР (табл. 15). Таблица 14 – Спектр действия исследуемых бактериофагов серраций Бактерии Число штаммов Число фагочув-ствительныхштаммов % фагочувстви-тельных штаммов Serratia marcescens 86 70 81,4 Serratia liquefaciens 4 - Escherichia spp. 10 - Salmonella spp. 10 - Klebsiella spp. 10 - Citrobacter spp. 10 - Hajhia spp. 10 - Proteus spp. 10 - Enterobacter spp. 10 - Yersinia spp. 10 - Таблица 15 – Чувствительность исследуемых штаммов S.marcescens к бактериофагам Группа штаммов Количество штаммов Фагочувствительные штаммы число в % Музейные культуры 57 44 77,19 Выделенные от больных животных и из ООС ЧР 29 26 89,65 Всего 86 70 82,56 Установлено, что частота лизиса исследуемыми фагами штаммов серраций, выделенных от больных животных и из ООС достоверно выше, чем музейных (p0,001). Для характеристики спектра действия фагов определяли долю чувствительных к каждому фагу штаммов от общего числа фагочувствительных культур, т.е. индекс спектра действия (табл. 16). Выявлено, что изученные бактериофаги характеризуются различным диапазоном спектра действия по отношению к штаммам S. marcescens: так фаг 26/26 лизировал только 18 штаммов из 86 (20,9%), а фаг 32/23 – 36 штаммов (62,8%). Таблица 16– Индексы спектра действия серрациозных бактериофагов