Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 18
1.1. Краткий обзор о бруцеллезной инфекции 18
1.2. Распространение бруцеллеза .21
1.3.Экономическое значение бруцеллеза 24
1.4. Специфическая профилактика бруцеллеза 26
1.5. Открытие новых вакцин и их применение .32
1.6. Механизм действия ДНК-вакцин 35
1.7. Иммунный ответ, вызванный ДНК-вакцинами 36
1.8. Методы трансфекции ДНК-вакцины и ее совершенствование .39
2. Собственные исследования 43
2.1. Материалы и методы исследований 43
2.1.1. Получение антигена 43
2.1.2.Выделение ДНК и ПЦР-анализ 44
2.1.3.Экстракция ДНК из агарозного геля 45
2.1.4. Секвенирование .45
2.1.5. Клонирования .46
2.1.5.1.Расщепление рестриктазой 46
2.1.5.2. Лигирование вектора со вставкой .48
2.1.5.3.Трансформации E.coli 49
2.1.5.3.1. Приготовление чашек Петри с LB-агаром и канамицином 49
2.1.5.3.2. Подготовка компетентных клеток 49
2.1.5.3.3. Пересев бактерий после трансформации на чашки Петри 50
2.1.5.4. Анализ клонов методом ПЦР .50
2.1.5.5. Выделение плазмидной ДНК 51
2.1.5.6. Создание бактериального музея для длительного хранения плазмид 52
2.1.5.7. Выделение плазмиды в препаративных количествах и измерение концентрации и чистоты ДНК .52
2.1.6. Экспериментальные испытания на морских свинках 53
2.1.7. Статистический анализ 54
2.2. Результаты исследований 55
2.2.1. Характеристика штамма Brucella melitensis Rev-1. Культивирование и биохимическая идентификация 55
2.2.2. Получения антигена для молекулярно-генетических исследований 57
2.2.3. Выделение ДНК и ПЦР-анализ 59
2.2.4. Выделения ДНК из агарозного геля и секвенирования 60
2.2.5. Расщепление рестриктазой и Лигирование вектора со вставкой 63
2.2.6. Трансформации в E.coli XL1 65
2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК 68
2.2.8. Антигенная и иммуногенная активности рекомбинантной ДНК оmp31, р39, sp41 69
2.2.9. Влияние на пролиферативную активность и иммунокопетентных клеток у лабораторных животных 75
2.2.10. Определения фагоцитарной активности лейкоцитов 76
3.Обсуждение полученных результатов 79
4. Выводы 88
5. Рекомендации по использованию научных выводов 89
6. Перспективы дальнейшей разработки темы 89
7. Список литературы 90
8. Приложения 116
- Краткий обзор о бруцеллезной инфекции
- Методы трансфекции ДНК-вакцины и ее совершенствование
- Характеристика штамма Brucella melitensis Rev-1. Культивирование и биохимическая идентификация
- Определения фагоцитарной активности лейкоцитов
Краткий обзор о бруцеллезной инфекции
Болезнь, которую мы теперь знаем как бруцеллез, была впервые обнаружена в 1850-х годах на Мальте. Это стало известно британским медицинским работникам, работавшим на острове после Крымской войны [194].
Бруцеллез — хронически протекающая инфекционная болезнь всех видов животных и человека, проявляющаяся часто абортами, задержанием последа, эндометритами, артритами, орхитом, расстройством воспроизводительной функцией и другими органными и системными нарушениями и имеет тенденцию к широкому распространению при скоплении животных [174], вызванный бруцеллой, родом грамотрицательных бактерий. [109], Бруцелла неподвижна, не образует спор при определенных условиях, принимает различные формы и размеры, а также способна образовывать капсулы [37]. .Род Brucella включает девять различных видов, которые вызывают заболевания у различных видов животных и людей: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. neotomae, B. ovis, B. canis, B. ceti, B. pinnipedialis и B. microti [42].
B. melitensis (овцы и козы) является наиболее важным зоонозным агентом; за ним следуют B. ovis (овцы), B. abortus (крупный рогатый скот), B. suis (свиньи) и B. canis (собаки) [93]. Бруцеллы рассматриваются как объект угрозы биологического террора категории B, который вызывает вывод из строя воинского контингента и поражение гражданского населения [113].
Это заболевание протекает в нескольких клинических формах (острый, подострый, первично и вторично хронический) [5]. Занос бруцеллеза в благополучные хозяйства чаще всего происходит с больными животными или переболевшими – бруцеллоносителями при несоблюдении правил карантинирования [46]. Передача заболевания часто происходит при обращении с домашним скотом, а также при приеме непастеризованного молока и сыра, имеют повышенную инфекционность при аэрозолизации [182] или через прямой контакт с тканями больных животных и плода [56]. Виды бруцелл используют уреазу для выживания в тяжелых желудочных условиях при желудочно-кишечной инфекции [48].
Понимание биологии и молекулярных механизмов бруцеллезных инфекций имеет первостепенное значение при осуществлении любой программы борьбы с бруцеллезом или ее ликвидации у животных и может способствовать поиску новых подходов к созданию эффективных инструментов для профилактики бруцеллеза [95, 24].
Бруцеллы являются факультативными внутриклеточными патогенами, которые способены выживать и размножаться в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках, таких как трофобластные и эпителиальные клетки [84]. Установлено, что бруцеллы могут локализоваться и сохранять жизнеспособность в лимфатических узлах (9 %), печени (22 %), сердце (18 %), селезнке (28%) и половых органах (23 %) [10] и изучение свойств бруцелл показало, что существует связь между его вирулентностью, иммуногенностью и морфологией, S-форма более иммуногенна, чем R-форма [1].
Липополисахарид (LPS) бруцелл является важным фактором вирулентности и может вызывать выработку защитных антител [60]. Вирулентность бруцелл зависит от его способности проникать и колонизировать клетки, в которых он размножается, и генетическая основа этого аспекта плохо изучена [201]. Бруцеллы демонстрируют сильный тканевый тропизм для лимфо-ретикулярной и репродуктивной систем с внутриклеточным образом жизни, который ограничивает воздействие врожденных и адаптивных иммунных реакций и воздействия антибиотиков [156].
Диагностика бруцеллза является сложной задачей из-за того, что точная идентификация вида невозможна ни с одним из доступных в настоящее время серологических методов диагностикии и иммунологические реакции у заражнных особей и устойчивость к инфекции одинаковы [190, 6, 50].
В серологических тестах для диагностики бруцеллеза, например, наиболее широко используемым является тест Розбенгала (РБ), реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФA) котороые рекомендованы МЭБ [12, 4, 39], в которых в качестве диагностического антигена обычно используют гладкие липополисахариды (S-LPS), который может давать ложноположительные рузельтаты на вакцинные антитела [108] и реакцию лейкоцитолиза (РЛ) для выявления сенсибилизации лейкоцитов крови и слюны при бруцеллезе [36] .Также существует диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [25] и новый метод выявления специфических маркеров возбудителя бруцеллеза в крови пациентов с клиническим диагнозом острого бруцеллеза методом MALDIOF MS, который подтвержден данными масс-спектрометрии белковых экстрактов культур для целей межвидовая дифференциация штаммов возбудителей бруцеллеза, имеющих клиническое значение [ 40].
Поэтому необходимо разработать более современные методы исследования, позволяющие дифференцировать поствакцинальный иммунитет от малосимптомного течения хронического бруцеллеза [ 31].
Бруцелла обладает множеством механизмов вирулентности, которые предотвращают обнаружение [137].
Методы трансфекции ДНК-вакцины и ее совершенствование
Для повышения эффективности ДНК-вакцин был применен широкий спектр инновационных методов и различных экспериментальных стратегий. Они включают в себя различные стратегии, улучшающие доставку ДНК, а также экспрессию и иммуногенный потенциал белков, кодируемых ДНК-вакцинами [178].
Для улучшения ДНК-вакцин были предприняты попытки повысить их эффективность с помощью эффективных векторов и систем доставки вакцин, которые сочетают в себе способ доставки и состав. У животных ДНК-вакцины оказываются менее эффективными из-за импеданса хозяина, неправильной трансфекции и низкого уровня экспрессии. Но различные составы и пути доставки могут усиливать иммунный ответ. Были найдены полезными способы доставки, такие как суппозитории, безыгольная инъекционная система, доставка через слизистую оболочку и местное применение [131, 154].
Важные этапы оптимизации, которые повышают эффективность трансфекции ДНК, включают введение ДНК-комплексообразующих наноносителей, направленных напредотвращение деградации внеклеточной ДНК, обеспечение нацеливания антигенпрезентирующих клеток (АРС) и усиление эндо-лизосомального выхода ДНК [104].
Продуктивная трансфекция требует, чтобы внеклеточная ДНК проникала через плазматическую мембрану, проходила через цитоплазму, проникала в ядро, транскрибировалась и экспортировала полученную мРНК в цитоплазму для трансляции и окончательной модификации и локализации экспрессированного белка [59]. В доклинических моделях было решено множество различных стратегий для решения этой проблемы, включая новые плазмидные векторы и кодонную оптимизацию для усиления экспрессии антигена, новые системы генной трансфекции или электропорацию для повышения эффективности доставки, схемы усиления белка или живого вирусного вектора для максимальной иммуностимуляции, и составление ДНК-вакцин с традиционными или молекулярными адъювантами [123]. Применение улучшенных векторов, продукции свободных от антибиотиков плазмид и экономически эффективных технологий производства будет иметь решающее значение для обеспечения безопасности, эффективности и экономически жизнеспособного производства ДНК-вакцин, которые в настоящее время разрабатываются, для показаний на инфекционные заболевания, рак, аутоиммунитет, иммунотолерантность и аллергию [191].
Подкожный (SC), внутрикожная (ID) и внутримышечная (IM) инъекция различных тканей адаптирует иммунный ответ на вакцинацию ДНК, при которой ДНК, вводимая IM с электропорацией (EP), стимулирует сильные ответы IFN- и мощное вирусное ингибирование, ID + IM без EP привел к подобной схеме ответа, но более низкой величины. В отличие от этого, SC + IM (без EP) сдвигал ответы в сторону более доминирующего Th-17 фенотипа, связанного с защитой слизистой оболочки и эпидермиса [102]. Также использование электропорации в качестве метода доставки ДНК, может быть использовано для усиления иммунных реакций. [121]. Одним из подходов является разработка интраназальной ДНК-вакцины от респираторных инфекций для повышения эффективности доставки ДНК [195].
Чтобы оценить выполнимость этой вакцинной композиции, она была протестирована вместе с адъювантами, а именно с квасцами, иммуваком, монтанидом. Усиленный иммунный ответ коррелировал с высоким титром антител IgG, смещенным ответом Th2 и соотношением IgG1 / IgG2a 1, наблюдаемым при добавлении квасцов в ДНК-вакцину [91, 157]. Для усиления экспрессии ДНК in vivo и для усиления антигенспецифических адаптивных иммунных ответов использовали линейные полиэтилениминовые (PEI) полимеры, комплексированные с плазмидной ДНК. Функциональные исследования PEI-ДНК-индуцированных CD8 + T-клеточных ответов продемонстрировали, что состав ДНК с PEI был связано с увеличением количества клеток, секретирующих цитокины типа I. Кроме того, комплексы PEI-ДНК улучшали антиген-специфические Th1--хелперные клетки и гуморальные ответы [99]. Полирибоцитидиловая кислота (poly-IC) служит адъювантом, позволяющим белку-мишени DC индуцировать защитные ответы CD4 + T-клеток на поверхности слизистой оболочки [185].
Эффективность трансфекции вектора обратно пропорциональна размеру вектора. При увеличении длины вектора до 1869 пар оснований эффективность нокдауна на моль трансфицированной ДНК увеличивалась, а затем уменьшалась с увеличением длины вектора [105].
Использование ДНК-вакцин, которые кодируют антигены, нацеленные на дендритные клетки (ДК), в качестве стратегии для повышения иммуногенности, так как она улучшает ответы как антител, так и CD4 + Т-клеток [196,199]. Кроме того, нацеливание антигена на DC является эффективной стратегией для повышения иммунитета против многоэпитопного иммуногена, особенно в контексте ДНК-вакцинации. [55].
Прямая инъекция плазмидной ДНК, кодирующей выбранный антиген, в мышцу или кожу мыши приводит к экспрессии генного продукта и вызывает иммунный ответ против интересующего антигена, но вакцинация внутрикожной электропорацией приводила к трансфекции различных слоев кожи, а также мононуклеарных клеток и приводит к заметному рекрутированию реактивных инфильтратов в основном через 6–24 часа после обработки, а воспалительные клетки включали CD11c + [120].
Электропорация (EP) на живом организме способствует локальной миграции антигенпрезентирующих клеток, которая усиливается за счет кодирования жизни вакцины, а связь EP с обычным путем внутримышечного введения способствует более эффективной активации CD8 + T-клеток с многофункциональной и эффекторной памятью с повышенной цитотоксической активностью [164].
Итак, технология генетических вакцин была значительно развита за последние два десятилетия. Эта экономически эффективная и многообещающая стратегия может быть применена для лечения рака и для лечения аллергии, хронических и инфекционных заболеваний, таких как сезонный и пандемический грипп. Несмотря на многочисленные преимущества, некоторые ограничения этой технологии снижают ее производительность и могут замедлять ее коммерческое использование на людях и в ветеринарных применениях. Неэффективная доставка ДНК-вакцины в клетки иммунизированных индивидуумов приводит к низкому внутриклеточному снабжению подходящих экспрессионных кассет, кодирующих антиген, к его низкому уровню экспрессии и, в свою очередь, к снижению иммунных ответов против антигена. Улучшение доставки ДНК в клетки-хозяева может значительно повысить эффективность ДНК-вакцины [178].
Тем не менее, ДНК-вакцины являются относительно новыми подходами к вакцинации, и их еще предстоит одобрить для использования. Долгосрочная безопасность их применения должна быть тщательно оценена для рутинного профилактического и терапевтического применения, особенно когда в состав вводятся новые системы доставки или адъюванты.
Характеристика штамма Brucella melitensis Rev-1. Культивирование и биохимическая идентификация
В работе использовали производственный штамм Brucella melitensis - Rev 1, предназначенный для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота и инфекционного эпидидимита баранов любезно представленный ООО «Агровет». Все работы со штаммом выполнялись на производственной базе ООО «Агровет». Штамм обладал типичными для бруцелл морфологическими, биохимическими, серологическими и патогенными (остаточная вирулентность) свойствами. Вскрытие флакона и проверка свойств бруцелл штамма Rev-1.
Для получения культуры первой генерации ампулу с сухой стандартной культурой протирали спиртом, обжигали над пламенем спиртовки и регидратировали до исходного объема стерильной дистиллированной водой. Полученную взвесь пастеровской пипеткой переносили в пробирку с 4,5 см3 стерильного физиологического раствора. Из разведенной культуры делали последовательные десятикратные разведения от 10-1 до 10-5, используя для каждого разведения отдельную пипетку. Взвеси двух последних разведений рассевали на чашки Петри и в пробирки с бруцелла агаром, средой Альбими и на сывороточно-декстрозный агар. Питательные среды предварительно были проверены на ростообеспечивающие свойства.
Посевы инкубировали при температуре (37-38) оС в течение 4-5 суток и учитывали количество выросших колоний.
На питательных средах отмечали типичный рост бруцелл в виде мелких выпуклых прозрачных колоний. Провели определение культур на диссоциацию пробу с акрифлавином и окраска колоний по методу Уайт-Вильсона, на питательных средах не отмечали диссоциированных колоний, культура находилась в S-форме.
Колонии в S-форме пересевали на плотную питательную среду, скошенную в пробирках и чашках Петри. Типичность роста представлена на рис. 1.
Микроскопия. Для приготовления мазков брали чистые обезжиренные предметные стекла, наносили на них каплю стерильного физиологического раствора хлористого натрия и в ней размешивали бактериологической петлей культуры бруцелл. Мазки подсушивали на воздухе, фиксировали над пламенем спиртовки и окрашивали по Козловскому. На мазки наносили доведенный до кипения 2%-ный водный раствор сафранина, красили в течение 3-х минут, промывали дистиллированной водой и докрашивали 1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 30 секунд. Краску смывали дистиллированной водой, мазки подсушивали фильтровальной бумагой и просматривали под микроскопом.
Бруцеллы окрашивались в красный цвет и представляли собой мельчайшие бактерии шаровидной, овоидной или незначительно удлиннной формы размером от 0,3…0,5 до 0,6…1,5 мкм.
Определения фагоцитарной активности лейкоцитов
Из свежей периферической крови выделяли моноциты и нейтрофилы на градиенте плотности фиколпак, затем трехкратно промывали в среде 199, содержащая гепарин и антибиотики. Полученную суспензию клеток ресуспендировали в среде 199, содержащую фетальную сыворотку и глютамин, и помещали на лед на 40-30 минут для предотвращения адгезии фагоцитов на стекле. В чашку Петри с помещенными в них покровными стеклами вносили по 1 см3 суспензию моноцитов в охлажденной среде 199 (концентрация моноцитов 5х103), тщательно перемешивали и инкубировали при 37 С в течение 60 мин. По окончании инкубации на покровные стекла вносили 200 мкл суспензии инактивированных прогреванием S. aureus в концентрации 109 КОЕ/см3, чтобы соотношение моноцитов и микробных клеток составляло не менее 1:50. Инкубировали при 37 С в течение 40 мин. По окончании инкубации стекла с прикрепившимися к ним моноцитами трижды промывали теплым физиологическим раствором, высушивали в течение 15-20 мин, фиксировали в этаноле и вновь высушивали. Стекла с фиксированными клетками окрашивали разведенным в 10 раз дистиллированной водой азур-эозином в течение 30-40 минут, трижды промывали дистиллированной водой от остатков краски и подсушивали. Микроскопию мазков проводили с использованием бинокулярного микроскопа Lenovo с иммерсионным объективом хЮО и окуляром х10.
В мазках подсчитывали не менее 100 фагоцитов. Фагоцитарную активность клеток оценивают по двум показателям: активности фагоцитоза (ФА) - отображает процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их количества, вычисляли по формуле:
в где а - количество клеток, вступивших в фагоцитоз;
в - общее количество всех подсчитанных фагоцитов фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее количество поглощенных бактерий в отдельном фагоците, вычисляли по формуле: С где С - общее количество микробных клеток, поглощенных фагоцитами;
Е - количество клеток, вступивших в фагоцитоз.
Динамика изменения показателей фагоцитоза после иммунизации и заражения достоверно возрастало количества фагоцитирующих клеток крови в 2-3 раза, по сравнению с исходными данными. Динамика изменения ФИ была аналогична таковой для ФА. При этом характер их изменений у иммунизированных и контрольных животных после заражения существенно достоверно отличались высокой активации фагоцитирующих клеток у иммунизированных животных.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об усилении фагоцитарной активности клеток крови иммунизированных животных как ДНК антигенами, так и живой вакциной.