Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения о лейкозе крупного рогатого скота 11
1.2. Роль системы нейтрофильных гранулоцитов в иммунном гомеостазе 19
1.3. Значение теста восстановления нитросинего тетразолия для изучения функциональной активности лейкоцитов 23
1.4. Заключение к обзору литературы 31
2. Собственные исследования 33
2.1. Материалы и методы исследований 33
2.2. Эпизоотическая обстановка по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области 36
2.2.1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в сельхозпредприятиях Крутинского района Омской области 42
2.3. Разработка способа определения общей окислительно восстановительной активности нейтрофилов при лейкозе крупного рогатого
скота 47
2.3.1. Определение чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к различным концентрациям левамизола в тесте с нитросиним тетразолием 48
2.3.2. Сравнительное испытание воздействия левамизола и других активаторов на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте 49
2.3.3. Сравнительное испытание метаболической активности нейтрофилов у здорового и инфицированного ВЛКРС крупного рогатого скота 53
2.4. Оценка функционально-метаболической активности нейтрофилов у молодняка крупного рогатого скота, родившегося от инфицированных коров-матерей 57
2.5. Оценка функционально-метаболической активности нейтрофилов у коров частного и общественного сектора 60
2.6. Сравнительная оценка метаболизма нейтрофилов по реакции хемилюминесценции и восстановления нитросинего тетразолия у крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС 62
2.7. Испытание способа определения окислительно-восстановительной активности нейтрофилов при лейкозе крупного рогатого скота в производственных условиях 65 заключение 68
Список сокращений и условных обозначений 78
Список литературы
- Роль системы нейтрофильных гранулоцитов в иммунном гомеостазе
- Заключение к обзору литературы
- Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в сельхозпредприятиях Крутинского района Омской области
- Сравнительное испытание метаболической активности нейтрофилов у здорового и инфицированного ВЛКРС крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен во многих странах мира, особенно часто он встречается в Северной и Южной Америке, некоторых странах Азии, Ближнего Востока, Восточной Европы, а также Российской Федерации. Несмотря на определенные усилия в борьбе против этого заболевания в нашей стране лейкоз прочно занимает первое место в структуре инфекционных патологии на протяжении последних 20-и лет (И.М. Донник, 2013; М.И. Гулюкин с соавт., 2015; K. Murakami et al., 2011; S.M. et al., 2011; M. Rola-Luszczak et al., 2013). При этом значительный экономический ущерб наносимый лейкозом заключается в снижении мясной и молочной продуктивности инфицированных и больных животных, потере их племенных качеств, преждевременной выбраковкой высокопродуктивных коров, в затратах на проведение ежегодных комплексных диагностических исследований поголовья, в ограничениях при реализации племенного молодняка и др. (Ю.П. Смирнов с соавт., 2015; С.В. Тимошина, О.Б. Бадеева, 2016).
Как показывают экспериментальные данные, врожденная или приобретенная иммунологическая недостаточность рассматривается как фактор, предрасполагающий к возникновению злокачественных новообразований, в частности лейкозов крупного рогатого скота, и облегчающий их развитие (В.М. Бергольц с соавт., 1978; В.П. Шишков, 1985; П.Н. Смирнов, 2007).
Решающее значение иммунных механизмов в развитии и течении лейкоза убедительно доказано результатами обширных экспериментальных исследований в значительной мере раскрывших природу клеточного и гуморального иммунного ответа организма. Касаясь проблемы сопротивляемости животных к инфекционным агентам, в том числе вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), следует обратить внимание на то, что она зависит не только от способности организма формировать специфический иммунный ответ, но и от факторов естественной резистентности. Изучение ряда параметров неспецифической иммунологической реактивности у животных, больных лейкозом, показало, что они могут существенно изменяться под влиянием возникшего заболевания и в свою очередь усугублять тяжесть состояния больного (В.М. Бергольц с соавт., 1978; Г.А. Гаврилова, С.В. Бахметьева, 2005; Г.А. Симонян с соавт., 2009; М.П. Семененко, Н.Ю. Басова, Е.В. Кузьминова, 2011).
Важным показателем естественной неспецифической резистентности организма является функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза в очаге воспаления и нейтрализацию инфекционных агентов. Одна из значимых их особенностей - генерация активных форм кислорода, от чего зависит эффективная внутриклеточная гибель микробов, поглощенных фагоцитами. Информативный и наиболее объективный метод, отражающий итоговую реакцию этой ключевой ферментной системы, -тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест).
Неоднозначность и ограниченность существующих сведений о состоянии внутриклеточной ферментной системы лейкоцитов при лейкозе крупного рогатого скота указывает на малоизученность проблемы и создает предпосылки для
более детальных исследований в данном направлении. В связи с этим представляется весьма актуальным установление роли и значения нейтрофильных лейкоцитов и компонентов их бактерицидной системы в сложных патогенетических механизмах развития лейкозного процесса.
Степень разработанности проблемы. Иммунная функция нейтрофилов при инфекционных заболеваниях главным образом ассоциируется с фагоцитозом. В большинстве научных работ, в которых отражены показатели фагоцитарной активности у крупного рогатого скота при лейкозе, авторы исследовали поглотительную и переваривающую функцию нейтрофилов (Т.А. Агаркова, 2001; Г.А. Гаврилова, С.В. Бахметьева, 2005; Г.А. Симонян с соавт., 2009; Л.И. Мотавина, 2012). Несмотря на важность поглощения и внутриклеточного переваривания микробов, одну из основных ролей в борьбе с микроорганизмами играет бактерицидный эффект фагоцитов. В процессе фагоцитоза происходит де-грануляция фагоцитов с высвобождением активных форм кислорода, которые и осуществляют этот эффект.
Исследования состояния внутриклеточной кислородзависимой бактерицидной системы лейкоцитов крови при инфекции ВЛКРС и лейкозе крупного рогатого скота крайне незначительны и мы располагаем лишь фрагментарными и неоднозначными сведениями. Поэтому изучение внутриклеточных компонентов нейтрофилов при данном заболевании позволит получить дополнительную информацию о развитии патологического процесса и расширит диагностические возможности с точки зрения объективной оценки неспецифической резистентности.
Цель и задачи исследования. Цель исследований состояла в изучении особенностей общей окислительно-восстановительной активности нейтро-фильных гранулоцитов при развитии лейкозного процесса у крупного рогатого скота.
В соответствии с целью были определены следующие задачи:
- выяснить эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота
в Омской области;
разработать способ оценки функциональной активности нейтрофилов, объективно отражающий состояние общей окислительно-восстановительной активности у животных при лейкозе;
оценить динамику функциональной активности нейтрофилов периферической крови у молодняка крупного рогатого скота, полученного от серонега-тивных и серопозитивных коров-матерей;
- определить состояние функционально-метаболической активности
нейтрофилов у интактных и инфицированных ВЛКРС коров при различных
условиях содержания;
провести сравнительный анализ функциональной активности нейтрофи-лов по реакции хемилюминесценции (ХЛ) и восстановления нитросинего тетра-золия у крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС;
испытать в производственных условиях разработанный способ оценки функциональной активности нейтрофилов при лейкозе крупного рогатого скота.
Научная новизна. Изучены функционально-метаболические изменения нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у инфицированных вирусом лейкоза коров и молодняка крупного рогатого скота различных возрастных групп, а также телят, полученных от РИД-негативных и РИД-позитивных коров-матерей.
Установлено значительное повышение спонтанной способности нейтро-фильных гранулоцитов к продукции активных форм кислорода с помощью разработанного нами способа оценки функциональной активности лейкоцитов при лейкозе. Доказана высокая информационная значимость использования левами-зола в качестве индуктора кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Показано, что наибольшее прогностическое значение в оценке предрасположенности животного к лейкоз-ной инфекции имеет коэффициент стимуляции (КС), определяемый как соотношение индуцированного варианта теста с нитросиним тетразолием к спонтанному, который при недостаточности функциональной активности нейтро-филов принимает значения от 0,95 и ниже. Научная новизна исследований подтверждена патентом РФ на изобретение.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения об особенностях метаболической активности нейтрофилов у инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом животных дают возможность расширить и дополнить сложившиеся в настоящее время представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в прогрессировании данного заболевания.
Исследование функционально-метаболической активности нейтрофилов крови с помощью разработанного способа дает возможность более четкого выявления стадии завершенности фагоцитоза и может быть использовано в качестве дополнительного теста в оценке предрасположенности к заболеванию лейкозом, а также для своевременного выявления недостаточности функциональной активности нейтрофилов и проведения ее коррекции.
Материалы диссертации использованы для разработки методического пособия по методам оценки функциональной активности лейкоцитов при туберкулезе и лейкозе животных.
Методические приемы по определению общей окислительно-
восстановительной активности нейтрофилов в НСТ-тесте могут быть использованы при выполнении научно-исследовательских работ аналогичной направленности и апробированы в учебном процессе ВУЗов ветеринарного профиля.
Методология и методы исследования. Для решения поставленных задач использован комплекс общепринятых и специальных методов научного познания. Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования (взаимосвязь, синтез и анализ, эксперимент, измерение, сравнение, интерпретация). Из специальных использованы гематологические, серологические, иммунологические, фотометрические методы исследований.
Подробное описание методологии и методов исследований отражено в главе «Материалы и методы исследования».
Положения, выносимые на защиту:
1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Омской
области;
2. Методы оценки общей окислительно-восстановительной активности
нейтрофилов при лейкозе крупного рогатого скота;
3. Результаты испытания способа оценки функционально-метаболической
активности нейтрофилов при лейкозе крупного рогатого скота в производ
ственных условиях.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается большим объемом исследований, проведенных в лабораторных и производственных условиях в динамике с 2012 по 2016 г.г. с применением современных методов оценки иммунного статуса, математической обработки цифрового материала на персональном компьютере с использованием стандартных программ. Степень достоверности полученных показателей оценена путем сравнения величин вариационных рядов с помощью критерия Стьюдента.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (Омск, 2012-2016), на Международных научно-практических конференциях: «Знания молодых ученых для развития ветеринарной медицины и АПК страны» (Санкт-Петербург, 2013) и «Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии» (Новосибирск, 2014), на региональной научно-практической интернет-конференции «Научное обеспечение животноводства Сибири» (Красноярск, 2016).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 в изданиях рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертационных работ («Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана», «Достижения науки и техники АПК», «Вестник ОмГАУ»), методическое пособие и патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, списка литературы, списка иллюстративного материала и приложений. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 3 рисунками. Список литературы включает 197 источников, из них 59 иностранных авторов.
Роль системы нейтрофильных гранулоцитов в иммунном гомеостазе
Заражение животных ВЛКРС сопровождается постоянной выработкой антител к антигенам вируса, начиная с первых недель после заражения (стадия бессимптомного вирусоносительства). Антитела, как и вирус, персистируют у зараженных животных на протяжении всей жизни. В этой стадии большинство животных могут находиться на протяжении всей жизни и только у незначительной части животных выявляют изменения в крови в виде абсолютного или относительного лимфоцитоза (до 14 тыс/мкл), постоянство которого ведет к нарастанию признаков болезни (гематологическая стадия) (Ю.П. Смирнов, И.Л. Суворова, 2009).
Количество лейкоцитов в гематологической стадии находится в пределах 15-40 тыс/мкл. Болезнь в этой стадии может продолжаться до 6-8 лет, зачастую без тенденции к прогрессированию, т.е. появлению клинических или патологоанатомических признаков (Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов, 1995).
У части больных происходит прогресс ирование процесса и переход его в клиническую (опухолевую) стадию болезни, которая характеризуется лейкемической картиной крови (выше 40 тыс. лейкоцитов в 1 мкл), увеличением количества молодых, недифференцированных опухолевых клеток в лейкоцитарной формуле, повышением процента недифференцированных клеток в миелограмме, спленограмме, аденограмме или гепатограмме и появлением неспецифических или первых специфических клинических симптомов лейкоза . Продолжительность ее зависит от вовлечения в патологический процесс лимфатических узлов и других жизненно важных органов (Т.П. Кудрявцева, 1969; Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов, 1995).
Терминальная стадия характеризуется увеличением поверхностных или доступных ректальному исследованию внутренних лимфатических узлов и селезенки, наличием опухолей или экзофтальма, появлением разнообразных клинических симптомов и опухолевидных поражений внутренних органов (Ю.П. Смирнов, И.Л. Суворова, 2009).
Диагностика. Диагностику лейкоза крупного рогатого скота в предыдущие годы осуществляли на основе гематологических, клинических и патологоанатомических данных. Однако, длительный инкубационный период, многообразие форм проявления болезни, зачастую стертая симптоматика затрудняют постановку диагноза этими методами. Поэтому в последствие в системе диагностических мероприятий лейкоза крупного рогатого скота наибольшее значение и распространение получили методы, основанные на выявлении антител к антигену ВЛКРС (М.И. Гулюкин с соавт., 1999).
Для серологической диагностики используется реакция иммунодиффузии в геле (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА). Эпизоотологический контроль ВЛКРС главным образом основан на постановке РИД (К.Н. Мукантаев с соавт., 2013; В.В. Храмцов с соавт., 2013).
Наиболее чувствительным тестом для подтверждения диагноза после истечения острого периода вирусной инфекции, как у животных, так и у человека, является ИФА. В скрининговых эпизоотологических исследованиях чувствительность ИФА для выявления случаев инфекций крупного рогатого скота варьирует от 60 до 80% (О.А. Верховский с соавт., 2002; Е.Б. Евтыхова с соавт., 2012).
Н.Г. Двоеглазов с соавт. (2015) отмечают, что практически всегда при помощи ИФА дополнительно выявляются животные, не установленные в РИД. Более высокие показатели чувствительности ИФА позволяют дополнительно к результатам РИД выявлять до 15,3 % вирусоносителей.
Одним из важных преимуществ иммуноферментных методов перед РИД является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах молока, молозива и сборного молока (Т.Р. Якупов с соавт., 2010; В.В. Храмцов с соавт., 2013). В настоящее время имеется достаточно данных о том, что существующие серологические методы диагностики, основанные на выявлении антител к вирусным белкам, в ряде случаев не дают адекватного ответа о зараженности (И.М. Донник с соавт., 2007; П.Н. Смирнов, 2007; О.В. Иванов с соавт., 2009; С.С. Абакин, С.В. Криворучко, 2013; С.И. Логинов с соавт., 2013; Е.А. Скоробогатова, С.И. Логинов, 2015).
Внедрение методов молекулярного анализа радикально расширило возможности изучения патогенеза инфекционных болезней и принципиально усовершенствовало диагностику. В этом плане полимеразная цепная реакция (ПЦР) становится все более распространенным методом, который оптимально сочетает высокую чувствительность и специфичность (И.С. Пономарева с соавт., 2009).
В системе профилактических мероприятий ПЦР пока занимает нишу высокоспецифичного метода, пригодного для использования в качестве подтверждающего теста. Расширение перспектив использования ПЦР связано с ранней диагностикой и с тем обстоятельством, что телята, которых выкармливали молозивом или молоком от серопозитивных коров, обычно приобретают материнские антитела. Для выявления зараженных телят в период действия колострального иммунитета наиболее предпочтительным методом является ПЦР (Н.А. Мальцева с соавт., 2003; Е.Б. Евтыхова с соавт., 2012).
Эффективность ПЦР в скрининговых исследованиях поголовья сравнима с эффективностью ИФА (выявление до 80% больных животных при однократном обследовании) (К.Н. Мукантаев с соавт., 2013).
Заключение к обзору литературы
В практической иммунологии широкое распространение получили нагрузочные тесты, в которых определяют чувствительность клеток, чаще всего нейтрофилов, к антигенам, аллергенам и лекарственным препаратам. Обычно для этого используют тест с нитросиним тетразолием, реакции розеткообразования, фагоцитоза, бласттрансформации лимфоцитов и другие.
Наиболее часто подобные тесты ставят с иммунокоррегирующими препаратами (левамизол, препараты тимуса и другие). Следует отметить, что литературные данные относительно влияния левамизола на иммунные функции неоднозначны, однако большинство исследователей приходят к выводу, что основное действие препарата проявляется в восстановлении функций лимфоцитов и фагоцитов в случае их повреждения. Вместе с тем в научной литературе недостаточно сведений о воздействии левамизола in vitro на функциональное состояние нейтрофилов крови при лейкозе крупного рогатого скота.
В связи с изложенным мы поставили задачу изучить дозированное воздействие левамизола in vitro на функциональную активность нейтрофилов. Затем на следующем этапе исследовании провести сравнительное испытание воздействия левамизола и других активаторов на метаболическую активность нейтрофилов периферической крови в НСТ-тесте у крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС, а также, имеющего отрицательную реакцию иммунной диффузии.
С целью изучения дозированного воздействия левамизола in vitro на функциональную активность нейтрофилов в неблагополучном по лейкозу хозяйстве была отобрана кровь от 5 коров, которых по результатам диагностических исследований признали носителями ВЛКРС (РИД-позитивные). Затем было проведено исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия с использованием различных концентраций левамизола (0,01; 0,1; 0,5; 5 и 50 мкг/мл) на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня спонтанной и индуцированной вакциной БЦЖ активности.
Из таблицы 7 видно, что линейное увеличение оптической плотности раствора диформазана наблюдается при увеличении концентрации левамизола от 0,01 до 0,5 мкг/мл при постановке реакции в обоих вариантах. Дальнейший подъем концентрации левамизола приводил к нелинейному изменению оптической плотности и даже ее уменьшению. Таким образом, для оценки восстановительно-окислительного метаболизма нейтрофилов у инфицированных ВЛКРС животных предпочтительно использовать левамизол в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
На следующем этапе исследований нами был проведен опыт по изучению влияния предварительной обработки нейтрофилов левамизолом in vitro с помощью 30-минутной инкубации в термостате и дальнейшим их использованием для оценки функционально-метаболической активности в НСТ-тесте. Для сравнительного анализа взяты нейтрофилы, которые были внесены в клеточную взвесь одновременно с левамизолом и нитросиним тетразолием., т.е. не подвергнутые предварительной обработке.
С этой целью в опыт была отобрана кровь от 20 голов крупного рогатого скота, 10 из которых по результатам диагностических исследований были признаны инфицированными ВЛКРС. Результаты представлены в таблице 8.
Из таблицы 8 видно, что функционально-метаболическая активность фагоцитов не имела существенных различий при использовании в реакции иммунокомпетентных клеток, обработанных левамизолом разными способами, хотя и наблюдалась некоторая тенденция к ее усилению при внесении левамизола вместе с нитросиним тетразолием (без предварительной обработки). Следовательно, при проведении НСТ-теста необходимость в предварительной 30-минутной инкубации в термостате нейтрофилов с левамизолом отсутствует, что позволяет сократить время на проведение исследований.
Для изучения воздействия различных антигенов на кислородный метаболизм нейтрофильных гранулоцитов у животных, инфицированных ВЛКРС, провели исследование с помощью спонтанного (без нагрузки) и индуцированного (с использованием антигенов) теста с нитросиним тетразолием с последующим подсчетом коэффициента стимуляции (КС), определяемого как отношение Таблица 8.- Результаты сравнительного испытания функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте с предварительной обработкой нейтрофильных гранулоцитов левамизолом in vitro и с внесением препарата в ходе реакции у интактных и инфицированных ВЛКРС животных, М±т
В качестве индукторов были использованы следующие препараты: левамизол в конечной концентрации 0,5 мкг/мл; вакцина БЦЖ (1000 мкг/мл), левамизол+вакцина БЦЖ в тех же концентрациях и антиген ВЛКРС из набора для серологической диагностики лейкоза в стандартном разведении. Стимуляторы перед внесением в клеточную взвесь растворяли в физиологическом растворе.
В опыт было отобрано 20 голов крупного рогатого скота в возрасте от 3 до 5 лет, которых по результатам диагностических исследований на лейкоз разделили на 2 группы: 10 животных, имеющих отрицательную серологическую реакцию в РИД, и 10 носителей ВЛКРС.
Результаты оценки функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте у животных опытной и контрольной группы представлены в таблице 9.
Как свидетельствуют результаты статистической обработки, представленные в таблице 9, раздельное использование левамизола, а также его сочетанное применение с вакциной БЦЖ в качестве индуктора, сопровождалось уменьшением показателя индуцированного НСТ-теста ниже значений спонтанного НСТ-теста у животных-вирусоносителей. Супрессия показателей активированного НСТ-теста также была отмечена при индукции антигеном ВЛКРС. Следствием изменений внутриклеточных метаболических процессов при нагрузке этими препаратами in vitro явилось значительное снижение КС в среднем от 0,86±0,16 и ниже.
Следует отметить, что при внесении в клеточную взвесь только вакцины БЦЖ существенного влияния на функциональную активность лейкоцитов не наблюдалось, при этом КС составил в среднем 1,0±0,04.
Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в сельхозпредприятиях Крутинского района Омской области
Помимо этого, О.В. Морозова с соавт. (2012) отмечают, что предварительная инкубация лимфоцитов периферической крови больных лейкозом животных и носителей ВЛКРС с левамизолом в концентрации 0,5 мкг/мл in vitro оказывает стимулирующее действие на реакцию спонтанного розеткообразования, в то же время не вызывает существенного влияния на лимфоциты здоровых животных. Следует отметить, что как у РИД-отрицательных, так и инфицированных ВЛКРС животных, при постановке НСТ-теста с предварительной инкубацией клеточной взвеси с левамизолом, а также с одновременным его внесением в клеточную взвесь с нитросиним тетразолием, принципиальной разницы между значениями оптической плотности нами не было выявлено. Следовательно, для изучения воздействия левамизола вполне достаточно 20-и минутной инкубации, которую осуществляют после внесения в клеточную взвесь раствора НСТ, а также антигена или иммунокорректора.
При выборе подходящего индуктора кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов также был использован вакцинный препарат «Имурон», представляющий собой живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1, лиофилизированные в 1,5 % растворе глутамината натрия.
Из научной литературы известно, что вакцина БЦЖ является одним из наиболее мощных стимуляторов иммунобиологических механизмов. Она вызывает повышение резистентности к бактериальной и вирусной инфекции, усиленную продукцию гуморальных антител и усиленный фагоцитоз (R.J. Dubos, R.W. Schandler, 1957; J.G. Howard et al., 1959). По мнению большинства исследователей, живая вакцина БЦЖ эффективна как в профилактике туберкулеза, так и в лечении и профилактике злокачественных опухолей и лейкозов (В.М. Бергольц с соавт., 1978).
В качестве объекта сравнения при выборе индуктора также нами был использован лиофилизированный антиген ВЛКРС из набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
При сравнительном анализе разных антигенов нам удалось выявить истощение резервов метаболической активности у животных-вирусоносителей в ответ на стимуляцию левамизолом, при этом спонтанный уровень клеточной активности, напротив, находился на достаточно высоком уровне. Важно отметить, что специфический антиген из набора для серологической диагностики ВЛКРС также вызывал абсолютно идентичные изменения. Тем не менее, мы пришли к выводу о целесообразности использования в качестве индуктора левамизола, так как его применение в значительной степени представляется экономически выгодным за счет внесения низких концентраций препарата.
В ходе эксперимента нами также было отмечено, что отношение показателей индуцированного НСТ к спонтанному тесту (коэффициент стимуляции – КС), которое рассматривают как биохимический критерий готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу, является наиболее важным показателем, так как этот коэффициент имел наиболее выраженные различия у инфицированных ВЛКРС при использовании всех индукторов, за исключением БЦЖ. Эти изменения характеризовались снижением КС у животных-вирусоносителей. Как свидетельствуют литературные данные, уменьшение этого коэффициента происходит в результате снижения резистентности организма и низкой бактерицидной активности нейтрофилов (М.А. Шевляева с соавт., 2010).
Учитывая изложенное, на следующем этапе исследований мы подвергли исследованию 20 коров, сопоставив результаты серологических исследований на лейкоз со значениями КС, что позволило выявить функциональную недостаточность нейтрофилов, которой соответствовали значения коэффициента от 0,95 и ниже, у подавляющего большинства носителей ВЛКРС. У животных, имеющих высокую резистентность, КС превысил отметку 1,11. Исключением являлась одна гематологически больная корова, у которой вследствие чрезмерного повышения образования активных форм кислорода КС составил 11,1. Такого рода изменения указывают на недостаточность антиоксидантной системы вследствие развития инфекционно-воспалительных осложнений, что согласуется с многочисленными экспериментальными данными других авторов (В.Е. Логинский, В.В. Короткий, 1978; Е.Н. Соколова, А.З. Смолянская, 1981; B.R. Anderson, 1971).
На основании этих результатов мы пришли к выводу, что определение КС может служить критерием иммунологического контроля по выявлению животных с высокой чувствительностью к инфекционным заболеваниям, в том числе к лейкозной инфекции. Поэтому на следующем этапе нашей работы мы поставили перед собой задачу более широкого испытания эффективности этого метода в условиях неблагополучной фермы.
Первым этапом производственного испытания явилась сравнительная оценка кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов у телят, полученных от РИД-позитивных и РИД-негативных коров-матерей, разных периодов постнатального развития. В результате этих исследований установлено, что нарушение метаболической активности нейтрофилов происходит у телят обеих групп, но у потомства, полученного от серопозитивных коров-матерей, эти изменения выражены в большей степени и начинаются в раннем возрасте. Аналогичная закономерность была прослежена И.С. Сахаутдиновым и Л.И. Мотавиной (2014), но только при исследовании Т- и В-систем иммунитета. Следует отметить, что бактерицидная активность нейтрофилов у всех животных до 6-месячного возраста находилась на высоком уровне, что вероятно было связано с тем, что телят от заражения ВЛКРС защищали молозивные антитела
Сравнительное испытание метаболической активности нейтрофилов у здорового и инфицированного ВЛКРС крупного рогатого скота
Наряду с реакцией с нитросиним тетразолием, являющейся наиболее простым методом оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, получил распространение другой способ регистрации этого процесса, который основан на усилении хемилюминесценции при возбуждении фагоцитов. В этой связи нами была поставлена задача провести сравнительное испытание показателей метаболической активности нейтрофилов с помощью этих реакций у инфицированных ВЛКРС животных.
Для этого отобрали 30 животных, которых разделили на 2 группы: 1-ю группу составили 15 голов, отрицательно реагирующих в РИД с гликопротеидным антигеном ВЛКРС (интактные), 2-ю группу – 15 положительно реагирующих в РИД с гликопротеидным антигеном ВЛКРС (носители ВЛКРС).
Для оценки потенциальной способности нейтрофильных лейкоцитов к свободнорадикальному окислению изучали показатели: S (светосумма хемилюминесценции) в мВ/с; Imax (интенсивность максимальной вспышки) в мВ/с методом спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции с помощью 36-канального автоматизированного хемилюминометра СL3604. Об активности антиоксидантных систем судили по показателю скорости спада свободнорадикального окисления tg2 (тангенс угла падения кинетической кривой) и коэффициенту антиоксидантной активности (К), равному отношению Imax к S.
Исходную степень функционального раздражения нейтрофилов и потенциальную возможность повышения обмена веществ в нейтрофиле при стимуляции in vitro его метаболической активности оценивали в НСТ-тесте фотометрическим способом в спонтанном и индуцированном варианте. Для характеристики функционального резерва нейтрофилов (готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу) был рассчитан коэффициент стимуляции.
Показатели кинетики хемилюминесценции в опытной и контрольной группах животных представлены в таблице 16.
Из таблицы 16 видно, что у носителей ВЛКРС интенсивность максимальной вспышки (J max) и светосумма хемилюминесценции (S) по сравнению с аналогичными показателями у РИД-отрицательных животных достоверно возрастала, что свидетельствовало о значительном увеличении интенсивности свободнорадикальных процессов в крови.
Величина, характеризующая антиоксидантный потенциал, тангенс угла падения кинетической кривой (tg ) также существенно превышала (в 1,66 раза) значения интактного крупного рогатого скота, что указывало на напряжение системы антиоксидантной защиты. При этом коэффициент антиоксидантной активности (К) отражал снижение антиоксидантного потенциала, индуцированного ВЛКРС.
Спонтанный уровень генерации кислородных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах по результатам НСТ-теста у носителей ВЛКРС достоверно увеличивался до 272,66±9,15 против 133,93±11,66 (Р 0,001) в группе не реагирующих в РИД животных (табл. 17), а индуцированный до 220,66±12,21 против 1,69,26±14,00 (Р 0,05).
Важно отметить, что в группе инфицированных ВЛКРС наблюдалось уменьшение показателей индуцированного НСТ-теста ниже значений спонтанного, о чем свидетельствовал КС, который в среднем составил 0,80±0,03, тогда как у РИД-отрицательных - 1,30±0,09.
Результаты оценки метаболической активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у РИД-отрицательных и инфицированных ВЛКРС животных, М±т Группа животных вариант постановки НСТ спонтанный индуцированный у.е. оп. пл. у.е. оп. пл. КС РИД-отрицательные 133,93±11,66 169,26±14,00 1,30±0,09 Носители ВЛКРС 272,66±9,15 220,66±12,21 0,80±0,03 Достоверность, Р 0,001 0,05 0,001 Такого рода изменения, установленные с помощью этих двух методов оценки функционально-метаболической активности нейтрофилов, указывают на то, что в условиях оксидативного стресса происходит мобилизация компенсаторных механизмов, направленных на снижение уровня свободнорадикальных процессов в организме животных. В свою очередь, интегральный показатель К и коэффициент стимуляции НСТ, характеризующие общую антиоксидантную защиту, свидетельствуют о том, что при инфицировании ВЛКРС, они не в состоянии восполнить возросшую активность окислительно-восстановительных процессов.
Таким образом, полученные результаты дают основание считать, что как с помощью модифицированной нами реакции восстановления нитросинего тетразолия, так и хемилюминесцентного метода оценки активации нейтрофилов, выявлены идентичные закономерности нарушения внутриклеточных метаболических процессов при развитии лейкозного процесса у животных. Разработанный способ оценки функциональной активности лейкоцитов для выявления животных с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции был испытан в ЗАО им. Кирова (ферма Зимино) Крутинского района Омской области. На данной ферме, согласно ветеринарной отчетности, было выявлено наибольшее число носителей ВЛКРС на территории Крутинского района. Так, в 2015 году (табл. 18) в общей сложности было исследовано в РИД 4919 голов, из которых 197 (4,42 %) дали положительную реакцию. Больше всего носителей ВЛКРС было выявлено среди коров (6,96 %) и телок случного возраста (5,4 %)