Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Биологическая роль кишечной микрофлоры животных 11
1.2. Нормальная микрофлора кишечника собак 21
1.3. Причины нарушений состава и функций микрофлоры кишечника животных .24
1.4. Коррекция микрофлоры животных пробиотиками 28
1.5.Трансмиссивная - венерическая саркома собак .35
2. Собственные исследования 40
2.1 Материалы и методы исследования 40
2.2 Результаты собственных исследований
2.2.1 Распространение трансмиссивной - венерической саркомы 47
2.2.2 Зависимость частоты заболевания от пола животных .47
2.2.3 Клиническое проявление ТВС 48
2.2.4 Количественный и качественный состав микрофлоры половых органов здоровых собак и больных ТВС 51
2.2.5 Характеристика микрофлоры половых органов у собак, больных ТВС, при терапии препаратом Винкристин 55
2.2.6 Микробиологический статус ЖКТ 59
2.2.7 Влияние гемопрепарата на микрофлору половых органов собак, компроминтированных ТВС 64
2.2.8 Чувствительность условно-патогенной микрофлоры к некоторым антибиотикам 66
2.2.9 Видовая принадлежность выделенных микробных культур от собак, больных ТВС 66
2.3 Динамика влияния композиционного гемопрепарата на кишечную микрофлору животных 73
2.3.1 Влияние композиционного гемопрепарата на формирование кишечной микрофлоры белых мышей 73
2.3.1.1 Влияние композиционного гемопрепарата на прирост живой массы белых мышей .76
2.3.2. Влияние композиционного гемопрепарата на формирование кишечной микрофлоры кроликов 77
2.3.2.1 Влияние композиционного гемопрепарата на прирост живой массы кроликов .80
2.3.3 Влияние композиционного гемопрепарата на формирование кишечной микрофлоры собак 2.3.3.1. Влияние композиционного гемопрепарата на прирост живой массы собак .84
2.4. Антимикробная активность композиционного гемопрепарата 85
2.5. Экономическое обоснование применения композиционного гемопрепарата .85
2.6. Биологическая характеристика выделенных микробных культур 88
2.6.1 Культурально-морфологическая характеристика микробных культур, выделенных из кала собак
2.6.2. Видовая принадлежность выделенных микробных культур 89
2.6.3. Описание морфологических и культуральных свойств выделенных микробных культур .90
3. Обсуждение полученных результатов 95
Выводы 106
Практические предложения .108
Список используемой литературы 109
Список иллюстративного материала
- Коррекция микрофлоры животных пробиотиками
- Количественный и качественный состав микрофлоры половых органов здоровых собак и больных ТВС
- Динамика влияния композиционного гемопрепарата на кишечную микрофлору животных
- Биологическая характеристика выделенных микробных культур
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В жизнедеятельности организма животного важнейшую роль играет нормальный микробиоценоз, а именно микрофлора кишечника, которая обеспечивает постоянство внутренней среды макроорганизма.
Благодаря сбалансированному соотношению и оптимальному
количеству аэробных и анаэробных микрооорганизмов, в кишечнике осуществляется неспецифическая защита организма животного от бактерий, вызывающих кишечные инфекции, и обеспечивается выработка факторов иммунной защиты (Бурцева Т.В., 2013). Поэтому на сегодняшний день остается актуальным применение научно обоснованной системы повышения ветеринарного благополучия животных с помощью физиологических методов коррекции микроэндоэкологии организма (Арбузова А.А., 2007).
Перспективным направлением в ветеринарной практике для
профилактики и лечения заболеваний ЖКТ животных является использование таких физиологических корректоров микроэндоэкологии, как биопрепараты на основе крови и молочно - кислых бактерий (бифидобактерии и лактобактерии).
Кровь убойных животных представляет собой ценное сырье для производства профилактических средств, поскольку имеет высокую биологическую ценность, обусловленную значительным содержанием хорошо усвояемых и полноценных белков, минеральных солей, ферментов, витаминов и других веществ (Цыремпилова Н.А., 2012). Следовательно, кровь, как ингредиент композиционного гемопрепарата вызывает научный интерес в поиске новых биологически активных средств в профилактике дисбиозов и иммунодефицитных состояний у животных.
Различные факторы окружающей среды негативно воздействуют на организм (Ханхасыков С.П., Варфоламеева Н.Л. и др., 2017; Ханхасыков С.П., Варфоламеева Н.Л., 2017) его микрофлору и приводят к синдрому нарушений микроэндокологии пищеварительного тракта – дисбактериозам. Наибольшее эпизоотическое и экономическое значение приобрели колибактериоз, сальмонеллез, кокковые инфекции животных.
Бессистемное и не всегда оправданное применение антибиотиков и химиотерапевтических средств приводит к размножению полирезистентных штаммов микроорганизмов, многие из которых патогенны не только для животных, но и для человека. Именно условно-патогенная микрофлора способствует развитию бактериальных желудочно-кишечных болезней животных. Поэтому актуальной проблемой остается изучение динамики качественного и количественного состава нормальной микрофлоры пищеварительного тракта животных.
Для профилактики здоровья животных необходимо поддерживать популяцию полезных бактерий в пищеварительном тракте. Поэтому важно при его выращивании создавать необходимые условия, обеспечивающие формирование собственного микробиоценоза, включая применение средств, в том числе пробиотиков, способствующих формированию микрофлоры в нужном для организма направлении (Тараканов Б.В., 2003).
Наряду с вышесказанным не менее важной проблемой становится изучение динамики микрофлоры ЖКТ и половой системы у собак, так же у больных трансмиссивной венерической саркомой широко распространеной в нашем регионе имеющих индикаторное значение в состоянии здоровья.
Степень разработанности темы. Диссертационная работа является
самостоятельным разделом в рамках комплексной программы кафедры ВСЭ,
микробиологии и вирусологии Бурятской государственной
сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова «Проблемы
ветеринарной инфектологии и экологии патогенных микробов в регионе озера Байкал» (№ гос. 01.9.70005.375); комплексной программы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова «Мониторинг ветеринарного благополучия и получения животноводческой продукции высокого санитарного качества» (№ гос. регистрации 0120.0712173), «Проблема мониторинга патогенных микробов в микроценозе в экосистеме озера Байкал и долины реки Селенги» (фундаментально-прикладные исследования).
В доступной нам литературе имеется достаточно данных касающихся лечения ТВС у собак, но нет исследований по профилактике и коррекции микрофлоры половых органов и ЖКТ у собак больных ТВС.
Данный раздел диссертации не имеет аналогов исследований в данном регионе.
Цель и задачи исследования. Цель исследования – изучить изменение
состава микрофлоры половых органов и ЖКТ собак, компрометированных
трансмиссивной венерической саркомой (ТВС), и ее динамику в ходе лечения
препаратом Винкристин; оценить эффективность применения
композиционного гемопрепарата при лечении ТВС и его влияния на микробиологический ландшафт.
Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:
-
Выявить количественный и видовой состав микрофлоры влагалища и желудочно-кишечного тракта здоровых собак и собак, больных ТВС;
-
Определить динамику микробиоценоза влагалища и ЖКТ собак в процессе лечения препаратом Винкристин;
-
Изучить видовой состав и биологические свойства микроорганизмов, обитающих в пищеварительном тракте клинически здоровых собак и больных ТВС;
-
Оценить влияние композиционного гемопрепарата на микробный статус организма собак, а также больных ТВС, в целях профилактики дисбиоза, вызванного данной патологией.
Научная новизна. Впервые изучена динамика микрофлоры влагалища и ЖКТ здоровых собак и собак, больных ТВС, и выявлен эффект лечения препаратом Винкристин. Изучен видовой состав микробного пейзажа в сравнительном аспекте и биологические свойства микроорганизмов. Разработан композиционный гемопрепарат на основе крови убойного крупного рогатого скота с добавлением молочно - кислых бактерий, подтвержденный патентом за № 2584578 и получен профилактический эффект при применении композиционного гемопрепарата в коррекции дисбиозов вызванного данной патологией (ТВС).
Теоретическая и практическая значимость работы. Доказана
эффективность использования композиционного гемопрепарата для
коррекции микрофлоры половых органов и ЖКТ при лечении ТВС собак.
Разработаны и утверждены научно-практические рекомендации «Приготовление и применение композиционного гемопрепарата» в 2015 году, утверждено и рекомендованно к печати научно-техническим советом ФГБОУ ВО «Бурятская ГСХА им. В.Р. Филиппова». Получен патент № 2584578 «Способ применения композиционного гемопрепарата животным».
Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе Федерального государственного образовательного учреждения высшего образования «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова».
Методология и методы исследования. Методология диссертационной работы заключается в использовании общенаучных методов научного познания, а именно: теоретических и эмпирических методов исследования.
Научные исследования проводились с использованием следующих методов:
1. Клинических методов исследования, которые включали в себя:
- сбор анамнестических данных (возраст, пол, порода, условия
кормления и содержания, территория обитания, профилактические обработки,
перенесенные заболевания и методы их лечения, скорость роста
новообразования, наличие в предыдущих поколениях животных, страдавших
онкологической патологией).
- клиническое обследование (осмотр, пальпация, аускультация,
термометрия, локализация опухоли, ее форма, размер, консистенция, характер
роста, подвижность относительно окружающей ткани, реакция окружающей
ткани, состояние лимфатических узлов).
2. Цитологического исследования - использование эксфолиативного
или неэксфолиативного материала, полученного из новообразований.
3.Микроскопических – определение тинкториальных и морфологических свойств микроорганизмов.
4. Бактериологических – выделением чистой культуры микроорганизмов с последующим изучением морфологических, культуральных, биохимических свойств с последующим определением каталазной активности.
5. Биологических – постановкой биопробы на лабораторных животных
с выделением микробных культур.
6. Экспериментальных - научно поставленный опыт в условиях,
позволяющих следить за его ходом, управлять им, воссоздавать его каждый
раз при повторении этих условий.
7. Математических – обработка полученных результатов исследований
методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по
Стьюденту на персональном компьютере с использованием программного
пакета Microsoft Excel XP.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Количественный и видовой состав микрофлоры влагалища и ЖКТ
здоровых собак и больных ТВС;
2. Динамика микробиоценоза влагалища и ЖКТ собак в процессе
лечения препаратом Винкристин;
3. Видовой состав и биологические свойства микроорганизмов,
обитающих в пищеварительном тракте клинически здоровых собак и больных
ТВС;
4. Влияние композиционного гемопрепарата на микробный статус
организма собак, а также больных ТВС в целях профилактики дисбиоза,
вызванного данной патологией.
Степень достоверности и апробации результатов исследований.
Результаты исследований получены с использованием достаточного количества материала и применения общепринятых методик.
Цифровой материал экспериментальных исследований обработан методом вариационной статистики.
Осуществлена практическая апробация полученных результатов.
Основные научные положения, выводы и рекомендации получили
положительную оценку: на ежегодной научно-практической конференции
преподавателей, сотрудников и аспирантов, посвященной Дню российской
науки (Улан-Удэ, 2013); международной научно - практической конференции
«Возрастная физиология и патология сельско-хозяйственных животных»,
посвящённой 100-летию профессора В.Р. Филиппова (Улан-Удэ, 2013); 39-й
студенческой научно-практической конференции молодых ученых
«Инновационные идеи молодых исследователей для агропромышленного комплекса» (Смоленск, 2014); III Всероссийской научно - практической конференции (с международным участием) «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2014); ежегодной научно-практической конференции преподавателей, сотрудников и
аспирантов академии, посвященной Дню российской науки (Улан-Удэ, 2014,2015).
Публикация результатов исследований. Основные результаты научных исследований опубликованы в 11 печатных работах, из которых 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. По результатам исследований получен 1патент РФ на изобретение.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, заключение, практические предложения, список использованной литературы, список иллюстративного материала и приложения, список условных обозначений. Список использованной литературы включает 146 источников, из них 18 иностранных авторов. Диссертация содержит 32 таблицы и 18 рисунков.
Благодарность.
Автор выражает особую благодарность доктору ветеринарных наук, доценту кафедры ветеринарной - санитарной экспертизы, микробиологии и патоморфологии Бурятская ГСХА им. В.Р. Филиппова С.П. Ханхасыкову, за оказание существенной научно-методической помощи в написании настоящей работы.
Коррекция микрофлоры животных пробиотиками
Нормальная микрофлора кишечника подразделяется на две части: облигатную и факультативную (транзитную).
Облигатную, постоянную часть, сложившуюся в филогенезе и онтогенезе в процессе эволюции называют еще индигенной (т.е. местной), аутохтонной (коренной), резидентной.
Основную массу микрофлоры желудочно-кишечного тракта всех млекопитающих и птиц составляют строгие (облигатные), не образующие спор анаэробы, которые занимают определенные экологические ниши в зависимости от вида микроба (В.Ю.Пауликас,1990).
Максимальное количество этих бактерий содержится в толстом кишечнике. К облигатным микроорганизмам содержимого желудочно-кишечного тракта относятся бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, энтерококки, кишечная палочка, дрожжеподобные грибы. Эти микробы имеются у всех здоровых животных, приспособлены к существующим условиям жизнедеятельности и выполняют ведущие биологические функции, полезные для своего хозяина. К факультативным микробам желудочно-кишечного тракта относятся стафилококки, многие представители семейства энтеробактерий, плесневые грибы и др. В состав аутомикрофлоры периодически могут включаться и случайно проникающие в макроорганизм патогенные микроорганизмы (В.Ю.Пауликас,1990).
Под влиянием инфекционных и соматических заболеваний, а также в результате длительного и нерационального использования антибиотиков, происходит нарушение видового состава нормальной микрофлоры, которое приводит к состоянию дисбактериоза, характеризующегося изменением соотношения различных видов бактерий, также нарушением усвояемости продуктов пищеварения, изменением ферментативных процессов, расщеплением физиологических секретов.
Для коррекции дисбактериоза следует устранить факторы, вызвавшие этот процесс. Роль нормальной микрофлоры в жизни животных, как показано выше, так велика, что возникает вопрос: возможно ли сохранение физиологического состояния животного без микробов? Еще Л. Пастер пытался получить таких животных, но низкое техническое обеспечение подобных экспериментов того времени не позволило решить поставленную задачу.
По данным C.De Simone, A. Ciardi. (1992), большую ценность для развития животноводства представляют СПФ-животные (с английского Spezifisch patogen frei) – свободные только от патогенных видов микроорганизмов и имеющие все необходимые виды микробов в своем теле, для проявления физиологических функций.
СПФ-животные растут быстрее обычных, реже заболевают и могут служить ядром для племенных ферм, свободных от инфекционных заболеваний. Для организации такой фермы необходим высший уровень ветеринарно-санитарных мероприятий.
P.F. Perez., Y. Minnaard и др. (1998) описали, что микрофлора желудочно-кишечного тракта делится на внутрипросветную и мукозную (пристеночную). Вся она подразделяется на облигатную (главная микрофлора), факультативную (условно-патогенная и сапрофитная микрофлора), транзиторную.
Куваева И.Б. и др. (1993) считают бифидобактерии природными иммуномодуляторами. Они стимулируют пролиферацию лимфоидной ткани ЖКТ, усиливают фагоцитарную активность макрофагов, моноцитов, гранулоцитов, специфический гуморальный иммунитет, включая противоопухолевую защитную, продуцируют аминокислоты и белки, витамины В1, В2, В6, В12, пантотеновую, никотиновую, фолиевую кислоты и биотин, обеспечивает питание клеток толстой кишки – колоноцитов. При их дефиците снижается синтез витамина К, нарушается свертывание крови.
По данным А.В. Олескина (2000), бифидобактерии анаэробы не образуют спор и морфологически представляют собой крупные грамположительные палочки ровной или слегка изогнутой формы. Концы палочек у большинства бифидобактерий раздвоены, но могут быть также утонченными или утолщенными в виде шаровидных вздутий. F. J. Bourue (1981) описал, что большая часть популяций бифидобактерий располагается в толстой кишке, являясь ее основной пристеночной и просветной микрофлорой. В кишечнике на протяжении всей жизни человека и животного. присутствуют бифидобактерии.
В работе А. А. Ленцнера (1986) описано, что лактобациллы являются не менее важными представителями облигатной микрофлоры гастроинтестинального тракта, они представляют собой неспорообразующие грамположительные палочки с выраженным полиморфизмом, располагающиеся поодиночке, цепочками.
По данным В.В. Субботина (1998), в желудке, дистальных отделах тонкой кишки и в толстой кишке, латобациллы являются основным микробиологическим звеном формирования колонизационной резистентности слизистой оболочки.
В процессе жизнедеятельности эти бактерии вступают в сложное взаимодействие с другими микроорганизмами, в результате этого подавляются патогенные представители острых кишечных инфекций, гнилостные и гноеродные условно-патогенные микроорганизмы, в том числе стафилококки, протеи, грибы рода Candida, гарднереллы, многочисленные транзиторные представители семейства Enterobacteriaceae. Лактобактериям отводится иммуностимулирующая роль: стимуляция синтеза иммуноглобулинов, активация фагоцитоза.
С учетом важной роли молочнокислых бактерий в жизнедеятельности макроорганизма, работа Н.А. Цыремпиловой (2004) с этой группой микроорганизмов была направлена на селекцию и отбор штаммов, обладающих высоким лечебно-профилактическим потенциалом при желудочно-кишечных заболеваниях, в том числе дисбактериозах.
Количественный и качественный состав микрофлоры половых органов здоровых собак и больных ТВС
Назимкиной С.Ф. (2006) отмечено, что по микроскопическому строению опухоль имеет все признаки злокачественности. Ее следует отнести к группе сарком альвеолярного типа. При цитологическом и гистологическом исследовании С. П. Ханхасыковым (2013) выявлены все признаки злокачественности: крупные округлые клетки, округлое ядро, высокое соотношение ядро/цитоплазма, множественные ядрышки, крупнозернистый хроматин, частые митозы. Опухоль передается при случке или при тесном контакте (лизании и кусании) путем передачи инфицированных клеток. Х.Г. Ниманд, П.Ф. Сутер (2004), А.А. Стекольников и др. (2005) описали поражение слизистых оболочек ротовой и носовой полостей. Известна также кожная форма.
В определенных районах земного шара (тропиках, субтропиках, Средиземноморский и Карибский регионы, юго-восток США) трансмиссивные венерические опухоли имеют эпизоотический характер и являются самыми распространенными новообразованиями у собак (Бреали М. Дж., 2003). Носителями болезни в городах являются бродячие собаки (Ниманд Х.Г. и др., 2004). С.П. Ханхасыков (2013) отметил, что в группу риска по заболеванию в основном входят бродячие собаки. Среди домашних животных – собаки, потерявшие контроль со стороны владельцев в период половой охоты.
По данным С.П. Ханхасыкова (2013), в условиях г. Улан-Удэ трансмиссивная венерическая саркома диагностирована в 22,81% случаев от общего количества онкологических заболеваний. Автором отмечено, что в городах Иркутск, Ангарск и Чита данная опухоль составила 27,83%, 20,83% и 19,73% от общего количества животных с подтвержденной онкологической патологией, однако, Е.А. Лозовская, И.И. Силкин (2012) отметили, что в условиях г. Иркутск данная патология отмечена только у одного животного из 110 обследованных, что составило 0,87%.
С.Ф. Назимкина (2006) установила, что трансмиссивной венерической саркомой чаще болеют беспородные собаки 21% (9 случаев), немецкие овчарки-12% (5 случаев), малые пудели - 9% (4 случая), бультерьеры - 9% (4 случая), восточно-европейские овчарки - 9% (4 случая). По ее данным, чаще болеют молодые животные в возрасте от 3 до 5 лет - 40% (18 случаев), в возрасте от 5 до 7 лет – 20% (9 случаев) и в возрасте от 1 до 3 лет- 11% (5 случаев).
По мнению А.А. Стекольникова и др. (2005), опухоли венерического происхождения встречаются не только у собак, но и у котов. Трансмиссивная венерическая опухоль у котов описана также M.J. Brearley et. al. (1986).
A.E. Jergensen, D.P. Shaw (1987) отмечали, что чаще всего болеют кобели и суки в возрасте 2-4 лет. По данным С. П. Ханхасыкова (2013), во всех обследованных городах данная патология чаще регистрировалась у кобелей в возрасте старше 1,5 лет, у сук – в возрасте старше 2-х лет. В условиях г. Улан-Удэ трансмиссивная (венерическая) саркома чаще (50 собак или 58,14% от общего количества страдавших данным заболеванием животных) диагностирована у мужских особей. У женских же особей заболевание диагностировано у 36 собак, что составило 41,86%.
Рассматривая локализацию опухоли, С.Ф. Назимкина (2006) отметила, что опухоль располагалась на слизистой оболочке в области луковицы полового члена, на его головке или препуции. У сук – на слизистой оболочке преддверия влагалища.
Новообразование имело вид округлых, различной величины узлов серо-красного или красного цвета, с мелкобугристой поверхностью рыхлой, реже плотной консистенции, напоминающих соцветия цветной капусты или грозди винограда. При пальпации опухоль легко травмируется с отделением кусочков опухолевой ткани и кровоточит. По данным В.П. Гончарова (2001), С.Ф. Назимкиной (2006), одним из основных клинических признаков заболевания являются капельные кровянистые выделения из половых органов. В ряде случаев в кровянистых выделениях отмечались сметанообразные примеси желтовато-зеленого цвета со специфическим неприятным запахом, что, по мнению С. П. Ханхасыкова (2013) связано с развитием неспецифического инфекционного процесса. При клиническом исследовании температура, пульс, дыхание остаются в норме. В большинстве случаев отмечается только снижение аппетита. (Уайт Р., 2016).
В практике для лечения трансмиссивной венерической саркомы применяют хирургическое удаление опухоли (Стекольников А.А. и др., 2005), а также химиотерапию с использованием различных противоопухолевых препаратов или их комбинацию (Волынова Ю.А., 2008, Горман Н.Т., 2003). Наиболее часто химиотерапию опухоли проводят с использованием препарата Винкристин и, несколько реже, его аналога – Винбластин (Горман Н.Т., 2003).
Несмотря на то, что их применение позволяет достигнуть высокого терапевтического эффекта, С.В. Тимофеев и др. (2006) отмечают, что данная методика экстрополирована из медицины, что не вполне корректно.
С. П. Ханхасыковым (2013) отмечено, что в процессе лечения как препаратом Винкристин, так и Винбластин, опухолевое образование после первой инъекции постепенно уменьшалось в размере и к концу курса лечения визуально не наблюдалось или наблюдалось на месте локализации в виде небольшого плотного узелка. Кровянистые выделения прекращались уже после первой инъекции. Физиологические показатели соответствовали норме на протяжении всего лечения. Владельцами отмечено прогрессирующее улучшение аппетита и активности животных уже после первой инъекции.
Рассматривая побочное действие препарата Винкристин, следует учитывать, что оно, как правило, является следствием недостаточной избирательности в отношении опухолевой ткани. Считают, что быстро пролифирирующая опухолевая ткань несколько больше повреждается противоопухолевыми препаратами, чем нормальная. Однако, нормальные ткани костного мозга, слизистых оболочек пищеварительного тракта, иммунокомпетентных органов, волосяных фолликулов и т.д. также быстро пролифирируют и именно в них чаще проявляется побочное действие проотивоопухолевых препаратов.
Динамика влияния композиционного гемопрепарата на кишечную микрофлору животных
Морфологические свойства. Гр – прямые палочки, длина 2,0 мкм и ширина 0,8 мк., располагающиеся одиночно, парами. Каталазоположительны. Подвижные, не образуют спор и капсул.
Культуральные свойст ва. На МПА – гладкие, слегка выпуклые S-колонии с блестящей поверхностью. На МПБ – образуют равномерное помутнение и легко разбивающийся осадок. На агаре Эндо – колонии красного цвета с темным центром. На висмут-сульфит агаре – колонии светло-зеленого цвета.
Биохимические свойства. Выделенная культура №1 ферментировала глюкозу, способна расщеплять B-галактозидазу, взаимодействовала с цитратом натрия и малонатом натрия, образовывала индол. При проведении опыта реакция на Фогес-Проскауэра положительная. Выделеная культура гидролизировала орнитин, сбраживала сорбита, реакция на фенилаланин оказалась отрицательной. Данная культура не гидролизировала лизин, не сбраживала инозит, не расщепляла уреазу, оксидазу, не образовывала сероводород. Устойчивость. Выделенная культура проявила устойчивость к полимиксину, тетрациклину, бензилпенициллину. Чувствительност ь. Проявила чувствительность к цефалотину, эритромицину, левомицетину, линкомицину, цефотаксиму. Биологическая проба. При внутрибрюшинном заражении 0,5 мл суточной бульонной культуры микроорганизмов с концентрацией 0,5 млн кл/мл вызвала гибель белых мышей на 3-и сутки. На основании проведенных исследований данная культура определена как Citrobacter amalonaticus. Выделенная культура № 2 (ВК №2)
Морфологические свойства. Гр – прямые палочки, длина 1,2 мкм и ширина 1,0 мк., располагающиеся одиночно, парами, иногда короткими цепочками Каталазоположительны. Неподвижные, образуют капсулу.
Культуральные свойства. На МПА – крупные, выпуклые, слизистые S-формы колонии. На МПБ – равномерное помутнение с образованием осадка и поверхностной пленки. На агаре Эндо – колонии красного цвета с розовым центром. На висмут-сульфит агаре формируют коричневые блестящие круглые колонии.
Биохимические свойства. Выделенная культура №2 ферментировала глюкозу, расщепляла B-галактозидазу, взаимодействовала с малонатом натрия, с цитратом натрия. При проведении опыта реакция на Фогес-Проскауэра положительная. Выделенная культура №2 образовывала индол, показала, что гидролизует лизин, не гидролизует орнитин, сбраживает инозит, сорбит, ращепляет уреазу, оксидазу и фенилаланин, не образует сероводород. Устойчивость. ВК №2 проявила устойчивость к полимиксину, бензилпенициллину. Чувствительност ь. Проявила чувствительность к цефалотину, эритромицину, тетрациклину, левомицетину, линкомицину, цефотаксиму. Биологическая проба. При внутрибрюшинном заражении 0,5 мл суточной бульонной культуры микроорганизмов с концентрацией 500 млн кл/мл вызвала болезненное, угнетённое состояние белых мышей на 4 суток. На основании проведенных исследований данная культура определена как Klebsiella oxytoca. Выделенная культура №3 (ВК №3) Морфологические свойства. Гр – прямые палочки, длина 2 мкм и ширина 0,8 мк. Расположение одиночное или парами. Каталазоположительны. Подвижные, спор и капсул не образуют.
Культуральные свойства. На МПА – гладкие, слегка выпуклые, влажные S-форма колонии с блестящей поверхностью, на МПБ - вызывал равномерное помутнение с выпадением осадка. На агаре Эндо – колонии красного цвета с темным центром, без металлического блеска. На висмут сульфит агаре – колонии черного цвета, без металлического блеска.
Биохимические свойства. ВК №3 ферментировала глюкозу до кислоты и газа, расщепляла B-галактозидазу, взаимодействовала с цитратом натрия, образовывала сероводород, при определении с орнитином дала сомнительную реакцию. Не ферментировала оксидазу, фенилаланин, не образовывала индол, сбраживала сорбит, реакция Фогес-Проскауэра и малоната натрия отрицательная, не гидролизировала лизин, не сбраживала уреазу, инозит.
Устойчивость. Проявила устойчивость к полимиксину, тетрациклину, бензилпенициллину. Чувствительност ь. Проявила чувствительность к цефотаксиму, цефалотину, эритромицину, левомицетину, линкомицину. Биологическая проба. При внутрибрюшинном введении 0,5 мл суточной бульонной культуры микроорганизмов с концентрацией 500 млн кл/мл вызывала угнетённое состояние белых мышей на 3 сутки. На основании проведенных исследований данный микробный изолят отнесен к роду Citrobacter , виду Citrobacter freundii. Выделенная культура №4 (ВК №4) Морфологические свойства. Гр + кокки, диаметр 0,5 мк. Расположение одиночное, либо образуют пары, короткие цепочки. Каталазоположительны. Неподвижные, спор не образуют. Культуральные свойства. На МПА – круглые, слегка выпуклые, гладкие S-форма колонии с ровными краями. На МПБ – дает равномерное помутнение бульона с последующим выпадением рыхлого хлопьевидного осадка. На стафилококк агар – непрозрачные, выпуклые колонии светло-желтого цвета с ровными краями с блестящей поверхностью. Биохимические свойства. ВК №4 ферментировала глюкозу, расщепляла оксидазу, выделяла сероводород, расщепляла уреазу. Она не расщепляла B-галактозидазу, не гидролизировала лизин, орнитин, не сбраживала сорбит, не взаимодействовала с цитратом натрия и малонатом натрия, не образовывала индол, не расщепляла фенилаланин, не сбраживала инозит, реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Чувствительност ь. Проявила чувствительность к цефалотину, цефотаксиму, полимиксину, эритромицину, левомицетину, тетрациклину, линкомицину, бензилпенициллину. Биологическая проба. При внутрибрюшинном введении 0,2 мл суточной бульонной культуры белым мышам наступала гибель через 2 суток. Данную культуру мы идентифицировали как Staphylococcus aureus.
Биологическая характеристика выделенных микробных культур
С целью изучения действия влияния композиционного гемопрепарата на динамику изменения микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных, нами было проведено исследование его на белых мышах, кроликах и собаках. Подобных результатов в доступной нам литературе не найдено, поэтому за норму взяли контрольные группы условно-здоровых животных.
На фоне приема гемопрепарата наблюдались положительные изменения микробиоценоза кишечника экспериментальных животных. В первую очередь исследована безвредность композиционного гемопрепарата, которую определяли путем постановки биопробы на белых мышах и кроликах. Патогенного действия на организм лабораторных животных гемопрепарат не оказал. Количество полезной микрофлоры в кишечном содержимом увеличилось в разы, а условно - патогенная уменьшилась. Наблюдался значительный привес массы тела белых мышей и кроликов, что свидетельствует о нормализации обмена веществ при применении композиционного гемопрепарата.
При полученных положительных результатах исследования гемопрепарата на кишечном содержимом лабораторных животных, нами было продолжено исследование динамики изменения микрофлоры жкт собак, в ходе применения композиционного гемопрепарата в течение 21 дня. Нами были взяты опытные и контрольные группы животных. Контрольная группа животных была взята за показатель нормы, так как подобных результатов в доступной нам литературе не найдено.
Результаты исследования показали, что композиционный гемопрепарат также оказывает благоприятное влияние на кишечную микрофлору собак, способствует росту числа полезных (бифидо – и лактобактерий) и снижению численности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (энтеробактерий, энтерококков). Масса тела собак при этом увеличилась на 9,55 %, что свидетельствует о благоприятном воздействии гемопрепарата. Гемопрепарат может быть использован в качестве компонента функционального питания. Данное утверждение основывается на наличии бифидогенного эффекта – стимулятора роста и развития собственных бифидобактерий. Также отмечается рост лактобактерий. Это способствует увеличению массы тела животных. Полученные данные указывают на возможность элиминации условно-патогенных штаммов микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта – на фоне гемопрепарата наблюдаются положительные изменения микробиоценоза кишечника экспериментальных животных.
На основании проведенных экспериментов расширены представления о видовом многообразии микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных. Изучены факторы, определяющие формирование микробного фона. На основе культурально-морфологических исследований была определена биохимическая характеристика выявленных культур из ЖКТ животных, и определен спектр условно-патогенных микроорганизмов, относящихся к типичным родам: Proteus, Enterobacter, Staphylococcus, Salmonella. Обнаружены характерные виды Citrobacter, Shigella, Klebsiella, Edwardsiella, Serratia, Providencia и Bordetella, представляющие риск возникновения инфекции. С учетом малоизученности рассматриваемой проблемы о состоянии количественного и видового состава микрофлоры пищеварительного тракта собак здоровых и больных ТВС, в диссертации приводятся результаты собственных исследований. Приведен анализ существующей отечественной и зарубежной информации о факторах, способствующих регулированию процесса заселения пищеварительного тракта представителями облигатной и факультативной микрофлоры. Вот почему ведущим фактором в возникновении патологического состояния пищеварительного тракта следует считать естественную резистентность и адаптивные способности организма, а вторичным – в основном условно-патогенную микрофлору, которая в большинстве случаев проявляет высокую устойчивость к большинству антибактериальных препаратов, в том числе широкого спектра действия.
Установлено, что облигатными представителями микрофлоры пищеварительного тракта животных являются микроорганизмы родов: Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, факультативными Clostridium, Proteus, Staphylococcus, Pseudomonas, Candida и другие. Показана степень воздействия заболевания на резистентность макроорганизма, а также на показатели микрофлоры пищеварительного тракта, что обусловило целесообразность использования композиционного гемопрепарата для оздоровления животных. Научно обоснованы разработанные нами методические подходы и средства, обеспечивающие стабилизацию функции пищеварительного тракта. Предлагается научный подход в разработке и применении гемопрепарата для оптимизации количественного и видового состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта.