Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Общая характеристика болезни 11
1.2 Классификация и номенклатура 13
1.3 Устойчивость вируса к воздействию физико-химических факторов
1.4 Эпизоотологические особенности возбудителя 18
1.5 Патогенез болезни Марека
1.5.1 Клиническая картина болезни 27
1.5.2 Патологоанатомические изменения 2 8
1.5.3 Гистопатологические изменения 1.6 Иммунитет 3 8
1.7 Диагностика 45
1.8 Заключение по обзору литературы 47
2 Собственные исследования 50
2.1 Материалы исследований 50
2.1.1 Вирусы и вируссодержащий материал 50
2.1.1.1 Изолят вируса болезни Марека 50
2.1.1.2 Штамм «Md5» вируса болезни Марека 51
2.1.1.3 Штамм «3004» ВБМ 51
2.1.1.4 Вакцина «Марек-3 » 51
2.1.1.5 Вакцина «Бимарек» 52
2.1.1.6 Вакцина «Тримарек»
2.1.2 Куриные эмбрионы 52
2.1.3 Растворы и реактивы для культивирования клеток
2.1.4 Сосуды и аппараты 53
2.1.5 Лабораторные животные 53
2.2 Методы исследования 53
2.2.1 Приготовление культуры клеток 53
2.2.2 Культивирование вируса болезни Марека 55
2.2.2.1 Культивирование вируса на культуре клеток 55
2.2.2.2 Культивирование вируса при заражении куриных эмбрионов на хориоаллантоисную оболочку
2.2.2.3 Культивирование вируса при заражении куриных эмбрионов в желточный мешок
2.2.3 Определение инфекционной активности вируса 57
2.2.4 Контроль на стерильность 58
2.2.5 Контроль отсутствия контаминации посторонними вирусами
2.2.6 Определение генетической принадлежности штамма с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования
2.2.7 Вскрытие птиц и отбор проб 60
2.2.8 Количественный анализ копий генома вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени
2.2.9 Статистическая обработка полученных результатов 61
2.3 Результаты собственных исследований 62
2.3.1 Выделение вирулентного изолята ВБМ из органов больной АО
птицы различными способами
2.3.2 Контроль стерильности и отсутствия контаминации посторонними вирусами
2.3.3 Определение генетической принадлежности штамма с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования
2.3.4 Культивирование изолята «Vors-07» вируса болезни Марека в различных культурах клеток 2.3.5 Культуральные свойства изолята «Vors-07» 70
2.3.6 Проявление патогенных свойств изолята «Vors-07» ВБМ птиц
2.3.7 Сравнение патогенных свойств изолята «Vors-07» и референтного вирулентного вируса БМ штамма «Md5» 78
2.3.8 Депонирование штамма «Vors-07»
3 Обсуждение результатов исследования 84
4 Заключение 89
5 Практические предложения 91
6 Список сокращений и условных обозначений 92
7 Список литературы 94
- Устойчивость вируса к воздействию физико-химических факторов
- Штамм «Md5» вируса болезни Марека
- Культивирование вируса при заражении куриных эмбрионов в желточный мешок
- Определение генетической принадлежности штамма с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования
Устойчивость вируса к воздействию физико-химических факторов
Болезнь Марека является наиболее распространенным лимфо-пролиферативным заболеванием кур, которое характеризуется развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах (острая форма) и поражением нервов (классическая форма). В естественных условиях к болезни Марека наиболее чувствительны куры. Отчетливо проявляется возрастная устойчивость птицы. Наиболее восприимчивы цыплята в первые 2 недели жизни. Поголовное инфицирование происходит к 8-20-недельному возрасту. Заболеваемость у невакцинированного поголовья при острой форме болезни может достигать 60-80 % [3, 5, 43, 119].
Раньше не было четкой характеристики заболевания. В зависимости от места локализации поражений БМ весьма разнообразна по клиническим признакам и патологоанатомическим проявлениям. Это привело к появлению множества терминов, применяющихся для идентификации болезни.
Инфильтрация одноядерных клеток в периферических нервах ведет к их увеличению и вызывает паралич. Воспалительный характер некоторых поражений периферических нервов был определен названием полиневрит. Впоследствии стали применять синонимы этого названия, такие, как неврит, нейролимфоматоз птиц и птичий паралич.
Инфильтрация одноядерных клеток в радужной оболочке вызывает различные изменения, от депигментации до помутнения. На этой основе появилось много терминов, таких, как слепота, серый глаз, ирит, увеит и глазной лимфоматоз.
Опухолевые поражения внутренних органов и мышц часто называют просто висцеральным лимфоматозом, а поражения кожных покровов — кожным лейкозом.
В 1961 г. Biggs [54] предложил использовать термин болезнь Марека, чтобы провести четкое различие между этим состоянием и другими этиологически отличными лимфопролиферативными заболеваниями. Этот термин получил широкое распространение.
БМ, являясь наиболее распространенной болезнью кур, встречается во всех странах мира. В России заболевание впервые отмечено в 30-40-е г. XX века. В 1970 г. в СССР обнаружили острую форму болезни Марека [20]. Вскоре отечественные исследователи обнаружили большое количество птицеводческих хозяйств, неблагополучных по БМ [14, 22]. В связи с этим возросла необходимость в изучении данного заболевания, разработке мер контроля и борьбы с ним [7, 19, 20].
БМ наносит существенный ущерб промышленному птицеводству. Однако определить истинный уровень заболеваемости сложно, т.к. в различных странах существуют разные системы отчетности.
До появления вакцин уровень заболеваемости был нестабильным, что было связано, в основном, со случаями эпизоотического распространения в определенных географических зонах. Потери были особенно велики в тех местах, где интенсивно выращивали бройлеров. У кур риск заболеваемости остается самым высоким, даже после вакцинации. Имеется несколько сообщений, на основании которых можно предположить существование исключительно вирулентных штаммов вируса болезни Марека [94, 136, 145, 177, 179].
За последние 50 лет после изоляции вируса изменилось вызываемое им заболевание. Со временем инфекция становится все более острой, тяжелой. Увеличилось количество хозяйств, не благополучных по БМ. Основная причина изменения патогенности вируса болезни Марека заключается в мутациях специфических вирусных генов, отвечающих за время индукции опухолей, снижение скорости репликации in vitro и т.д.
Данная эволюция возбудителя болезни Марека, возможно, является результатом приспособления к иммунологическим процессам, вызванного систематической поголовной вакцинацией, а также возможной рекомбинацией с другими вирусами [42]. H.G. Purchase [139] отмечал сезонность заболевания. В зимние месяцы потери от болезни выше, чем в летние. Есть предположение, что это связано со снижением циркуляции воздуха в зимний период.
До широкого применения вакцин против болезни Марека в странах с развитым промышленным птицеводством из каждых 20 кур одна погибала от болезни Марека [139]. В настоящее время вакцинация не обеспечивает 100% защиту, поэтому потери продолжаются.
Вирус, вызывающий болезнь Марека — это герпесвирус, относящийся к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Marek s disease-likeviruses, которые характеризуются выраженным тропизмом к Т-лимфоцитам [42]. Вирус болезни Марека является прототипным вирусом группы ВБМ и обозначается как серотип 1.
У индеек и кур, соответственно, были выделены две дополнительные группы неонкогенных герпесвирусов. Их также относят к группе ВБМ. Неонкогенные штаммы вируса обозначаются как ВБМ серотипа 2. А герпесвирусы индеек, названные ВГИ (вирус герпеса индеек) на основе ранее принятой терминологии [ПО], обозначаются как вирусы серотипа 3. Классификация по серотипам для штаммов ВБМ и вируса герпеса индеек [57, 58] базируется на признании общих и индивидуальных антигенных эпитопов для каждого серологического типа. Если не оговорено иным образом, под термином вирус болезни Марека понимаются вирусы первого серотипа.
Морфология и морфогенез вируса болезни Марека рассмотрены в работах S. Kato и К. Hirai [114] и К.A. Schat [39]. В целом вирусные частицы аналогичны тем, которые описаны для других вирусов герпеса. Вирионы обычно присутствуют в ядрах клеток. Гораздо реже они встречаются в цитоплазме или внеклеточном пространстве. Различия в размерах вирионов обусловлены различием в углеводном компоненте [160]. В тонких срезах инфицированных клеточных культур наблюдаются шестиугольные безоболочечные частицы или нуклеокапсиды диаметром 85-100 нм и частицы, покрытые оболочкой, диаметром 150-160 нм [4].
Вирусные частицы, наблюдавшиеся исследователями в негативно окрашенных препаратах лизированного эпителия перьевых фолликул (ЭПФ), имели размер 273-400 нм. Они были покрыты суперкапсидной оболочкой и обладали неоднородной аморфной структурой [43, 62, 86]. Препараты тонких срезов эпителия перьевых фолликулов показывают большое количество частиц вируса герпеса с цитоплазматической оболочкой в ороговевающих клетках.
Вирусные частицы в клетках эпителия перьевых фолликулов образуют осмиофильные включения в цитоплазме клеток и состоят из электронноплотного материала [64]. Капсид вириона состоит из 162 капсомеров, они представляют собой полые цилиндры длиной 9-12 нм. Сердцевина кольцеобразного нуклеокапсида представлена 2-мя круглыми пересекающимися пластинками, края которых электронноплотные. Центр нуклеокапсида светлый.
Спонтанная рекомбинация среди трех известных в настоящее время серотипов вируса болезни Марека до сих пор не была выявлена. Вероятнее всего она встречается редко, хотя сопутствующие инфекции в тех же тканях или клетках [100] достаточно часты. Однако у всех трех серотипов при последовательном пересеве in vitro быстро изменяются молекулярные или биологические характеристики [78, 153, 174, 176].
Были описаны чувствительные к температуре ts-мутанты вируса болезни Марека [176] и мутант вируса герпеса индеек, резистентный к ингибированию фосфонацетатом. Описано увеличение вирулентности и изменения биологических свойств вируса болезни Марека во время обратного переноса in vivo [175] Описаны рекомбинации генетического материала с другими вирусами. Культивирование вируса болезни Марека вместе с ретровирусом птиц in vitro приводит к спонтанному включению в геном вируса болезни Марека LTR-последовательностей провирусов у ретровирусов [142].
Штамм «Md5» вируса болезни Марека
M.D. Ficken et al. [123] установили, что изменения в средней сосудистой оболочке глаза неизменно приводили к повышению уровня белка в стекловидном теле. А возможные изменения радужной оболочки могут простираться от сосудистого застоя и слабой гиперемии до сильного опухания. М. Sevoian и D.M. Chamberlain [150], а также T.W. Smith et al. [128] воспроизвели глазные поражения экспериментально. Последний из вышеперечисленных авторов сообщил, что дальнейшие изменения включали инфильтрацию пролифирирующими лимфоретикулярными клетками в зрительный и ресничный нервы и среднюю сосудистую оболочку глаза с последующей подобной инфильтрацией по всему глазу. T.W. Dukes и J.R. Pettit [92] обнаружили наличие катаракт в 7 из 18 случаев естественного инфицирования БМ.
Лимфоматозные поражения внутренних органов более пролиферативны по сути. И в то же время клеточный состав поражений очень схож с пролиферативными поражениями нервов. Они состоят из диффузно пролиферирующих малых или средних лимфоцитов, лимфобластов, а также активированных и примитивных клеток ретикулума [133]. Плазматические клетки встречаются редко [138]. Клеточный состав опухолей у различных органов одинаков даже при разном характере патологического процесса. Ультраструктурные особенности опухолевых клеток были описаны несколькими авторами.
Поражения кожи в основном носят воспалительный характер, но могут быть и лимфоматозными, и локализуются вокруг инфицированных перьевых фолликулов. В дополнение к наблюдающимся иногда скоплениям одноядерных клеток вокруг перьевых фолликулов, в дерме можно обнаружить компактные скопления пролиферирующих клеток, часто периваскулярных, а также небольшое количество плазматических клеток и гистоцитов [133]. Сами поражения невелики — целостность кожи сохраняется, тогда как пролиферативные поражения могут вызвать разрыв эпидермиса и привести к образованию язв. R. Moriguchi et al. [77] описали воспалительные и лимфопролиферативные поражения перьевой пульпы. Последние из указанных поражений были тесно связаны с заболеваемостью БМ. Необычное вовлечение в патологический процесс хохолка было отмечено Н.Е. Ekperigin et al. [80].
Н.К. Pradhan et al. [107] обнаружили в почках кур, инфицированных вирусом болезни Марека, иммунный комплекс, ведущий к гломерулопатии. Авторы предположили, что эти поражения могли стать одной из основных причин смерти при болезни Марека.
Продуктивная репликация герпесвируса в фабрициевой сумке и тимусе приводит к дегенеративным изменениям в этих органах [71, 134]. При экспериментальном инфицировании поражения фабрициевой сумки состояли в кортикальной и медуллярной атрофии, некрозе, образовании кисты и межфолликулярной лимфоидной инфильтрации. Атрофия тимуса иногда была очень сильной с вовлечением в процесс кортинального слоя мозговой зоны органа. В некоторых случаях в тимусе наблюдались области лимфоидной пролиферации. Иногда в клетках, связанных с дегенеративными поражениями, наблюдались внутриядерные включения Каудри типа А. Цыплята, инфицированные в отсутствие материнских антител, характеризуются недоразвитым костным мозгом в совокупности с анемией, очаговым или генерализованным некрозом различных органов, включая почки.
При инфицировании вирусом болезни Марека возможно повышение уровня лейкоцитов в крови. В основном это связано с увеличением количества больших лимфоцитов и лимфобластов. L.N. Payne et al. [135] идентифицировали большинство лейкозных клеток как Т-лимфоциты. Лейкозная реакция нестойка и может отсутствовать или проявляться в слабой степени [113]. Изменения костного мозга при болезни Марека включают множественные опухолевые узелки или аплазию. Но они могут и отсутствовать [138]. Возможной причиной анемии, наблюдаемой у некоторых птиц, является продуктивная вирусная инфекция кроветворных клеток костного мозга, хотя не следует отвергать возможность сопутствующего инфицирования возбудителем анемии кур.
Поражения артерий, связанные с вызванным вирусом болезни Марека атеросклерозом, включают пролиферативные и жиро-пролиферативные изменения в аорте, венечной, чревной, желудочной и брыжеечной артериях [168]. Присутствие внутренних и медиальных пенистых клеток, внеклеточных липидов, образование пространства при растворении кристаллов холестерина в срезах и отложений кальция характеризуют жиро-пролиферативные поражения.
Кроме того, вирусные антигены БМ могут быть выявлены с помощью иммунофлюоресценции по соседству с поражениями артерий. C.G. Fabricant et al. [102] обнаружили, что инфицирование клеток гладких мышц артерий вирусом БМ in vitro привело к образованию скоплений фосфолипидов, свободной жирной кислоты, холестерина и сложных эфиров холестерина. На основании этого они сделали вывод о нарушении обмена липидов. Проведенные позже исследования in vivo подтвердили это заключение. D.P. Hajjar et al. [169] обнаружили накапливание липидов в аорте. Это, в частности, происходило вследствие нарушения метаболизма сложного эфира холестерина / холестерила на ранних этапах болезни.
В настоящее время для диагностики вируса болезни Марека применяют следующие серологические тесты: реакция диффузной преципитации (РДП), иммунофлюоресценция (ИФ), реакция нейтрализации (РН) и иммуноферментный анализ (ИФА), каждому из которых свойственны недостатки.
Для выявления специфических антител к ВБМ наибольшее распространение в силу простоты своего выполнения получила реакция диффузионной преципитации. Лизаты из инфицированных клеточных культур, экстрактов кожи или перьевых фолликулов могут служить источником антигена вируса БМ. Специфическая полоса преципитации образуется, как правило, в течение 24-72 часов.
Культивирование вируса при заражении куриных эмбрионов в желточный мешок
Задача данного этапа исследований состояла в поиске оптимального способа выделения вирулентного инфекционного агента из патологического материала (печени, почек, яичников, селезенки) для последующего изучения его биологических свойств.
Для этого использовали первично трипсинизированную культуру клеток кожи СПФ-эмбрионов кур и растущие куриные эмбрионы. Для выделения вирулентных полевых изолятов сравнили 3 способа выделения вируса с последующим сравнением результатов [27, 119].
При первом способе суспензией, полученной из патматериала, заражали 12-суточные куриные эмбрионы на хориоаллантоисную оболочку, после трех последовательных пассажей полученным материалом заражали первично трипсинизированную культуру клеток кожи СПФ-эмбрионов кур. Для обнаружения цитопатического действия вируса в культуре клеток также проводили 3 пассажа.
Второй способ - с предварительным культивированием вируса в 5-суточных эмбрионах, зараженных в желточный мешок. Число повторов культивирования вируса в желточном мешке было равно 3, после чего заменяли используемую ранее чувствительную систему на первичную культуру клеток кожи СПФ-эмбрионов кур, в которой культивирование длилось еще три пассажа.
Третий способ - заражение первичной культуры клеток кожи СПФ-эмбрионов кур суспензией, приготовленной из вируссодержащего патматериала, и культивирование вируса в культуре клеток кожи в течение 3 пассажей.
Для большей наглядности выше описанных вариантов была составлена следующая схема, которая представлена на рисунке 1.
Проведенные работы по выделению инфекционного агента из патматериала показали следующее: при всех способах выделения вируса на первых двух пассажах в культуре клеток видимых цитопатических изменений не происходило. Через 144-168 часов культивирование приостанавливали, считая указанный временной отрезок как слепой пассаж. Данный период соответствовал началу дегенеративных процессов в интактной культуре клеток. Инфицированный клеточный монослой снимали со стекла, концентрировали и переносили собранный материал во флаконы со свежеприготовленной культурой клеток.
При первых 2 способах вирусовыдения проявлений действия инфекционного агента в культуре клеток на 3 пассаже не обнаружено, что было подтверждено данными полимеразной цепной реакции. Третий вариант выделения вируса оказался наиболее удачным. На 3 пассаже, через 72 часа культивирования, при микроскопировании монослоя клеток появились цитопатические изменения. Они представляли собой небольшие единичные очаги поражений в виде скоплений округлых клеток с деформированными мембранами.
После каждого пассажа культивирования инфекционного агента в культуре клеток полученный материал титровали в культуре клеток кожи и исследовали в полимеразной цепной реакции в реальном времени. Итоговыми показателями при тестировании инфицированной клеточно-ассоциированной суспензии были титр вируса, полученный при титровании на культуре клеток и с помощью расчета по результатам ПЦР-РВ согласно соответствующему уравнению линейной регрессии [44].
Данные ПЦР и титрования вируса в культуре клеток (таблицы 1) показали, что в первых двух способах выделения вируса, а именно с предварительным культивированием инфекционного агента in ovo, имеет место отрицательный результат. Содержимое желточного мешка в наших экспериментах оказалось средой, непригодной для выделения вирусного агента, хотя из литературных источников известно, что культивирование ВБМ в указанной чувствительной системе возможно [45].
Вирус, выделяемый из патматериала птицы, с клиническими признаками БМ, также не обнаружили и на хориоаллантоисной оболочке, несмотря на то, что результаты полимеразнои цепной реакции в режиме реального времени указывали на присутствие генома инфекционного агента в пробах, отобранных после первого пассажа культивирования в культуре клеток. При этом следует уточнить, что данная величина близка к показателю отрицательного контроля.
Кроме этого, к недостаткам первых двух способов выделения вируса следует отнести длительное время культивирования инфекционного агента в указанных системах.
Третий способ выделения вируса в серии проведенных экспериментов оказался наиболее удачным. Хотя в первых двух пассажах на культуре клеток цитопатических изменений не наблюдали, данные полимеразнои цепной реакции в режиме реального времени демонстрировали, что геном вируса присутствует в пробах. Воспользовавшись уравнением линейной регрессии [44] для опосредованной оценки титра ВБМ серотипа 1 было установлено, что концентрация вируса ("Т) на первом и втором пассаже была близка к значениям Т = 2,9 х Ю5 и Т = 3,9 х Ю5 ТЦДзо/см3, соответственно.
Сопоставляя данные титрования материала после третьего пассажа культивирования и полимеразнои цепной реакции, установили, что результирующие показатели, указывающие на количество накопленного вируса, были близки по величине. А именно, титр вируса в культуре клеток Т = 6,0 х 10 ТЦД50/СМ статистически не имел различий (р 0,05) с величиной титра Т = 6,9 х 10 ТЦД5о/см , рассчитанной опосредованно.
Полученные результаты позволили сделать вывод, что из всех предложенных к изучению способов выделения инфекционного агента из патматериала наиболее оптимальным для выделения оказалась первичная культура клеток кожи СПФ-эмбрионов кур. В дальнейших исследовательских работах было решено использовать этот способ. Данные, полученные в результате проведенных работ, были использованы при разработке «Методических рекомендаций по выделению высокопатогенных изолятов вируса болезни Марека».
В дальнейшем по утвержденным методическим рекомендациям проводили выделение полевых вирусов БМ от больной птицы, привезенной из птицеводческих хозяйств Республики Мордовия (2009г.) и Краснодарского края (2014г.).
Полученный изолят необходимо было проверить на наличие бактериальной и грибной микрофлоры и микоплазмы и на контаминацию чужеродными вирусами.
В результате исследований установлено, что изолят «Vors-07» не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. Высевы культурального штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов в течение всего срока наблюдения.
Методом ПЦР проводили исследование штамма на наличие посторонних геномов микроорганизмов-возбудителей болезней птиц: вирусов гриппа А птиц, ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного энцефаломиелита, синдрома снижения яйценоскости - 76, инфекционной анемии цыплят и реовируса, используя специфические праймеры [13, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38]. В результате проведенных исследований установлено, что изолят «Vors-07» не контаминирован чужеродными вирусами.
Определение генетической принадлежности штамма с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования
Нами было выбрано 3 способа: заражение растущих куриных эмбрионов на хориоаллантоисную оболочку, с последующим культивированием на культуре клеток кожи; заражение растущих КЭ в желточный мешок, с последующим культивированием на культуре клеток кожи, и заражение культуры клеток кожи.
Полученные нами данные показывают, что при культивировании в куриных эмбрионах (3 пассажа), а затем в культуре клеток кожи - вирус не обнаруживается. Наши результаты не подтверждают литературные данные, которые свидетельствуют об успешном выделении вируса указанными способами с использованием КЭ [5, 27, 52, 111, 116].
Культура клеток кожи оказалась оптимальной для первичного выделения полевых изолятов вируса болезни Марека. В первых пассажах вирус не вызывал образование ЦПИ на культуре клеток, но при дальнейшем пассировании в чувствительных культурах он приобретал эту способность, которая возрастала с увеличением количества пассажей. Эти данные подтверждаются С.Н. Purchase et al. [134].
В результате проведенных работ в 2007 г. из патматериала, полученного из птицефабрики центральной части РФ, на культуре клеток кожи был выделен изолят «Vors-07».
Из литературных источников известно, что для культивирования ВБМ 1 серотипа успешно применяли различные культуры клеток: утиные и куриные фибробласты, культуру клеток почек и печени, культуру клеток кожи куриных эмбрионов, SOgE и др. [27, 147, 155].
Следующим этапом нашей работы стал подбор оптимальной культуры клеток для культивирования изолята «Vors-07». СПФ-утиные эмбрионы были не доступны для исследований. Работы по поиску оптимальной системы для культивирования изолята «Vors-07» проводили на культуре клеток кожи, почек, печени и фибробластов СПФ-эмбрионов кур. Клетки печеночной ткани на стекле формировали островки, которые через 48-72 часа начинали дегенерировать, а другие авторы [27, 155] показывали успешное культивирование на данной культуре.
Лучшие результаты были получены в культуре клеток кожи, где на пятом пассажном уровне инфекционная активность вируса составила 3,5x10 ФОЕ/см . На культуре клеток фибробластов эмбрионов кур результаты были на 1 lg меньше.
В связи с тем, что изготовление культуры клеток кожи является трудоемким и дорогостоящим процессом, также приемлемо использовать культуру клеток фибробластов эмбрионов кур.
При изучении культуральных свойств изолята «Vors-07» максимальная инфекционная активность вируса была достигнута на 5 пассаже при культивировании на КК кожи и составила 3,5x10 lg ТЦД/см . Одной из характеристик данного изолята является небольшой размер фокусов в культуре клеток, который соответствует 59±3,84 мкм, что характерно для вирулентных вирусов БМ [155]. Оптимальное время культивирования составило 144ч.
Целью следующего этапа исследований являлось изучение проявления патогенного действия изолята «Vors-07» вируса болезни Марека на восприимчивой птице.
При изучении патогенных свойств изолята «Vors-07» вируса болезни Марека при вскрытии павших цыплят обнаружили множественные опухоли в различных органах. Пораженные органы были бледны и увеличены в объеме вследствие их инфильтрации опухолевой тканью, что характерно для острой формы болезни Марека, приводящей к высокой летальности.
При заражении цыплят суточного возраста их гибель регистрировали, начиная с 30 суток после инфицирования, при этом гибель в группе достигала 70% от всего поголовья. У цыплят, инфицированных в 14-суточном возрасте, гибель наблюдалась с 40 суток после заражения, и гибель по группе составила 40%. Полученные результаты подтверждаются литературными данными о возрастной резистентности [5, 67, 162]. В связи с тем, что мы собирались депонировать штамм «Vors-07» в качестве пробойника, интерес представляло наибольшее проявление патогенных свойств вируса, поэтому способ заражения птицы в 14 суточном возрасте не подошел.
Для того, чтобы использовать штамм «Vors-07» в качестве штамма контрольного заражения, необходимо было определить степень его патогенности.
Были проведены работы по изучению патогенных свойств изолята «Vors-07» в сравнении с референтным высоковирулентным штаммом «Md5» вируса болезни Марека в опытах на цыплятах, вакцинированных моно-(3 серотип), би- (2+3 серотипы) и трехвалентными (1+2+3 серотипы) вакцинами против болезни Марека и зараженных в возрасте 8 сут изолятом «Vors-07» и штаммом «Md5».
Изолят «Vors-07» БМ обладает высокой степенью патогенности. В группе контроля вирулентного вируса гибель цыплят наблюдали с 30 сут после заражения, и количество случаев заболевания БМ составило 70% цыплят в группе.
При патологоанатомическом вскрытии наблюдали: увеличение сплетений седалищных и плечевых нервов; поражения в половых органах (особенно яичнике), легких, сердце, брыжейке, почках, печени, селезенке, сумке Фабрициуса, тимусе, надпочечниках, поджелудочной железе, железистом желудке, кишечнике, радужной оболочке глаз, скелетных мышцах и кожных покровах. Наблюдали увеличение органов, иногда в несколько раз, от нормального размера.
Макроскопические поражения глаз, характерные для острой формы БМ, заключались в потере пигментации радужной оболочки («серый глаз») и изменении формы зрачка.
Инфицирование цыплят штаммом «Md5» ВБМ в группе контроля вирулентного вируса в течение всего срока опыта приводило к гибели трех голов из десяти. Гибель цыплят наблюдали с 30 сут после заражения, количество случаев заболевания БМ составило 80% цыплят в группе. При вскрытии цыплят обнаруживали поражения печени, сердца, селезенки, бурсы. Все пораженные органы были увеличены и бледны вследствие их инфильтрации лимфоидной опухолевой тканью (аналогичные изменения описаны ранее [171, 173, 178]).
При изучении патогенных свойств «Vors-07» на вакцинированных цыплятах не наблюдали ярких клинических признаков болезни. При вскрытии были обнаружены патизменения внутренних органов, характерные для болезни Марека. У птиц, вакцинированных моновалентной вакциной и зараженных «Vors-07» и «Md5», при вскрытии отмечали признаки болезни Марека у 20 % и 40 % цыплят, соответственно. В группах, вакцинированных би- и трехвалентной вакцинами и зараженных «Vors-07» и «Md5» по 10 % и 20 % птиц, соответственно, наблюдали аналогичные изменения. Также болезнь проявлялась истощением, отставанием в росте, нарушением опорно-двигательного аппарата. Аналогичные результаты представлены в работе Е.К. Дудниковой с соавт. [15], хотя заражение проводили на 5 сут после вакцинации.