Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Распространение ЗУД КРС и ущерб, причиняемый этим заболеванием 12
2.2. Эпизоотологическая характеристика ЗУД КРС 15
2.3.Характеристика семейства Poxviridae 19
2.3.1. Классификация поксвирусов 19
2.3.2. Строение поксвирусов 21
2.3.3. Геном поксвирусов 23
2.3.4. Репродукция поксвирусов 25
2.4. Общая характеристика ЗУД КРС 27
2.4.1. Определение заболевания 27
2.4.2. Патогенез и клиническая картина при ЗУД КРС 29
2.4.3. Патологоанатомические изменения при ЗУД КРС 31
2.5. Культивирование вируса ЗУД КРС 32
2.6.Характеристика иммунобиологических свойств вируса ЗУД КРС 33
2.6.1. Морфология и химический состав вируса ЗУД КРС 33
2.6.2.Устойчивость вируса ЗУД 33
2.6.3.Антигенная структура 34
2.6.4.Антигенная активность вируса ЗУД КРС 34
2.6.5.Антигенная вариабельность и родство 34
2.7 Меры борьбы и профилактика ЗУД КРС 34
2.8.Диагностика ЗУД КРС 38
2.9. Заключение по обзору литературы 41
3. Собственные исследования 44
3.1 Материалы 44
3.1.1 Вирус 44
3.2.1 Животные 44
3.2.1 Животные 44
3.1.3 Культура клеток 44
3.1.4 Оборудование и инструменты 44
3.1.5 Растворы и питательные среды 45
3.2 Методы 46
3.2.1Выделение вируса ЗУД КРС в культуре клеток 46
3.2.2 Культивирование вируса ЗУД КРС, получение и титрование вируссодержащего материала 46
3.2.3 Заражение животных 47
3.2.4 Отбор проб крови и патологического материала от животных для лабораторного исследования 47
3.2.5Определение уровня вируснейтрализующих антител к вирусу ЗУД в сыворотках крови животных 48
3.2.6 Выделение ДНК и постановка ПЦР-РВ 48
3.2.7 Секвенирование 49
3.3 Статистическая обработка результатов исследования 49
4. Результаты собственных исследований 50
4.1 Анализ распространения ЗУД КРС в Российской Федерации за 2015-2018 г. 50
4.2 Получение штамма вируса ЗУД КРС «ВНД КРС/Дагестан/2015» 55
4.2.1 Выделение изолята вируса ЗУД КРС из проб патологического материала в культурах клеток 55
4.2.2 Контроль стерильности и отсутствия контаминации посторонними вирусами 57
4.2.3 Контроль биологической активности и стабильности штамма «ВНД КРС/Дагестан/2015» 58
4.2.4 Идентификация и филогенетическое родство штамма «ВНД КРС/Дагестан/2015» (методом ПЦР) 59
4.2.5.Депонирование штамма «ВНД КРС/Дагестан/2015» 60
4.3-Оптимизация условий культивирования штамма «ВНДКРС/ДАГЕСТАН/2015» вируса ЗУД 60
4.3.1 Изучение чувствительности различных перевиваемых линий культур клеток к вирусу ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» 61
4.3.2 Влияние возраста культур клеток на репродукцию вируса 65
4.3.3 Накопление вируса ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/ДАГЕСТАН/2015»в культурах клеток ЯДК-04 и ТЯ при разной множественности заражения 66
4.3.4 Влияние времени культивирования на инфекционную активность вируса ЗУД КРС 68
4.3.5 Влияние величины рН среды на репродукцию вируса ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» в перевиваемых клеточных культурах ЯДК-04 и ТЯ 68
4.3.6 Влияние приема ««замораживания – оттаивания» на выход вируса 70
4.3.7 Устойчивость вируса ЗУД при различных температурах хранения 70
4.4 Изучение клинических признаков вируса ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» на естественно восприимчивых животных 73
4.5. Оптимизация условий постановки реакции микронейтрализации при выявлении антител против ЗУД КРС 80
5. Заключение 86
6. Выводы 92
7. Практическое предложение 93
8. Список литературы 94
9. Приложения 107
- Эпизоотологическая характеристика ЗУД КРС
- Анализ распространения ЗУД КРС в Российской Федерации за 2015-2018 г.
- Изучение чувствительности различных перевиваемых линий культур клеток к вирусу ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015»
- Оптимизация условий постановки реакции микронейтрализации при выявлении антител против ЗУД КРС
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого
скота (нодулярный дерматит, кожная бугорчатка, узелковая экзантема, кожно-
узелковая сыпь, «лоскутная болезнь кожи») - трансграничная, эмерджентная
инфекционная болезнь крупного рогатого скота (КРС), проявляющаяся
персистентной лихорадкой, поражением лимфатической системы, отеком
подкожной клетчатки и внутренних органов, образованием кожных узлов (бугров),
поражением глаз и слизистых оболочек органов дыхания и пищеварения, потерей
продуктивности и живой массы тела [1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 16, 21, 22, 23, 25].
Возбудителем заразного узелкового дерматита (ЗУД) является ДНК-содержащий оболочечный вирус, относящийся к группе Neethling, рода Capripoxvirus, семейства Poxviridae. Вирус Neethling является прототипным возбудителем ЗУД. Этот патоген имеет антигенное родство с вирусом оспы овец [1,6,7,12].
В настоящее время заболевание встречается в 34 странах Африки и Азии. По официальным сводкам МЭБ за три года (с 2013 по 2015 г.) это заболевание широко распространилось в странах Ближнего Востока. По данным национальных ветеринарных служб в 2014 г. заболевание КРС вирусом ЗУД было выявлено в Турции - 230 очагов, Ливане - 32, Азербайджане и Ираке - по 16, Египте и Иране -по 6 очагов. В 2014-2015 г. болезнь была диагностирована на Кипре и в Греции [11, 14, 17, 23, 24].
В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данному заболеванию. Однако в 2015 г. первые случаи ЗУД в России были зарегистрированы на территории Республики Дагестан и Чеченской Республики. За второе полугодие 2015 года в РФ было выявлено уже 17 вспышек болезни в 3 субъектах РФ. За период 2016 года нотифицировано 313 вспышек в 16 субъектах РФ. В 2017 году было зарегистрировано 43 вспышки в 6 субъектах РФ. По данным МЭБ за 2018 г (данные представлены на 14.09.2018 г) в РФ нотифицировано 49 вспышек в 5 субъектах РФ. Это обстоятельство указывает на то, что данное заболевание продолжает распространятся на новые территории Российской Федерации, и может приводить к серьезным социально-экономическим последствиям для отечественного животноводства [3, 10, 12 ,14, 18].
Заболевание наносит значительный экономический ущерб в скотоводстве, так как вызывает существенное снижение удоя молока, потерю живой массы тела, повреждение качества шкуры. У стельных животных отмечают аборты, быки могут стать временно или постоянно стерильными. Возможна гибель больных животных при острой форме развития болезни, либо осложнении секундарной инфекцией [6, 8,16, 17, 19,20].
В связи с этим, исследования по изучению биологических свойств данного возбудителя с учетом выбора средств и методов диагностики, является актуальной задачей.
1.2 Разработанность проблемы.
На настоящий момент представлено небольшое число отечественных публикаций, касающихся изучения биологических свойств вируса ЗУД КРС. При этом большая часть исследований проводилась только с одним референтным полевым штаммом-прототипом «Neethling» вируса ЗУД КРС. На основе изучения его свойств, установлена чувствительность вируса к различным клеточным культурам, определены оптимальные условия его культивирования [15]. В ходе
исследований клинической картины заболевания установлено, что возбудитель ЗУД КРС вызывает повышение температуры, виремию и образование бугров на коже с последующим некрозом. При внутривенном заражении вызывает генерализованную инфекцию, а при внутрикожном - заболевание протекает в мягкой форме. Однако результаты работы по исследованию клинических признаков, вызываемых экспериментальным заражением животных штаммом «Э-95» вируса ЗУД, говорят о возможности вызывать заболевание естественно восприимчивых животных с характерными клиническими признаками при внутрикожном введении возбудителя [1,9, 12, 21].
Из-за недостаточной изученности биологических свойств вируса диагностические методы ограничены исключительно молекулярными подходами [13, 22].
В связи с вышеизложенным, изучение биологических свойств вируса ЗУД КРС с целью разработки новых средств диагностики и профилактики вышеуказанной болезни является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
1.3 Цель и задачи исследования Целью диссертационной работы являлось
изучение биологических свойств вируса ЗУД КРС штамм «ВНД КРС
/Дагестан/2015», выделенного на территории Республики Дагестан в 2015 г.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить распространение вируса ЗУД КРС на территории РФ за 2015-2018 гг.
-
Выделить вирус ЗУД КРС и изучить его культуральные свойства.
-
Подобрать наиболее технологичные условия культивирования штамма «ВНД КРС /Дагестан/2015».
-
Провести депонирование штамма «ВНД КРС /Дагестан/2015» вируса заразного узелкового дерматита в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
-
Изучить клинические признаки и патологоанатомические изменения, вызываемые при заражении естественно восприимчивых животных штаммом «ВНД КРС /Дагестан/2015» вируса ЗУД КРС.
-
Оптимизировать условия постановки реакции микронейтрализации (РМН) для выявления антител к вирусу ЗУД КРС.
1.4 Научная новизна результатов исследования.
В результате проведенных исследований впервые на территории РФ выделен вирус ЗУД КРС, получен изолят, который депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером (ссылкой) -«ВНД КРС/Дагестан/2015». Научная новизна подтверждена патентом на изобретение № 2606254 от 10.01.2017 г.
Изучены биологические свойства штамма «ВНД КРС/Дагестан/2015» вируса ЗУД КРС.
Изучена чувствительность различных клеточных культур к вирусу ЗУД КРС, в результате чего подобрана оптимальная система культивирования.
Воспроизведена генерализованная форма инфекции при заражении КРС штаммом «ВНД КРС/Дагестан/2015».
Оптимизированы условия постановки РМН для выявления антител к вирусу ЗУД КРС.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы.
Выделенный на территории Республики Дагестан штамм вируса ЗУД КРС признан оригинальным и депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» как штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» и может быть использован при разработке диагностических препаратов и их контроля при диагностики ЗУД КРС с возможностью его применения при проведении НИР с целью производства вакцинных препаратов для специфической иммунопрофилактики. В ходе выполнения научно-исследовательских работ по теме диссертации были разработаны, одобрены и утверждены ученым советом, директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» и Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору следующие методики:
-
«Методические рекомендации по выделению вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота в культуре клеток».
-
«Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу нодулярного дерматита крупного рогатого скота в реакции нейтрализации микрометодом».
1.6 Степень достоверности и апробации результатов исследования.
Результаты исследований по теме диссертации были опубликованы и
доложены на: Международной научной конференции молодых ученых «Достижение молодых ученых - в ветеринарную практику» в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2016г.); Международной научно - методической конференции по патологической анатомии животных (Ставрополь, 2017 г.); Всероссийская научно -практическая конференция молодых ученых «наука и инновация в АПК XXI века» (Казань, 2018 г.). И на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2015-2018гг.).
1.7 Публикации научных исследований. По теме диссертации
опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК
Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских
диссертаций.
1.8 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115
страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований,
выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа
иллюстрирована 14 таблицами и 25 рисунками. Список использованной
литературы включает 146 источников, из которых 63 на русском языке.
Эпизоотологическая характеристика ЗУД КРС
ЗУД – трансграничная, эмерджентная, вирусная инфекция КРС, основным источником возбудителя являются больные животные и реконвалесценты. При первичном возникновении болезни в стаде поражается от 5 до 50, в отдельных случаях 75 и 100% животных. Особенно более восприимчивы к инфекции животные европейских пород. У 50% заболевших животных болезнь может протекать латентно (бессимптомно) [37, 57].
Заболевание ЗУД КРС может протекать в острой, подострой и хронической формах, поражая животных всех возрастов и пород. Так же распространено скрытое (латентное) течение болезни, без наблюдаемых клинических признаков [29, 37 ,44].
Важные эпизоотологические особенности ЗУД, как нозологической единицы, обусловлены патогенезом болезни, биологическими свойствами возбудителя, и экологией. Выработанный в процессе эволюции механизм передачи возбудителя болезни включает следующие этапы:
- пути выделения возбудителя из организма больного (инфицированного) ЗУД КРС;
- факторы передачи, обеспечивающие временное сохранение вируса во внешней среде и доставку его к новому хозяину;
- пути проникновения (внедрения) возбудителя в организм и связанная с этим его первичная локализация [63]. Источником возбудителя ЗУД является больной КРС, ткани которого служат элективной средой для размножения вируса. В организме восприимчивых животных вирус ЗУД обладает выраженным тропизмом к клеткам эпидермиса, слизистых оболочек органов дыхания и пищеварительного тракта. Особенностью патогенеза ЗУД является наличие в течение 1-2 недель вирусемии, обеспечивающей выделение вируса во внешнюю среду. Возбудитель выделяется с выдыхаемым воздухом, слюной, истечениями из носа и глаз, спермой, молоком, экссудатами, а также при поражениях кожи и слизистых оболочек [29, 44, 63, 117].
В Ливане, Иране, Египте, Палестине, и Азербайджане инфекция распространилась после контактов животных на приграничных пастбищах с КРС сопредельных стран, в которых ранее были нотифицированы случаи ЗУД. Распространение вируса за пределы эпизоотического очага возможно: зараженными, а так же находящимися в инкубационной стадии животными, активными продуцентами возбудителя, реже реконвалесцентами. В этом случае источник инфекции выполняет функции не только выделителя, но и распространителя вируса на большие расстояния; пассивными (механическими) промежуточными переносчиками вируса – контаминированные продукты животноводства, корма, обслуживающий персонал, животные и предметы ухода за ними, транспортные средства. Доказаны факты механического переноса возбудителя кровососущими насекомыми, в том числе клещами, мухами [94, 101, 101].
Известно, что вирусы рода Capripoxvirus семейства Poxviridae часто размножаются в органах дыхания и в стадах передаются с выдыхаемым воздухом. Все это позволяет предполагать, что при ЗУД КРС недооценен аэрогенный (воздушно-капельный) механизм передачи инфекции. Нельзя исключать и возможность воздушно - пылевого, а также гемоконтактного механизмов заражения. Вирус распространяется с инфицированным молоком и спермой [2,18 ,20 ,52 ,67 ,68 ,69 ,70 ,79 ,80 ,85 ,92 ,93 ,141]. Экспериментальные и полевые данные показывают, что вирус ЗУД неэффективно передается между животными путем прямого контакта, хотя необходимы дальнейшие экспериментальные исследования с использованием достаточного количества животных и современных методов исследований, чтобы продемонстрировать прямую передачу. Передача через сперму (естественной случки или искусственного осеменения) было экспериментально продемонстрировано, и вирус был выделен в сперме экспериментально зараженных быков в течение 22 дней после заражения. Современные исследования продемонстрировали сохранение вируса в бычьей сперме до 42 дней, вирусная ДНК обнаруживалась до 159 дня [133]. В обоих исследованиях был выделен вирус из спермы КРС, не имеющих клинических признаков заболевания. При вспышке ЗУД в Египте в 20062007г, 640 коров были обследованы с использованием УЗИ. При этом 25% животных были инфицированы вирусом ЗУД, отмечено, что 93% из них имели дисфункцию яичников и не подавали никаких признаков течки. У инфицированных коров, яичники были меньших размеров, чем в среднем и не была отмечена активность яичников. Кроме того, отмечено снижение уровня прогестерона и альбумина, меди, железа в их крови[109].
Данные многих исследований свидетельствуют о том, что вирус ЗУД может механически передаваться с помощью различных кровососущих насекомых. Распространение ЗУД часто, но не обязательно, связано с теплыми и влажными погодными условиями, и с высокой плотностью кровососущих насекомых, что объясняет передачу инфекции между удаленными друг от друга стадами. Так, математические модели вспышек ЗУД в молочных стадах в Израиле 2006 года подтверждают предположение о том, что передача вируса произошла посредством насекомых-переносчиков [117]. Однако, мало информации о значении различных видов членистоногих переносчиков в естественных полевых условиях. Имеется предположение, что чем больше популяция насекомых (а возможно и их видовое разнообразие), то больше шансов приобретать, сохранять и передавать вирус[125, 124, 125].
Доказана механическая передача вируса клещами Rhipicephalus appendiculatus: после кормления на экспериментально зараженном крупном рогатом скоте, напитавшихся клещей переносили на нативных животных, которые стали виремичными и имели сероконверсию. Имеются доказательства в литературных источниках механической трансмиссии для Amblyomma hebraeum, хотя уровень вирусемии был очень низким. Роль tabanids (слепней) в передаче вируса заразного узелкового дерматита также недостаточно изучена[92, 93].
Значение различных членистоногих переносчиков вируса ЗУД КРС, вероятнее всего, будет отличаться для разных районов/регионов в зависимости от численности и видового состава насекомых, их трофических связей [119, 131].
Таким образом, в зависимости от различных экологических условий в различных регионах пострадавших стран, а так же особенностей распространения и кормления членистоногих, главную роль в механической передаче вируса могут играть разные виды насекомых [125].
Определенную роль в распространении инфекции играет человек. Вступая в прямой контакт с инфицированными животными и окружающей их средой, люди на своей одежде, обуви, на руках и в верхних дыхательных путях могут вынести вирус из очага, занести его в благополучные стада или распространить его на большие расстояния. Возбудитель может сохраняться длительное время в контаминированных грубых и концентрированных кормах, на корнеплодах. Такие объекты представляют собой эпизоотическую опасность, как передатчики патогена ЗУД [29, 31, 44].
Экспериментальные попытки передать вирус ЗУД КРС непрямым путем передачи (например, ручная обработка восприимчивых животных немедленно после манипуляций с зараженным), не удались. Поэтому был сделан вывод о том, что прямой или непрямой контакт между зараженными и восприимчивыми животными является неэффективным методом передачи.
Но, подобные исследования осложняются еще и тем, что только 50% зараженных животных проявляют клинические признаки, в то время как большинство экспериментально зараженных животных становятся виремичными без клинического проявления [33].
Анализ распространения ЗУД КРС в Российской Федерации за 2015-2018 г.
Российская Федерация (РФ) до 2015 г. оставалась благополучной страной по ЗУД КРС. Первый случай заболевания животных ЗУД на территории РФ был нотифицирован в июле 2015 г. на территории Северного Кавказа, в Тляратинском районе Республики Дагестан. В сентябре того же года заболевание было зарегистрировано у КРС, принадлежащего жителям населенных пунктов Хунзахского, Кумрторкалинского и Гергебильского районов Республики Дагестан.
В период с августа по сентябрь 2015 г. ЗУД КРС был диагностирован в Чеченской Республике, у животных, принадлежащих жителям сельских поселений Грозненского, Наурского и Надтеречного районов. В октябре случаи заболевания были зафиксированы в двух населенных пунктах Кировского района Республики Северная Осетия-Алания. Таким образом, в 2015 г. ЗУД КРС получил широкое распространение в республиках Северного Кавказа. Общее количество очагов ЗУД достигло 17, одиннадцать из которых приходилось на республику Дагестан.
По данным МЭБ в 2016 г ситуация повторилась, и в эпизоотический процесс, включились новые территории РФ.
В первом полугодие 2016 г. на территории России было выявлено 52 очага ЗУД, при этом в зону риска попали Ростовская область и Ставропольский край. К середине лета о неблагополучии сообщили еще 7 регионов РФ Чечня, Дагестан, Северная Осетия, Калмыкия, Ставропольский край, Краснодарский край и Астраханская область. Всего выявлено163 очага ЗУД, в которых, в общей сложности, заболело 3741 животное. К концу лета 2016 г количество очагов эпизоотии достигало 285, а количество пораженных субъектов 14. В Республике Дагестан - 27 неблагополучных пунктов, в Республике Калмыкия - 57, в Астраханской области - 10, в Краснодарском крае – 5, в Чеченской Республике - 90, в Ставропольском крае - 30, в Волгоградской области - 9, Республика Ингушетия - 35, Карачаево-Черкесской Республике - 8, в Ростовской области - 5, Республика Адыгея -1, в Тамбовской области - 1, в Воронежской области - 1, в Рязанской области -1.
Отдельно следует отметить вспышки в Тамбовской, Рязанской и Самарской областях (сентябрь-октябрь 2016 г), возникшие на значительном территориальном удалении от зоны распространения заболевания, и вероятнее всего эти вспышки были обусловлены несанкционированными перевозками животных.
На конец 2016 г. было зарегистрировано 313 очагов в 16 субъектах, 4-х федеральных округов (Южный, Северо–Кавказский, Центральный и Приволжский округа).
На рис 1 показаны неблагополучные регионы РФ по ЗУД КРС в 2015-2016 гг.
За 2017 г. в РФ нотифицировано 43 вспышки в 6 субъектах РФ, из них 4 субъекта (Саратовская, Ульяновская и Оренбургская области и Республика Башкортостан) были благополучны в 2016 г. (рис 2 карта 2017). Большая часть вспышек, особенно в Оренбургской и Саратовской областях, регистрировалась вдоль государственной границы с Республикой Казахстан.
В Волгоградской области регистрировали 3 неблагополучных пункта, в Оренбургской области - 11, в Республике Башкортостан – 1,в Самарской области - 3, в Саратовской области- 24, в Ульяновская области – 1 неблагополучный пункт.
По данным МЭБ за 2018 г. (данные представлены на 14.09.2018 г) в РФ нотифицировано 49 вспышек в 5 субъектах РФ. В Курганской области- 18 неблагополучных пунктов, в Оренбургской области-1, в Самарской области-25, в Саратовской области - 1, в Челябинской области - 4 неблагополучный пункт.
Основные данные об эпизоотической ситуации по ЗУД КРС в России в 2015-2018 г. отражены в таблице 1.
Нами были проанализированы результаты исследований биологического материала, поступившего из 18 регионов РФ (Астраханская, Волгоградская, Ростовская, Самарская, Саратовская, Воронежская, Рязанская, Оренбургская, Тамбовская область, Краснодарский и Ставропольский край, Республика Дагестан, Калмыкия, Башкортостан, Карачаево-Черкесская, Чеченская Республики, Курганской области, Челябинская области). Методом ПЦР-РВ было исследовано 948 проб биологического материала с подозрением на ЗУД КРС. Геном вируса ЗУД КРС был выявлен в 296 образцах, что составило 31,2% от общего числа исследуемых проб. В диагностики вирусных инфекций «золотым стандартом» является выделение вирусных агентов в чувствительных системах, в частности в культуре клеток. Важным преимуществом метода вирусовыделения является получение инфекционного вируса, который в дальнейшем может быть использован для антигенного и генетического анализа, а также выяснения важнейших биологических свойств возбудителя.
Задача следующего этапа исследований состояла в выделении изолятов вируса ЗУД КРС из проб биологического материала.
Исследования проводили согласно разработанной нами ранее схемы, которая в дальнейшем вошла в «Методические указания по выделению вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) крупного рогатого скота в культуре клеток» (Утверждены Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору от 13.09.2017). Выделение вируса ЗУД проводили в культуре клеток ТЯ в течение четырех-пяти последовательных пассажей, регистрируя наличие/отсутствие цитопатических изменений в клеточных культурах. Инфекционную активность вирусного материала определяли путем титрования общепринятым методом. Полученные данные подтверждали в ПЦР. За 2015-2018 гг. было исследовано 155 проб биологического материала, полученного из 15 субъектов РФ. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Изучение чувствительности различных перевиваемых линий культур клеток к вирусу ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015»
В настоящее время культуры клеток являются основной биологической системой для выращивания вирусов. Выбор наиболее чувствительных к вирусу клеточных систем для получения вируссодержащего материала с высокой биологической активностью является актуальной задачей.
На первом этапе работы определяли чувствительность монослойных культур клеток к вирусу ЗУД КРС. Для этого использовали следующие культуры клеток: ТЯ (субкультура), ЯДК-04,FBN, SIRC, ПТ, ПО, RK-13, ПС, СПЭВ, Vero, ТК, RBt, Taurus-2, BHK-21/13,MDBK,BGM. Вирус адаптировали к каждой культуре клеток в течение 5 последовательных пассажей. Для опытов использовали культуры с полностью сформированным монослоем. Культивирование осуществляли в пластиковых одноразовых матрасах площадью25 см3. Перед заражением культуры клеток ростовую среду сливали, монослой отмывали раствором Хенкса. Культуру клеток инфицировали вирусом с множественностью заражения 0,1 ТЦД50/кл и оставляли на контакт в термостате при температуре(37±1) С. После контакта добавляли поддерживающую среду (ПСП, Игла) с содержанием 1-2% фетальной сыворотки крови КРС. Репродуктивную способность вируса оценивали по времени появления цитопатического действия (ЦПД), интенсивности его развития и накоплению вируса. Определение инфекционной активности вируса ЗУД осуществляли путем микротитрования в культуре клеток ЯДК-04 общепринятым методом. Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3 . Результаты представлены в таблице 6.
В результате проведенных исследований было установлено что, при культивировании вируса ЗУД в культурах клеток ПТ, ПО, RK-13, ПС, СПЭВ, Vero-V, ТК, RBT, Taurus-2, BHK-21/13,MDBK,BGM наблюдали снижение инфекционной активности вируса в исследуемом материале, что указывало на непригодность использования данных клеточных культур для размножения вируса.
Наибольшая чувствительность к вирусу ЗУД установлена при заражении культур клеток ТЯ, ЯДК-04, FBN и SIRC. Титр полученного вируса в пассажах был в пределах 3,33±0,00-5,48±0,16 lg ТЦД50/см3; 3,02±0,14 - 5,17±0,15 lg ТЦД50/см3; 3,01±0,12- 4,25±0,16 lg ТЦД50/см3 и 3,01±0,17 - 4,15±0,131g ТЦДзо/см3, соответственно.
Проявление ЦПД в культуре клеток ЯДК-04 на 2 сутки после заражения, характеризовалось образованием большого числа округлых клеток, которые постепенно отслаивались от стекла и дегенерировали до детрита, а не разрушенные поражённые клетки собирались в крупные конгломераты (Рисунок 4-5).
ЦПД в культуре клеток ТЯ на 2 сутки инкубирования характеризовалось появлением веретенообразных клеток, которые позже округлялись и в большей части отслаивались от стекла, частично агрегировались без образования явного клеточного детрита (Рисунок 6-7).
В культуре клеток FBN на 2 сутки инкубирования происходило разрыхление монослоя. Часть клеток округлялись и агрегировались над монослоем. Также появлялись «окна» без клеток, которые имели тенденцию к увеличению (Рисунок 8-9).
ЦПД в культуре клеток SIRK на 2 сутки после заражения также начиналось с разрыхления монослоя, отслоения части клеток и их частичной агрегации. Межклеточное пространство увеличивалось, ядра и ядрышки оставшихся клеток значительно контрастировались по сравнению с контролем (Рисунок 10-11).
Таким образом, в ходе проведенных исследований было установлено, что культуры клеток ЯДК-04, ТЯ, FBN и SIRC оказались чувствительными и могут в дальнейшем служить субстратом для получения вирусной суспензии с инфекционной активностью от 4,25 до 5,48 lg ТЦД50/см3 .
Для дальнейшего изучения культуральных свойств вируса ЗУД КРС штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» использовали культуры клеток ТЯ и ЯДК-04, так как они имели самый высокий и стабильный титр в пассажах. Гомологичная клеточная культура FBN и гетерологичная культура SIRC имели более низкий титр инфекционной активности по сравнению с культурами клеток ЯДК-04 и ТЯ и потому могут служить дублирующими системами для дальнейших исследований.
Оптимизация условий постановки реакции микронейтрализации при выявлении антител против ЗУД КРС
Согласно руководству МЭБ, референтным методом выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ЗУД КРС является реакция нейтрализации (РН) [56].
Анализ литературных данных по ряду других инфекций показал, что на сегодняшний день наиболее оптимальным вариантом РН является ее вариант – реакция микронейтрализации (РМН) [56]
Отсутствие данных по эффективности использования реакции микронейтрализации в Российской Федерации послужило основанием для проведения исследований по оптимизации условий постановки реакции микронейтрализации (РМН) и возможности ее использования для выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ЗУД КРС в сыворотках крови животных.
Для постановки реакции использовали суспензию культуры клеток ЯДК-04. Определяли наиболее оптимальную посевную концентрацию клеток в диапазоне (0,2-0,8)х106. Для этого в ряд лунок вносили различные концентрации клеточной суспензии и ежедневно вели наблюдение в течение 48 часов. Опыты проводили не менее трех раз. Результаты этих исследований представлены в таблице 11.
В результате проведенных опытов установлено, что ровный монослой образовывался через 48 часов в лунках, где концентрация клеток была 0,4-0,5106кл/см3 . При концентрации клеток 0,2-0,3106кл/см3 монослой был не сплошной. При посевной концентрации клеток 0,7-0,8106кл/см3 в лунках образовывался сплошной монослой с дополнительными наслоениями, что затрудняло учет реакции.
Следующем этапом являлась оптимизация метода титрования вируса ЗУД КРС в культуре клеток ЯДК-04. Для этого предварительно в стерильных флаконах готовили 10-кратные разведения (от 10-1 до 10-7) вируссодержащего материала. Каждое последующее разведение вируса переносили из одного пенициллинового флакона в другой отдельной пипеткой.
Подготовленные разведения вируса переносили многоканальной пипеткой с 4 наконечниками, не меняя их, начиная с наивысшего разведения, в культуральные панели по 0,1 см3 .
Культуру клеток ЯДК-04, выращенную в пластиковых матрасах емкостью 50см3 , снимали со стекла при помощи смеси трипсина и версена в соотношении 1:9. Клетки ресуспендировали в питательной среде ПСП, содержащей раствор байтрила (0,05 мг/см3) и 5-10% фетальной сыворотки КРС до концентрации 0,4-0,5х106 кл/см3 . Затем во все лунки вносили по 0,1 см3 клеточной суспензии. Панель помещали в СО2 - инкубатор при 370 С и вели наблюдение в течение 96-120 часов. Заключительный учет титрования вируса проводили через 120 часов инкубирования с использованием инвертированного микроскопа, при условии сохранения монослоя в контрольных лунках. Было установлено, что оптимальным для постановки РМН является титр вируса в 2,0-3,0 lgТЦД50/см3 .
На основании результатов предварительного титрования готовили рабочие разведения вируса (100, 200, 300 рабочих доз).
Рабочие разведения вируса готовили на среде ПСП и использовали в течение 3-4 часов. Вирус с известным титром расфасовывали по 1,0 см3 в пенициллиновые флаконы и хранили при минус 80 С.
При разработке РМН в качестве позитивных сывороток использовали положительные сыворотки крови КРС, полученные от вакцинированных или переболевших животных. В качестве негативных сывороток использовали сыворотки, не имеющие антител к вирусу. Сыворотки хранили при температуре не выше минус 20 С.
Перед исследованием сыворотки в разведении 1:2 инактивировали на водяной бане при 56 С в течение 30 минут. Титрование сывороток проводили против 100, 200, 300доз вируса. Для этого в лунки панели вносили по 0,05 см3 среды, а затем, используя 12-канальную пипетку, вносили в лунки ряда А по 0,05 см3 исследуемой сыворотки. Без смены наконечников перемешивали содержимое лунки и переносили по 0,05 см3 от ряда А до ряда Н, готовя тем самым серийные 2-кратные разведения сыворотки. Из последнего ряда удаляли 0,05 см3 .
Подготовленные рабочие разведения вируса вносили во все лунки, используя для этого 4-канальную пипетку. Объем вносимого вируса составлял 0,05 см3 . Панели накрывали крышкой и помещали в СО2 -инкубатор на один час при 37 С.
После инкубации во все лунки панели вносили суспензию клеток в среде ПСП по 0,1 см3 . Панели инкубировали в СО2 - инкубаторе при 37 С в течение 120 часов. Микроскопию вели ежедневно, регистрируя лунки с выраженным ЦПД и/или лунки со сформировавшимся монослоем (таблица 12).
Из данных таблицы 12 видно, что титр антител зависел от дозы вируса. Наиболее оптимальной являлась рабочая доза вируса в пределах 100 единиц (2,0 lgТЦД50/0,2 см3). Негативные сыворотки при рабочих дозах 100-300 давали одинаковые отрицательные результаты (титр сыворотки 2,0 log2). Важнейшей задачей любых диагностических исследований является получение достоверных результатов. Поэтому для оценки пригодности методики необходим процесс валидации, включающий оптимизацию, стандартизацию, определение объективных параметров диагностической системы. Поэтому целью дальнейших исследований являлась оценка пригодности методики выявления антител к вирусу ЗУД КРС в сыворотках крови КРС в реакции микронейтрализации.
С целью оценки специфичности и чувствительности разработанного метода РМН проводили оценку уровня вируснейтрализующих антител в 250 сыворотках крови КРС, полученных на различные сроки после заражения в ходе проведения научно-исследовательской работы по изучению биологических свойств вируса ЗУД КРС у естественно-восприимчивых животных. Для оценки специфичности РМН были использованы гетерологичные сыворотки крови КРС против инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС, вирусной диареи (ВД) КРС, парагриппа-3 (ПГ-3) КРС. Результаты исследования частично представлены в таблице 13.