Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире 13
2.2. Диагностика ящура 30
2.3. Штаммовая дифференциация вируса ящура 41
2.4. Патогенность вируса ящура для естественно-восприимчивых животных 47
2.5. Изучение противоящурного поствакцинального иммунитета 51
2.6. Заключение по обзору литературы 57
3. Собственные исследования 58
3.1. Материалы и методы 59
3.1.1. Материалы 59
3.1.2. Методы исследований 63
4. Результаты собственных исследований 70
4.1. Характеристика вспышек ящура в России и зарубежных странах в 1990-2014 годах 71
4.1.1. Вспышки ящура в России в 1990-2014 гг 71
4.1.3. Вспышки ящура в Закавказье 101
4.1.4. Вспышки ящура на Ближнем Востоке 104
4.2. Лабораторная диагностика, выделение вируса ящура, изучение культуральных свойств эпизоотических изолятов 106
4.2.1. Адаптационные и репродуктивные свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типа А 106
4.2.2. Адаптационные и репродуктивные свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типа О 115
4.2.3. Адаптационные и репродуктивные свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типа Азия-1 138
4.3. Изучение патогенности изолятов вируса ящура на естественно восприимчивых животных 148 4.3.1. Чувствительность естественно-восприимчивых животных к изолятам вируса ящура типа А 148
4.3.2. Чувствительность естественно-восприимчивых животных к изолятам вируса ящура типа О 152
4.3.3. Чувствительность естественно-восприимчивых животных к изолятам вируса ящура типа Азия-1 159
4.3.4. Обнаружение антигена, генома вируса ящура и специфических антител в продуктах убоя животных 164
4.4. Определение антигенных свойств выделенных изолятов в сравнении с имеющимися производственными штаммами серологическими методами 167
4.4.1. Разработка метода определения антигенного соответствия эпизоотических изолятов и производственных штаммов вируса ящура в РМН 168
4.4.2. Оптимизация метода определения антигенного соответствия эпизоотических изолятов и производственных штаммов вируса ящура в ИФА.. 176
4.4.3. Антигенные свойства изолятов вируса ящура типа А в РМН, ИФА, РСК 178
4.4.4. Антигенные свойства изолятов вируса ящура типа О в РМН, ИФА, РСК 184
4.4.5. Антигенные свойства изолятов вируса ящура типа Азия-1 в РМН, ИФА, РСК 194
4.5. Определение антигенных свойств выделенных изолятов в сравнении с имеющимися производственными штаммами на естественно-восприимчивых животных и лабораторных животных 201
4.6. Изучение гуморального ответа у животных, иммунизированных вакцинами из актуальных штаммов вируса ящура 207
4.6.1. Изучение гуморального ответа у животных после иммунизации вакцинами из штамма вируса ящура типа А №2145/Киргизия/07 207
4.6.2. Изучение гуморального ответа у животных после иммунизации вакцинами из штамма вируса ящура типа А №2177/Амурский/2013 211
4.6.3. Изучение гуморального ответа у животных после иммунизации вакцинами из штамма вируса ящура типа О №2102/Забайкальский/2010 215
4.6.4. Изучение гуморального ответа у животных после иммунизации вакцинами из штамма вируса ящура типа Азия-1 № 2145/Таджикистан/2011 218
4.7. Паспортизация и депонирование актуальных штаммов 219
4.8. Изготовление диагностических препаратов на основе изученных изолятов и их использование в международных сличительных испытаниях 220
4.9 Обсуждение 233
5. Заключение 258
5.1. Итоги выполненного исследования 258
5.2 Практические предложения 260
6. Список сокращений и условных обозначений 263
7. Список литературы 265
8. Приложение 291
- Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире
- Вспышки ящура в России в 1990-2014 гг
- Чувствительность естественно-восприимчивых животных к изолятам вируса ящура типа О
- Изготовление диагностических препаратов на основе изученных изолятов и их использование в международных сличительных испытаниях
Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире
Первое письменное описание ящура произошло в 1514 году, когда венецианский врач, писатель и учёный-исследователь в области медицины Джироламо Фракасторо (1478-1553) описал похожую на ящур болезнь крупного рогатого скота в Италии. Почти 400 лет спустя, в 1897 году, немецкие микробиологи Ф. Лёффлер и П. Фрош продемонстрировали, что заболевание животных ящуром вызывает фильтрующийся агент. Впоследствии было показано, что вирус ящура состоит из одноцепочечной РНК, состоящей из 8500 нуклеотидных оснований, окруженной четырьмя структурными белками, образующими икосаэдрический капсид. Вирус ящура относится к роду Aphthovirus семейства Picornaviridae, имеет семь серологически идентифицированных серотипов (A, O, C, Aзия-1 и SAT 1, 2 и 3), а также множественные антигенные варианты, встречающиеся в каждом серотипе.
Успешная программа вакцинации в Западной Европе после 1989 года привела к прекращению вспышек ящура, в связи с этим в 1992 г. Европейский союз принял политику без вакцинации. С 1992 по 2001 г. в этом регионе было всего несколько ограниченных вспышек - в Болгарии в 1991, 1993 и 1996 годах, Италии в 1993 году, России в 1993 и 1995 годах, Греции в 1994, 1996 и 2000 годах; и Албании, Македонии и Югославии в 1996 году. В течение того же периода в Южной Америке также были достигнуты значительные успехи в борьбе с ящуром с использованием ежегодных кампаний вакцинации и отбраковки животных. К концу 1990-х годов Аргентина, Чили, Уругвай, южная часть Бразилии и Гайана были признаны международным сообществом свободными от ящура без вакцинации. Несмотря на то, что ящур все еще наблюдался на Ближнем Востоке и во многих странах Африки и Азии, в конце 20-го века, в развитых странах и странах, занимающихся международной торговлей животными и продуктами животного происхождения, ящур был под контролем [35, 118, 128]. С 1996 по 2000 г. заболевание регистрировали в 88 странах мира, в том числе в 34 азиатских, 33 африканских, 8 южноамериканских, 5 европейских и 8 государствах СНГ.
Крупная эпизоотия ящура типа О имела место в 1997 г. на Тайване, где возникло более 6 тыс. очагов инфекции, пало и было уничтожено свыше 4 млн. свиней. Общий экономический ущерб составил около 10 млрд. долл. США [93].
Из стран СНГ в 1996 - 2001 гг. благополучными по ящуру были Украина, Молдова и Беларусь, которые вследствие географического положения и того, что граничат с благополучными по ящуру государствами, как и многие европейские страны отказались от политики профилактической иммунизации животных против ящура в начале 90-х годов. В Центрально-Азиатском регионе в указанный период благополучной по ящуру была Республика Узбекистан.
Ситуация в государствах СНГ обострилась в связи с неблагоприятной эпизоотической обстановкой по ящуру, особенно экзотических типов, в некоторых пограничных с ними государствах. Появившийся в 1996 - 1998 годах новый вариант вируса типа А в Иране и Турции в 1998 году был занесен в Армению и Грузию. Этот вариант вызывал заболевание даже у вакцинированных животных, так как вакцина из вируса ящура А22 практически не защищала животных от нового варианта.
В 1996 - 2002 гг. неблагополучными по ящуру были Азербайджан (1996, 2001 гг.), Армения (1996, 1998 гг.), Грузия (1996 - 2001 гг.), Казахстан (1996, 1998 - 2001 гг.), Кыргызстан (1996 - 1999, 2001 гг.), Таджикистан (1997, 2000 гг.), Туркменистан (1997, 1999 гг.) и Россия (2000 г.). На территории Центральной Азии выделяли вирус ящура типов О и А, тогда как в Закавказье еще и экзотического типа Азия-1.
В 1999 г. впервые после 1991 г. ящур экзотического типа Азия-1 был установлен в Иране, затем в Турции, откуда в 2000 г. был занесен в Армению, Грузию и Грецию, а в 2001 г. - в Азербайджан, а в 2003 г. – и в Таджикистан. В 1999 - 2001 гг. множество очагов ящура типов О, А и Азия-1 отмечалось среди КРС и МРС в Иране и Турции, в том числе в районах, пограничных с Арменией, Азербайджаном и Туркменистаном.
В 1999 г. в Китае были отмечены вспышки ящура типа О среди КРС и свиней, в 2000 и 2001 гг. - среди свиней. В 2000 г. ящур типа О возник среди КРС в благополучных длительное время Японии и Южной Корее.
В апреле - мае 2000 г. вспышки ящура типа О отмечены среди КРС, МРС и верблюдов в благополучной с 1974 г. Монголии вблизи границы с Китаем. В феврале 2001 г. ящур этого же типа вновь был зарегистрирован среди КРС и МРС в Монголии, в том числе около границы с Читинской областью России, в июле 2002 г. - на западе Монголии на границе с Россией и Казахстаном. В феврале 2001 г. ящур типа О был установлен среди КРС и овец в Кыргызстане.
Следует более детально остановиться на эпизоотии ящура типа О в 2001 г. в Западной Европе. После 20-летнего благополучия первый случай ящура в Великобритании был зарегистрирован 20.02.2001 г. на бойне у взрослых свиней. Великобритании, а в марте 2001 г. - во Франции, Ирландии и Нидерландах. Выделенный вирус был отнесен к паназиатскому штамму типа О, который в 2000 г. вызывал вспышки болезни в ряде стран, в том числе на Тайване, в Южной Корее, Японии, Монголии и России (Приморский край). Предполагают, что возбудитель был занесен в Великобританию из Азии вследствие нелегального завоза животноводческой продукции. Начало эпизоотии совпало с мусульманскими праздниками, когда мусульмане покупали живых овец, в том числе в ряде случаев уже инфицированных вирусом ящура или со стертой клинической картиной болезни. В этом случае рынки способствовали распространению ящура в Великобритании. С овцами ящур был занесен во Францию (2 очага) и в Нидерланды (26 очагов).
Для борьбы с ящуром в Великобритании была избрана стратегия "стемпинг-аут", т.е. уничтожение всех животных в очагах при отказе от политики вакцинации, однако это оказалось неэффективным. Из Великобритании ящур был занесен в Северную Ирландию, где возникли четыре очага, а затем в Республику Ирландию (один очаг). В странах Европы проводили политику "стемпинг-аут", кроме Нидерландов, где наряду с убоем животных осуществляли еще и кольцевую вакцинацию. В последующем всех вакцинированных животных уничтожили, провели детальные клинические и серологические исследования и в соответствии с Международным ветеринарным кодексом Нидерланды возвратили себе статус "страны, благополучной по ящуру без вакцинации".
В Великобритании эпизоотия ящура продолжалась более 7 месяцев, было зарегистрировано 2030 ящурных очагов. За 9 месяцев было убито и уничтожено более 4 млн. голов животных разных видов, в том числе 3,3 млн. голов овец, почти 600 тыс. голов КРС, 145 тыс. голов свиней, 2,5 тыс. голов коз, 1,6 тыс. голов оленей и других животных. Только через 11 месяцев после возникновения эпизоотии Соединенное Королевство (Великобритания и Северная Ирландия) вернуло себе статус "страны, свободной от ящура без вакцинации". Общий экономический ущерб для страны в целом оценивается в 31 млрд. долл. США [85, 86].
Очень неблагоприятная ситуация отмечалась в 2001 г. в некоторых странах Южной Америки. Так, в Аргентине, благополучной по ящуру с 1994 года, с 12.03.01 по 16.06.01 возник 1351 ящурный очаг типа А среди КРС и свиней, в Уругвае - с 25.04.01 по 21.08.01 около 2 тыс. очагов типа А с поражением КРС, овец и свиней. В Бразилии с 05.05.01 по 18.07.01 отмечено 30 очагов типа А с поражением КРС и свиней. В этих странах параллельно проводили уничтожение больных животных и вакцинацию [12].
В 2001-2003 гг. ящур был установлен в 71 стране, в том числе в 31 азиатской, 25 африканских, 8 южноамериканских и 7 европейских. В указанный период были идентифицированы все известные типы вируса, но преобладали типы О и А. В некоторых странах регистрировали два, три и даже четыре - пять типов (Иран, Турция, Индия, Пакистан, Непал, Кувейт, Кения, Танзания, ЮАР, Чад, Боливия, Парагвай и др.). Ящур типа САТ-2 впервые вышел за пределы Африки: в 1999 г. его регистрировали в Саудовской Аравии, в 2002 г. – в Кувейте, летом 2003 г. ящур этого серотипа получил распространение на севере Африки, в частности, в Ливии. В 2004-2006 гг. неблагополучными по ящуру были 64 страны, в том числе 30 азиатских, 28 африканских и 6 южноамериканских. При этом регистрировали ящур всех семи типов: тип О был установлен в 46 странах, А – в 24, С – в 4, САТ-1 – в 10, САТ-2 в 17, САТ-3 – в 5, Азия-1 – в 10. В 11 африканских и азиатских странах возбудитель не был типирован.
В 2005-2006 гг. на территорию Ближнего Востока были отмечены три крупных вторжения вируса ящура. Ящур, вызванный типом О генетической линии ПанАзия, впервые выявленный в Индии в 2001 г. и в последующем распространившийся в восточном направлении в Малайзию, в 2005 г. попал в Пакистан и Иран, в 2006 г. – в Турцию и Иорданию. В Израиле ящур типа О среди КРС имел место в декабре 2005 г. В феврале-марте 2006 г. ящур этого типа вызвал массовое заболевание КРС и овец в Палестине.
Ящур типа А генетической линии Иран 05, впервые обнаруженный в Иране в 2003 г., в 2005 г. получил распространение в Саудовской Аравии, а в 2006 г. - в Пакистане, Турции и Иордании. В 2006 г. ящур типа А широко распространился среди КРС в европейской части Турции – Фракии, которая граничит с Болгарией и Грецией. Выделенные во Фракии изоляты отличались от штаммов типа А генетических линий Иран 96 и Иран 99, циркулирующих в Турции ранее и были отнесены к генетической линии А Иран 05 [162].
Значительное распространение в 2006-2007 гг. в Египте получил ящур другого штамма типа А, поразивший КРС и буйволов с большой смертностью молодняка. Выделенный вирус оказался генетически близок к группе восточно-африканских штаммов, в частности, к вирусу А/Эритрея/98 [40, 143].
Вспышки ящура в России в 1990-2014 гг
Вспышка ящура типа А в Тюменской области в 1990 г.
В 1990 г. ящур типа А22 был установлен в Советском районе Тюменской области, которая в течение 20 лет входила в зону, не подлежащую вакцинации против ящура. Заболевание возникло на двух соседних фермах лесопредприятия "Пионерский", на которых содержались 79 голов КРС и 69 свиней разного возраста. В очаге пали 19 телят и 23 поросенка. После установления диагноза было принято решение об уничтожении всех восприимчивых животных на фермах. На неблагополучный населенный пункт был наложен карантин, запрещено передвижение (перевозка) животных и продуктов животного происхождения за пределы карантинируемой территории. Была определена угрожаемая зона (Советский и прилегающие к нему районы), в которых провели срочную вакцинацию всех восприимчивых к ящуру животных. При данной стратегии борьбы ящур удалось ликвидировать в первичном очаге, и он не получил дальнейшего распространения. При выяснении путей заноса вируса ящура было установлено, что лесопредприятие незадолго до возникновения заболевания получило сено из неблагополучной по ящуру типа А22 местности Центральной Азии, т.е. имел место занос вируса ящура с фуражом.
Вспышка ящура типа А во Владимирской области в 1993 г.
В 1993 г. ящур типа А был установлен во Владимирской области, которая входила в зону систематической вакцинации крупного рогатого скота против ящура типов А, О и С. Заболевание возникло в с. Спасское Суздальского района в личном хозяйстве вблизи биопредприятия, выпускающего противоящурную вакцину. Афтозный патологический материал от заболевшей коровы в день обнаружения был подвергнут лабораторному исследованию. Корова в тот же день была уничтожена, как и контактировавшие с ней 2 головы молодняка КРС, 12 овец и 2 подсвинка. Были срочно осуществлены вынужденные вакцинация и ревакцинация восприимчивых животных, проведены охранно-карантинные, ветеринарно-санитарные и другие мероприятия. Ящур был ликвидирован в первичном очаге.
Вспышка ящура типа О в Московской области в 1995 г.
В июне 1995 г. ящур был диагностирован у не вакцинированных свиней на свиноферме племзавода «Петровское», расположенной на окраине г. Лыткарино Люберецкого района Московской области. Племзавод «Петровское» включал в себя 3 населенных пункта, расположенных на расстоянии 10 км друг от друга. Данное хозяйство специализировалось на выращивании племенного КРС, который содержался в двух населенных пунктах. В третьем – была расположена свиноферма. КРС систематически подвергался плановой вакцинации против ящура типов А и О, вакцинация свиней не предусматривалась.
При лабораторных исследованиях патологического материала во ВНИИЗЖ из него был выделен вирус ящура типа О, относящийся к группе вирусов Гонконг/1993 - 1995. Из имеющихся на ферме 5800 свиней различного возраста, размещенных в 15 помещениях, в одном свинарнике было обнаружено около 200 больных свиней и более 50 павших поросят. На хозяйство был наложен карантин с осуществлением ветеринарно-санитарных мероприятий внутри хозяйства и угрожаемой зоны, запрещен вывоз (включая экспорт) животных и продуктов животноводства за пределы Московской области. После установления диагноза больные свиньи на свиноферме были убиты бескровным методом и уничтожены, а клинически здоровые животные срочно привиты бивалентной эмульсионной вакциной для ранней защиты животных. С профилактической целью этой же вакциной были привиты свиньи всех возрастов и в других хозяйствах Московской области в количестве 357 тыс. голов. Кроме того, в хозяйствах Московской области, в которых животным угрожало заражение, были привиты 4357 овец и ревакцинированы 197825 голов крупного рогатого скота с использованием ГОА -сапонинвакцины. После проведения данного комплекса мер последующих вспышек ящура не наблюдалось, и было принято решение об уничтожении всех свиней бескровным методом в первичном очаге. Предполагается, что вирус ящура на племзавод "Петровское" мог быть занесен с замороженной свининой Китая, которая поступила на расположенное рядом мясоперерабатывающее предприятие из неблагополучной по ящуру страны-импортера. Экономический ущерб от этой вспышки ящура был оценен в 3,2 млн. долл. США.
Вспышка ящура типа О в Приморском крае в 2000 г.
В 2000 г. ящур типа О был установлен на СТФ «Элитное» ОПХ «Степное» Уссурийского района Приморского края, который был благополучен по ящуру с 1964 г. Расстояние от неблагополучной по ящуру свинофермы до границы с Китаем, с которым имелись хозяйственные связи, составило около 70 км. В неблагополучном пункте и в близлежащих районах были осуществлены карантинные мероприятия и проведена вакцинация восприимчивых животных против ящура. Новых зарегистрированных вспышек ящура в последующем не было. Все свинопоголовье в ящурном очаге было убито и захоронено на его территории, прямой ущерб составил 8,7 млн. рублей и косвенный – 17,5 млн. рублей (900 тыс. долл. США).
Вспышка ящура типа О в Амурской области в 2004 г.
В апреле 2004 г. в с. Садовое Тамбовского района Амурской области в 15 км от границы с Китаем на ферме ОНО «ОПХ ВНИИ сои» произошло заболевание КРС ящуром. На неблагополучной ферме содержалось 227 коров и 597 голов молодняка. Заболевание было зарегистрировано у дойных коров в возрасте 12 мес и молодняка 4-12 мес. Количество заболевших животных - 87 голов. 50 голов молодняка с признаками ящура были вынужденно убиты на мясокомбинате г. Благовещенска. Сначала ветеринары подозревали отравление животных, однако специалисты ВНИИЗЖ поставили диагноз – ящур типа О, вызванный вирусом паназиатской генетической линии. С 16 апреля 2004 г. территория отделения №1 «ОПХ ВНИИ сои», ЗАО «Благовещенский мясокомбинат» и территория Благовещенской городской свалки были объявлены неблагополучными по ящуру, территория фермы КРС отделения №1 – очагом инфекции. С 18 апреля 2004 г. на территории города Благовещенска был введен режим чрезвычайной ситуации. Территории Тамбовского, Михайловского, Благовещенского, Октябрьского, Ивановского и Константиновского районов и г. Благовещенска являлись угрожаемой зоной по ящуру. Вспышка была купирована путем убоя всех животных фермы (940 голов) и проведением вынужденной вакцинации и ревакцинации на территории Амурской области. Первичная вакцинация всего восприимчивого поголовья была завершена к 30 апреля 2004г. Ограничения были сняты после завершения ревакцинации и проверки напряженности иммунитета у вакцинированных животных в угрожаемой зоне. Прямой ущерб составил около 32 млн. рублей.
Вспышка ящура типа Азия-1 в Амурской области в июне 2005 г.
В 2005 г. ситуация по ящуру в России значительно осложнилась в связи с заносом вируса ящура типа Азия-1 в Амурскую область, Хабаровский и Приморский края. В 2005 г. в РФ было 16 неблагополучных пунктов и в 2006 г. – 2. Ящур типа Азия-1 являлся экзотическим для нашей страны, и профилактическая вакцинация животных против него не проводилась.
Первый очаг был установлен 9 июня 2005 г. в селе Буссе Свободненского района Амурской области. Село располагается на левом берегу реки Амур. Река Амур шириной в 300 м отделяет село от территории КНР. Расстояние до ближайшего от с. Буссе населенного пункта на территории России составляет 20 км. В селе имелся скот, содержащийся в 45 частных дворах, в том числе 171 голова КРС, из них 61 дойная корова, 37 голов МРС и 9 свиней.
КРС и МРС свободно выпасались вне стада в окружающей лесистой местности. Животные в апреле 2005 г. с профилактической целью в соответствии с планом систематической вакцинации были иммунизированы инактивированной сорбированной вакциной против ящура типа О.
От животных, у которых 09.06.05 г. были отмечены клинические признаки ящура, был отобран патологический материал для исследования и направлен в ФГУ «ВНИИЗЖ». После подтверждения диагноза и установления ящура типа Азия-1 лабораторными методами (РСК, ИФА, ОТ-ПЦР, выделение вируса) в Региональной референтной лаборатории МЭБ по ящуру (ФГУ «ВНИИЗЖ») было послано срочное сообщение в Россельхознадзор и Амурскую область. На неблагополучный пункт был наложен карантин и введены ограничения в Амурской области. В МЭБ было направлено срочное извещение об установлении очага ящура типа Азия-1 в Амурской области.
В селе Буссе в течение недели в 10 дворах заболело ящуром 42 головы КРС разного возраста, гибели среди них не наблюдали. У других видов восприимчивых животных заболевания ящуром не отмечали.
Все животные села Буссе были убиты бескровным методом путем внутримышечного введения препарата «адилин-супер» и захоронены в специально отведенном месте на территории неблагополучного пункта с соблюдением ветеринарно-санитарных требований.
Вокруг неблагополучного пункта была выделена угрожаемая зона и зона наблюдения и проведена вынужденная двукратная вакцинация животных против ящура: КРС и МРС инактивированной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1, свиней – инактивированной эмульсионной вакциной против ящура типа Азия-1 (таблица 2). Был выполнен большой комплекс дезинфекционных работ, введен строгий контроль за перемещением животных.
Чувствительность естественно-восприимчивых животных к изолятам вируса ящура типа О
В таблице 31 представлены результаты изучения патогенности изолятов вируса ящура типа О для естественно-восприимчивых животных. Повторное выделение О №1685/Московский/95 на свиньях проводили путем введения одному подсвинку суспензии культурального вируса ПСГК-30 2 и 3 пассажей с титром инфекционной активности в культуре клеток СП - 7,0 lg ТЦД50/мл. Второй подсвинок находился в контакте с зараженным животным. Образование созревших афт регистрировали в 1 пассаже через 72 ч после прямого заражения. Титр инфекционной активности вируса в 10% афтозной суспензии в культуре клеток СП составлял 6,33 lg ТЦД50/мл. Через 5 суток были обнаружены афтозные поражения у контактного подсвинка. Титр инфекционной активности вируса, полученного путем контактного заражения, на свиньях составил 7,0 lg ИД50/0,1мл, в культуре клеток СП – 8,33 lg ТЦД50/мл.
Для реизоляции вирус ящура типа О Тайвань 3/97 двум подсвинкам массой 25 кг внутрикожно вводили суспензию культурального вируса ПСГК-30 2 пассажа по 0,1-0,2 мл в 8 точек венчика каждой конечности. Через 48 ч после заражения регистрировали афтозные поражения на месте введения. Через 30 ч после инокуляции афтозной суспензии вируса 1 пассажа двум подсвинкам были собраны созревшие афты 2 пассажа. Инфекционный титр вируса, определенный по методу Рида и Менча, составил 5,5 lg ИД50/0,1мл.
Для изучения чувствительности КРС к изоляту О №1734/Приморский/2000, выделенному от свиней, культуральный вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, вводили интрадермолингвально. Созревание афт в 1 пассаже наблюдали через 36 ч после заражения. Во втором и третьем пассажах время созревания афт на месте введения как цельной 10% суспензии афтозного вируса, так и 10-кратных разведений сократилось до 26-24 ч. Вторичные афтозные поражения на задних конечностях обнаруживались на 4 сут после заражения в первом и втором пассажах, в третьем – уже на 3 сут после введения вируса.
Титр инфекционной активности вируса ящура типа О №1734/Приморский/2000, полученного при заражении КРС и определенный по методу Гендерсона, составил 4,85 lg ИД50/0,1 мл, а в культуре клеток СП - 7,66 lg ТЦД50/мл.
Для реизоляции вируса ящура типа О №1734/Приморский/2000 на свиньях животным вводили 10% афтозную суспензию КРС 3 пассажа Афтозные поражения регистрировали через 30 ч после введения вируса. Титр инфекционной активности афтозного вируса ящура О №1734/Приморский /2000 4 пассажа при определении на свиньях составил – 5,17 lg ИД50/0,1 мл, а в культуре клеток СП – 6,66 lg ТЦД50/мл.
Для выделения изолята вируса ящура типа О № 2041/Нагорный Карабах/07 на КРС использовали смесь культуральной суспензии ПСГК-30 3 пассажа и 10% афтозной суспензии КРС в соотношении 1:2,5. Через 33 часа после заражения были получены афты 1 пассажа с титром инфекционной активности в культуре клеток СП – 5,25 lg ТЦД50/мл. Во втором пассаже созревшие афты обнаруживали через 35 ч после заражения. Титр инфекционной активности вируса ящура О № 2041/Нагорный Карабах/07 на КРС составил 4,0 lg ИД50/0,1 мл, на культуре клеток СП – 7,5 lg ТЦД50/мл.
Интрадермолингвальное заражение КРС проводили вирусом ящура типа О/Саудовская Аравия/2008, адаптированным в перевиваемой культуре клеток ПСГК-30 5 пассажа с титром инфекционной активности 6,0 lg ТЦД50/мл. Наблюдение за животным вели в течение 22 суток.
В первые сутки после заражения у животного отмечали обильное слюнотечение, чавканье, повышение температуры тела на 1,3оС, появление обширной первичной афты на языке. Титр инфекционной активности афтозного вируса на КРС составил 4,25 lg ИД50/0,1 мл, а в культуре клеток СП - 4,75 lg ТЦД50/мл. На вторые сутки наблюдали начало эпителизации слизистой оболочки языка, появление вторичных афт в межкопытных щелях грудных и тазовой конечностей, повышение температуры тела на 1,7оС. Развитие генерализованной формы инфекционного процесса – афты в межкопытных щелях и пяточных углах на конечностях отмечали через 5 суток после заражения. С 11 по 22 сутки после заражения - продолжение эпителизации эрозии языка, заживление афт в межкопытных щелях и пяточных углах на конечностях.
В следующей серии опытов было проведено экспериментальное заражение 2 баранов вирусом ящура, выделенным в Саудовской Аравии в феврале 2008 г. от овец. Вирус вводили интрадермолингвально по 1,25 мл, в несколько точек по 0,2 мл.
Через сутки после заражения у животного №1 отмечали незначительную саливацию и появление трех афт диаметром 2–3 мм на месте введения. У животного №2 также было отмечено обильное пенистое слюнотечение и появление многочисленных вскрывшихся афт в местах введения вируса. Через 48 часов после инокуляции вируса у обоих животных наблюдали грануляцию дна язв на языке. На третьи сутки после заражения у животного №1 у основания корня языка обнаруживали вскрывшуюся афту овальной формы размером 1,01,5 см, кроме того, отмечалась хромота на задние конечности. У барана №2 видимых изменений не наблюдали. На четвертые сутки после введения вируса у животного №1 отмечали появление 2-х вторичных афт на внутренней стороне копытца правой задней конечности: одну - диаметром 1,0 см на пяточной части копытца, другую -вскрывшуюся размером 1,00,5 см в области межкопытцевой щели. У животного №2 обнаруживали вскрывшуюся афту овальной формы размером 1,01,5 см у основания корня языка, признаки генерализации отмечены не были. Начиная с 5 суток после заражения, в сыворотках крови баранов в ИФА обнаруживали антитела к вирусу ящура типа О в разведении 1:1280 и антитела к неструктурным белкам вируса ящура, подтверждающие переболевание животных ящуром.
Для повторного выделения вируса О №2101/Казахстан/2010 на КРС была использована суспензия вирус ящура, адаптированного к культуре клеток ПСГК 156 30 на уровне 2 пассажа с титром инфекционной активности 6,75 lg ТЦД50/мл. Следующий пассаж осуществляли интрадермолингвальным введением 2 головам КРС 10% афтозной суспензии вируса ящура типа О №2101/Казахстан/2010 1 пассажа с титром инфекционной активности вируса 5,0 lg ИД50/0,1 мл в дозе 104,0 ИД50 по 0,1 мл в 2 точки. Наблюдение за животными вели в течение 9 суток. В первые сутки после заражения отмечали появление афт на месте введения размером 22 см и 53 см. На вторые сутки регистрировали повышение у животных температуры тела на 2оС, саливацию, вскрывшиеся афты и эрозии на языке, болезненность межкопытной щели, образование афт в пяточном углу. Генерализованную форму инфекционного процесса - афтозные поражения в межкопытных щелях на четырех конечностях, эрозии по всей поверхности языка регистрировали через 3 суток после заражения. С 6 по 9 сутки после заражения у животных наблюдали саливацию, эпителизацию слизистой оболочки языка, наличие афт в межкопытной щели, появление афт на губах. При патологоанатомическом вскрытии у павшего на 8 сутки после инокуляции вируса животного была обнаружена дистрофия сердечной мышцы, инфаркты желудочков и предсердий.
Для реизоляции изолята О/Ливан/2010 на КРС был использован вирус, адаптированный в культуре клеток ПСГК-30 4 пассажа с титр инфекционной активности 6,5 lg ТЦД50/мл. В первом и втором пассажах на КРС первичные афты собирали через 30 ч после заражения афты, повышение температуры тела регистрировали на 2-4 сутки на 1,5-1,6 оС. Через 3-5 суток после заражения у животных отмечали развитие генерализованной формы инфекционного процесса -афтозные поражения в межкопытных щелях четырех конечностей. В третьем пассаже через 27 ч после заражения наблюдали повышение температуры тела у животного на 2,4 оС, созревание первичных афт, а на вторые сутки - афтозные поражения в межкопытных щелях четырех конечностей. Титр инфекционной активности вируса ящура 3 пассажа на КРС составил 4,0 lg ИД50/0,1 мл, культуре клеток СП – 5,25 lg ТЦД50/мл.
Культуральный вирус О №2102/Забайкальский/2010 с титром инфекционной активности 6,33 lg ТЦД50/мл был использован для заражения подсвинка. В течение трех пассажей вирус вызывал образование первичных афт через 48 ч после инокуляции, тогда как к 4-6 пассажам первичные афты наблюдали через 24 ч после введения вируса. Титр инфекционной активности афтозного вируса 6 пассажа при титровании на свиньях составил 5,0 lg ИД50/0,1мл, а в культуре клеток СП – 7,0 lg ТЦД50/мл.
Для выделения вируса О №2108/Забайкальский/2010 бычка заражали интрадермолинвально культуральным вирусным материалом с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД50/мл. После проведения 3 последовательных пассажей титр инфекционной активности афтозного материала составил 4,0 lg ИД50/0,1мл, а в культуре клеток СП – 5,5 lg ТЦД50/мл.
Суспензию из патологического материала вируса О Забайкальский/2011 (п. Усть-Ималка Ононского района) вводили КРС интрадермолингвально. Материал, полученный из эпителия языка КРС в первом пассаже, не вызывал ЦПД при заражении чувствительных культур клеток, а также образование афт при проведении второго пассажа на КРС в течение 72 ч после заражения. Таким образом, выделить вирус ящура из поступивших проб патологического материала на КРС, также как и на КК, не удалось.
Изготовление диагностических препаратов на основе изученных изолятов и их использование в международных сличительных испытаниях
Вариабельность структуры вируса ящура, его способность к высокой частоте мутаций требуют постоянного изучения полевых изолятов с целью замены менее актуальных в современной эпизоотической ситуации штаммов для повышения эффективности диагностических исследований. В связи с появлением новых антигенно отличающихся от производственных штаммов изолятов ВЯ постоянно проводилась работа по получению антигенов и сывороток типо- и штаммоспецифических для серологических реакций и новых диагностических тест-системы для ИФА.
В разные годы для проведения для выявления и идентификации изолятов и для определения компонентного состава вакцин с использованием РСК применяли сыворотки типо- и штаммоспецифические А №1707/Армения/98, А Турция/06, А Иран/05, А № 2145 Киргизия/07, А Кути/2013, А/Забайкальский /2013, А/Краснодарский/2013, А/КБР/2013, О №1734/Приморский/2000, О/Казахстан/07, О ПанАзия2, О №2102/Забайкальский/2010, №2108/Забайкальский/2010, Азия-1 №1987/Амурский/05, Азия-1/Пакистан/09, Азия-1/Таджикистан/2011 и др.
Характеристика антигенов ВЯ типа О для ИФА представлена в таблице 71. На примере штаммов ВЯ А Турция/06, О №1734/Приморский/2000 представлена схема получения вирусоспецифических препаратов антител, используемых в диагностических тест-системах для идентификации ВЯ и определения специфических антител с использованием адъювантов серии Montanide. Для иммунизации морских свинок использовали антигены ВЯ А Турция/06, О №1734/Приморский/2000, при спектрофотометрическом контроле концентрация вирусного белка составила 180 и 330 мкг/мл, соответственно. С помощью метода электрофореза белков в ПААГ показано наличие основных структурных белков вириона ВЯ: VP1, VP2 и VP3, что свидетельствует о преобладании в данных препаратах 146S-частиц. Активность препаратов антигена ВЯ в ИФА составляла 1:500 и 1:1000. По результатам электронной микроскопии образцы антигенов были гомогенными без примеси балластных белков, концентрация вирионов составляла 109–109,5 lg.
После одно- и двукратной иммунизаций животных определяли активность вирусоспецифических сывороток с помощью серологических методов.
Было установлено, что иммунизация животных вызывала выработку высокого уровня антител в сыворотке крови.
Результаты исследования в ИФА и РМН сывороток крови морских свинок против ВЯ А Турция/06 представлены в таблице 73.
Из представленных в табл. 73. данных следует, что через 21 сут после первого введения эмульсий в ИФА и РМН в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных антигеном вируса ящура А Турция/06, наблюдалась динамика накопления антител, которая зависела от сроков после иммунизации и от 223 использования различных адъювантов. По данным ИФА наиболее высокий уровень антител в сыворотках крови был при использовании Montanidе ISA 206 и Montanidе ISA 70М VG.
После второй иммунизации самая высокая активность антител 1:27000 в сыворотках крови животных при исследовании в ИФА была получена в ответ на иммунизацию морских свинок антигеном в смеси с адъювантами Montanidе ISA 206, Montanidе ISA 50 V2, Montanidе ISA 70M VG. Активность сывороток, полученных от животных при использовании адъюванта Montanidе ISA 61 VG, была идентичной с активностью сывороток, полученных при применении адъювантов сапонина и Montanidе ISA 70, и составила 1:9000. При этом полученные от морских свинок гипериммунные сыворотки были типоспецифичными в ИФА. В непрямом двойном сэндвич варианте ИФА сыворотки крови морских свинок с гетерологичными антигенами ВЯ имели активность в разведении 1:100. В РМН установлено наличие вируснейтрализующих антител в пробах сывороток лабораторных животных с использованием всех испытуемых адъювантов в пределах 1:1536 – 1:2048.
В таблице 74 приведены результаты получения сыворотки крови морских свинок на штамм вируса ящура О №1734/Приморский/2000.
Представленные в таблице 74 результаты свидетельствуют о высокой эффективности использования адъювантов Montanidе ISA 50 V2, Montanidе ISA 70M VG, как и в первой серии опытов, при этом титр вирусоспецифических антител составил 1:16000 в ИФА и в РМН 1:256–1:512. Такая же активность была при использовании адъюванта Montanidе ISA 61 VG. Активность сывороток от животных при использовании Montanidе ISA 206 была ниже –1:8000 в ИФА и 1:256 в РМН по сравнению с другими адъювантами.
Полученные гипериммунные сыворотки были специфичными при исследовании в ИФА с гетерологичными антигенами ВЯ типов А, О, Азия-1, САТ- 2.
Гипериммунные сыворотки от морских свинок были использованы в качестве детекторных антител в составе диагностических наборов для выявления антигена ВЯ и при проведении серологического мониторинга.
Средства диагностики ящура, полученные на основе изучаемых изолятов, в 2009-2017 гг. были испытаны при участии Региональной референтной лаборатории МЭБ по ящуру (ФГБУ «ВНИИЗЖ») в международных сличительных испытаниях (квалификационном тестировании), организованных Европейским сообществом референтных лабораторий по ящуру и везикулярной болезни свиней и Всемирной референтной лабораторией ФАО/МЭБ по ящуру (Пербрайтский институт, Великобритания). В 2009 г. в испытаниях участвовали 45 стран, в 2010 г. – 52 страны, в 2011 г. – 56 стран, в 2012 г. – 57 стран, в 2013 г. и 2014 гг. – 54 и 66 стран, в 2015 и 2016 гг. – 63 и 64 страны.
Панель 1 включала шифрованные пробы инфекционного материала от свиней и крупного рогатого скота (КРС) с везикулярными поражениями, для тестирования методом вирусовыделения с последующим типированием проб в ИФА; панель 2 – инактивированные образцы для выявления антигена вируса ящура/ВБС в ИФА; панель 3 – сыворотки крови от вакцинированного/инфицированного КРС и овец для серологической диагностики ящура.
Целью исследования Панели 1 в 2009-2017 гг. было выделение вирусов ящура и ВБС на культурах клеток с последующей идентификацией агента в ИФА.
В 2009 г. после проведения пассажей в чувствительных культурах клеток восьми шифрованных образцов антиген вируса ящура типа О был установлен в непрямом сэндвич-варианте ИФА в двух пробах от КРС, зараженного вирусом ящура О UKG 685/2007. В двух пробах афтозного эпителия и фекалий свиней был обнаружен антиген вируса ВБС. Две пробы эпителия от КРС, а также образцы эпителия и фекалий свиней после проведения пассажей в культурах клеток были отрицательными при исследовании в ИФА.
В 2010 г. из шести поступивших проб два образца афтозного эпителия от свиней вызывали ЦПД при заражении культур клеток. В ИФА в пробах культурального материала были обнаружены антигены вируса ящура типа А и вируса ВБС. Две пробы эпителия и две пробы фекалий свиней не вызывали ЦПД в культурах клеток и были отрицательными в ИФА на наличие антигенов вируса ящура типов А, О, Азия-1, САТ-2 и вируса ВБС.
В 2011 г. при тестировании шести проб патологического материала антиген вируса ящура типа О был установлен в ИФА с использованием набора ФГБУ «ВНИИЗЖ» после пассирования в клеточных культурах пробы эпителия, содержащей вирус ящура O SKR 4/2010 с титром инфекционной активности 106 ТЦД50/мл. Антиген вируса ВБС был установлен в ИФА после проведения пассажей проб эпителия и фекалий, содержащих вирус ВБС ITL/7/07 и ITL/8/07 с титром 105 ТЦД50/мл. Две пробы эпителия и одна проба фекалий от здоровых свиней показали отрицательный результат в ИФА после пассирования в культурах клеток.
При проведении сличительных испытаний 2012 г. антиген вируса ящура типа О был установлен в ИФА с использованием набора ФГБУ «ВНИИЗЖ» после пассирования в клеточных культурах СП, ПСГК-30 и IB-RS-2 образцов эпителия и фекалий свиней панели 1. По данным провайдера сличительных испытаний образцы были получены от свиней, зараженных вирусом ящура типа О/SKR/4/2010. Антиген вируса ВБС был выявлен в ИФА после проведения пассажей пробы эпителиальной ткани свиней, зараженных вирусом ВБС ITL/8/2007. Пробы эпителия и фекалий от здоровых свиней показали отрицательный результат в ИФА после пассирования в культурах клеток.