Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Роль Avibacterium paragallinarum в патологии птиц 11
2.2. Характеристика бактерий вида A. paragallinarum 12
2.2.1. Классификация и таксономия 12
2.2.2. Морфология клеток и колоний 13
2.2.3. Культуральные свойства 13
2.2.4. Биохимические свойства 15
2.2.5. Устойчивость к химическим и физическим воздействиям 16
2.2.6. Антигенная структура 16
2.3. Эпизоотология инфекционного ринита кур 20
2.4. Патогенез инфекционного ринита кур 21
2.5. Клинические признаки 22
2.6. Патологоанатомические изменения 23
2.7. Лабораторная диагностика 24
2.7.1. Бактериологический метод 24
2.7.2. Серологический метод 25
2.7.3. Молекулярно-биологический метод 27
2.7.4 Метод масс-спекторометрии 28
2.8. Лечение 30
2.9. Иммунитет 31
2.10. Профилактика и контроль 32
2.10.1. Ветеринарно-санитарные меры 32
2.10.2 Вакцинопрофилактика 32
2.11. Заключение по обзору литературы 34
3. Собственные исследования 37
3.1. Материалы 37
3.1.1. Штаммы и изоляты микроорганизмов 37
3.1.2. Питательные среды и компоненты питательных сред 37
3.1.3. Животные 38
3.1.4. Краски для микроскопических исследований 38
3.1.5. Растворы и реактивы 38
3.1.6. Оборудование 39
3.2. Методы 40
3.2.1. Отбор патологического материала для бактериологического исследования на инфекционный ринит кур 40
3.2.2. Выделение чистой культуры A.paragallinarum 41
3.2.3. Определение культурально-морфологических свойств 41
3.2.4. Определение биохимических свойств 42
3.2.5. Определение антибиорезистентности A. paragallinarum 42
3.2.6. Определение патогенности возбудителя 43
3.2.7. Получение антигенов для серологических реакций и иммунизации животных 44
3.2.8. Получение специфических сывороток крови кроликов 44
3.2.9. Постановка реакции агглютинации 45
3.2.10. Постановка реакции торможения гемагглютинации микрометодом 45
3.2.11. Определение антигенного родства штамма и изолятов A.paragallinarum 46
3.2.12. Типирование изолятов A. paragallinarum методом ПЦР 46
3.2.13. Идентификация A. paragallinarum на масс-спектрометре MALDI 47
3.2.14. Определение концентрации микробных клеток 48
3.2.15. Статистическая обработка результатов 48
3.3. Результаты собственных исследований 48
3.3.1. Выделение и идентификация возбудителя инфекционного ринита кур 48
3.3.2. Чувствительность изолятов A. paragallinarum к антибактериальным препаратам 57
3.3.3. Патогеные свойства возбудителя инфекционного ринита кур 59
3.3.4. Влияние некоторых физических и химических факторов на гемагглютинирующие свойства антигенов A. paragallinarum 63
3.3.5. Антигенные свойства штамма и изолятов возбудителя инфекционного ринита кур 67
3.3.6. Иммуногенные свойства изолятов A. paragallinarum 70
3.3.7. Получение и сравнительный анализ MALDIOF масс-спекторов возбудителя инфекционного ринита кур 72
3.3.8. Определение способов и сроков хранения штамма A. paragallinarum 77
3.4. Обсуждение результатов собственных исследований 82
4. Заключение 93
4.1. Выводы 96
5. Принятые сокращения 98
6. Список литературы 100
7. Приложения 118
- Антигенная структура
- Выделение и идентификация возбудителя инфекционного ринита кур
- Влияние некоторых физических и химических факторов на гемагглютинирующие свойства антигенов A. paragallinarum
- Обсуждение результатов собственных исследований
Антигенная структура
Антигенные свойства возбудителя впервые изучил в реакции агглютинации Л. Пэйдж, который установил три серотипа – А, В и С. По результатам типирования большого количества изолятов было установлено, что в Германии преимущественно циркулируют серотипы А и В, в Испании - А, В и С, в Австралии, Южной Африке и Индонезии - А и С [38, 74, 118, 119, 120, 148, 154, 161, 173].
К. Хинц дифференцировал выделенные им культуры на два серотипа – А и В. В перекрестной реакции агглютинации с адсорбированными сыворотками автор выявил в поверхностных структурах бактериальной клетки термолабильный типоспецифический и термостабильный видоспецифический антигены. K. Като описал три серотипа возбудителя (1, 2 и 3), причем первый серотип соответствовал типу А по классификации Л. Пэйджа [76, 90, 96, 161].
Более детально была изучена антигенная структура серотипов, классифицированных по схеме А. Савата. Автор разделил все капсульные штаммы возбудителя на два серотипа (1 и 2) по гемагглютинирующей активности. Первоначально способность агглютинировать эритроциты кур была установлена у инкапсулированных клеток серотипа 1; позднее, используя специальные методы обработки бактерий, были обнаружены гемагглютинирующие свойства и у культур серотипа 2. Гемагглютинины, по данным электронной микроскопии, локализуются на мембране клеточной стенки, они гетерогенны по серологическим и физико-химическим свойствам. Различают следующие типы гемагглютининов: тип HS – термостабильный, трипсинрезистентный; тип HL – термолабильный, трипсинрезистентный; тип L – термолабильный, трипсинчувствительный, устойчивый к действию гиалуронидазы, активный в отношении свежих и обработанных глутаровым альдегидом эритроцитов. Гемагглютинины типов HS и HL активны в отношении только свежих куриных эритроцитов, но не обработанных глутаровым альдегидом. Гемагглютинины типа L индуцируют в организме синтез защитных антител, т.е. обладают иммуногенными (протективными) свойствами [103,142, 160].
Антигенная структура возбудителя тесно связана с типом образуемых на агаре колоний: бактерии из флюоресцирующих колоний содержат типоспецифический антиген типа L, гемагглютинин и обладают протективным свойствами, а нефлюоресцирующие колонии состоят из клеток, не имеющих перечисленных свойств.
Серологическая активность возбудителя зависит от наличия в капсуле гиалуроновой кислоты. Обнаружено, что антигены штаммов первого серотипа инагглютинабельны в гомологичной антисыворотке, а также неспособны агглютинировать эритроциты. Серологическая инертность исчезает после обработки культур гиалуронидазой. Штаммы, имеющие в составе капсулы гиалуроновую кислоту, обладают высокой вирулентностью.
Для серотипирования возбудителя в соответствии со схемой, предложенной Л. Пэйджем, также используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). По результатам проведения этой реакции, штаммы, выделенные в Китае, относились к серотипам А, а в Аргентине и Бразилии – к серотипам А, В, С [39, 46, 49, 50].
Другой метод серотипирования штаммов A. paragallinarum, основан на использовании моноклональных антител в ИФА. Большим недостатком данного метода является невозможность идентификации штаммов серотипа В и некоторых штаммов серотипа А, выделенных в Южной Америке [30, 49, 50, 61, 149].
Долгое время существовало предположение, что серотип В по классификации Л. Пэйджа не является истинным серотипом, а представляет собой промежуточное звено между серотипами А и С, которые потеряли типоспецифический антиген. Последние исследования, окончательно показали, что серотип В является самостоятельным и не имеет ничего общего с серотипами А и С [34, 103, 121, 142].
Практическая значимость схемы серотипирования Л. Пэйджа состоит в том, что в ней прослеживается корреляция между серотипами и спецификой иммунотипов. Цыплята, привитые вакциной, приготовленной из одного серотипа, оказались защищенными только против гомологичного серотипа. Однако, последние исследования показали, что перекрестный иммунитет в пределах серотипа В по классификации Л. Пэйджа является лишь частичным [21, 32, 82, 105, 148].
Кумэ и соавторы предложили альтернативную серологическую классификацию, основанную на РТГА с использованием обработанных тиоционатом калия и в дальнейшем обработанных ультразвуком клеток, гипериммунных сывороток кролика и эритроцитов цыпленка, фиксированных глютаровым альдегидом. В сущности, серотипы А, С и В по классификации Л. Пэйджа были подняты на уровень серологических групп, I, II и III и семи серотипов (от НА-1 до НА-7) внутри этих трех серологических групп: по три штамма из I и II группы и один из III. Интересно, что области распространения этих серотипов уникальны по отношению к географическому происхождению штаммов. Большинство изолятов возбудителя, которые не удалось типировать по схеме Л. Пэйджа в РА, легко типировались по схеме Кумэ в РТГА. Восьмой и девятый серотипы были выделены в Австралии. Терминология, на которой базируется схема Кумэ, недавно была изменена с учетом дополнительных серотипов. Для предотвращения путаницы серологические группы I, II и III были переименованы в А, С и В. Этим подчеркивается, что серологические группы Kume А, В и С соответствуют серотипам Л. Пэйджа А, В и С. В пределах каждой из серологических групп серотипы были последовательно пронумерованы, что позволило учитывать новые серотипы. Таким образом, в настоящее время признано девять серотипов по классификации Кумэ – А-1, А-2, А-3, А-4, В-1, С-1, С-2, С-3 и С-4. Однако, данная схема на практике широко не применяется, из-за технических сложностей воспроизведения [8, 21, 36, 57, 67, 142, 148, 150, 161].
Так как серологические группы Кумэ соответствуют серотипам Л. Пэйдж, разумно предположить, что перекрестного иммунитета между серологическими группами, предложенными Кумэ, нет. Однако, имеются отдельные сообщения о том, что между отдельными серотипами внутри серогруппы А, а также между серотипами С-1 и С-2; С-2 и С-4 имеется перекрестная защита [25, 32, 57, 67].
Не так давно появилась еще одна схема серотипирования, основанная на выявлении термостабильных антигенов в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП). У шести серотипов, выявленных по этой схеме, не удалось обнаружить корреляцию с основными иммунотипами возбудителя, поэтому схема не нашла широкого применения [78].
Существует также сывороточный бактерицидный тест, с помощью которого возможно проведение дифференциации серологических серогрупп А и С по схеме Кумэ [147].
Выделение и идентификация возбудителя инфекционного ринита кур
Используемые в работе изоляты A. paragallinarum были выделены в период с 2014 по 2018 гг. из патологического материала от птиц в возрасте от 38 до 211 суток, из хозяйств Владимирской, Московской, Костромской, Ярославской, Оренбургской и Ульяновской областей, а также Республики Мордовия и Республики Татарстан. Кроме того, один изолят был выделен от птиц из Республики Беларусь (Таблица 1).
Всего для исследований поступило 128 проб патологического материала от птиц. Большинство изолятов возбудителя были выделены от кур яичного направления продуктивности. Основным местом локализации возбудителя явились подглазничные синусы. Клинические признаки заболевания у кур обычно проявлялись в виде водянистого истечения из носовых отверстий. Иногда у птиц наблюдали опухшие подглазничные синусы и конъюнктивальные мешки (Рис.1).
У некоторых кур, вследствие закупорки носовых ходов, отмечали ротовое дыхание с хрипами. Патологоанатомические изменения были преимущественно сосредоточены в верхних отделах респираторного тракта. Подкожная клетчатка в области головы была отечная, студневидной консистенции. В подглазничных синусах и конъюнктивальных мешках часто обнаруживали серозный или серозно-гнойный экссудат (Рис.2).
В гортани и верхней половине трахеи иногда находили значительное количество слизи с выраженной гиперемией слизистой оболочки. Реже отмечали пневмонию и аэросаккулиты.
Для исследований были отобраны следующие пробы: экссудат из носовой полости, содержимое подглазничных синусов и конъюнктивального мешка, легкие. В большинстве случаев выделение A. paragallinarum было затруднено из-за наличия в пробах значительного количества других видов микроорганизмов, таких как, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, E. coli, Proteus spp и апатогенные виды гемофильных бактерий – Avibacterium endocarditis и Avibacterium volantum. Из 128 проб получили 4 изолята A. endocarditis и 3 изолята A. volantum.
На кровяном агаре с «бактерией-кормилкой» все изоляты вырастали через 24 часа культивирования в виде мелких (0,1-0,5 мм) сателлитных колоний в зоне 0,5-1,5 см от штриха культуры S. epidermidis (Рис. 3). Размер колоний по мере удаления от питающей культуры бактерий уменьшался вплоть до полного исчезновения роста. Сателлитные колонии имели серо-белый цвет, округлую форму, ровные края и гладкую выпуклую поверхность без зоны гемолиза.
Некоторые исследователи указывают на то, что рост изолятов A. paragallinarum, выделенных из патологического материала от птиц, часто сопровождается образованием различных типов колоний. Наряду с округлыми и гладкими колониями (S-форма), возбудитель может образовывать на поверхности агаровой среды шероховатые колонии с неровными краями (SR и R-формы).
В наших исследованиях все изоляты через 24 часа инкубирования на шоколадном и на сывороточном агаре с добавлением НАДФ формировали круглые с ровными краями, выпуклые с гладкой поверхностью, серого цвета колонии диаметром 0,5-1,0 мм (S-форма) (Рис. 4). Через 48 часов культивирования размеры колоний увеличивались до 1,0-1,5 мм. Характерным признаком 24-часовых культур являлась флуоресценция колоний в косопроходящем свете. У 48-часовых культур интенсивность флуоресценции снижалась, а у старых (72 часа) культур полностью исчезала.
Флуоресцирующие колонии при изучении в пучке косопроходящего света в стереоскопическом микроскопе имели ярко-желтый цвет с зеленым отливом. Нефлуоресцирующие колонии имели тусклую зеленоватую окраску.
На различных питательных средах возбудитель проявлял широкий диапазон морфологической изменчивости. Стабильную и типичную морфологию бактериальных клеток наблюдали в виде коротких палочек и коккобактерий при культивировании на шоколадном агаре и сывороточном агаре с добавлением НАДФ (Рис.5).
Значительные морфологические вариации клеток отмечали при выращивании изолятов на кровяном агаре с «бактерией-кормилкой», особенно в колониях, формирующихся в непосредственной близости от питающей бактериальной культуры. В этом случае возбудитель приобретал форму длинных изогнутых палочек и нитей, что возможно объясняется воздействием продуктов метаболизма питающей бактериальной культуры. Аналогичные формы бактериальных клеток иногда обнаруживали при смене питательной среды. Однако, через 2-3 пассажа на новой питательной среде наблюдали восстановление морфологии бактерий.
Капсулу у изолятов A. paragallinarum сравнительно легко обнаруживали при окраске по методу Гинса (Рис.6). Наиболее крупные капсулы наблюдали у 24-часовых культур, выращенных на шоколадном агаре или сывороточном агаре с добавлением НАДФ. Необходимо отметить, что степень выраженности капсульной субстанции у бактериальных клеток в наших исследованиях была прямо пропорциональна интенсивности флуоресценции колоний. Рисунок 6 – Капсула у 24-часовых культур A. paragallinarum, выращенных на шоколадном агаре (окраска по Гинсу), (увеличение х1000)
С целью окончательной идентификации изолятов A. paragallinarum дополнительно проводили определение ряда культуральных и биохимических свойств в сравнении с референтным штаммом №29545. При этом учитывали способность культур расти на питательных средах без сыворотки крови, при повышенном содержании углекислого газа в атмосфере, продуцировать различные метаболиты и ферменты, расщеплять углеводы (Табл. 2).
Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что референтный штамм и изоляты возбудителя инфекционного ринита кур по культуральным свойствам и ферментативной активности представляют собой неоднородную группу. В наших исследованиях все изоляты и штамм A. paragallinarum были НАД-зависимыми, хотя в специальной литературе имеются сообщения о выделении и НАД-независимых изолятов возбудителя. Характерными свойствами бактерий являлась способность редуцирования нитратов в нитриты, отсутствие продукции индола, сероводорода, уреазы, каталазы, оксидазы, -фруктозидазы и -галактозидазы. Зависимость роста штамма и изолятов от наличия в питательной среде сыворотки крови была абсолютной. Получить рост A. paragallinarum на среде без сыворотки не удалось, даже если она содержала оптимальное количество V-фактора. Ряд зарубежных исследователей утверждают, что рост возбудителя инфекционного ринита кур возможен только при наличии повышенного содержания углекислого газа в атмосфере. Однако, в наших исследованиях только 9 изолятов проявили такую зависимость. Морфология и размер колоний у четырех изолятов, выращенных в условиях обычной атмосферы ничем не отличались от таковых выращенных в условиях повышенного содержания углекислого газа. Сахаролитическая активность у A. paragallinarum также оказалась различной. Все изоляты и штамм ферментировали глюкозу и сахарозу, но не лактозу, трегаллозу и галактозу. Вариабельность признака наблюдали в отношении маннита и маннозы.
На основании анализа полученных результатов бактериологического исследования патологического материала на инфекционный ринит кур была предложена схема выделения и идентификации A. paragallinarum (Рис. 7).
Влияние некоторых физических и химических факторов на гемагглютинирующие свойства антигенов A. paragallinarum
Гемагглютинирующую активность атнигенов A. paragallinarum определяли в отношении свежих и обработанных глутаровым альдегидом эритроцитов цыплят. В свою очередь для определения природы и свойств гемагглютининов антигены подвергали обработке гиалуронидазой и трипсином. Характеристика гемагглютинирующей активности A. paragallinarum представлена в таблице 7.
Из результатов, представленных в таблице 7, видно, что исследуемые изоляты и штамм возбудителя инфекционного ринита кур по гемагглютинирующей активности представляют собой неоднородную группу. Все изоляты A. paragallinarum обладали гемагглютинирующей активностью в отношении свежих эритроцитов кур. При использовании эритроцитов, обработанных глутаровым альдегидом титр гемагглютинации, стал выше в 2-4 раза, чем при использовании свежих эритроцитов (р 0,05). Изолят №6 был не активен в отношении ФГАЭ. После обработки антигенов разных изолятов гиалуронидазой их гемагглютинирующая активность не изменилась (р 0,05), что свидетельствует об отсутствии гиалуроновой кислоты в составе капсульной субстанции. После обработки антигенов трипсином гемагглютинирующая активность исчезла, кроме изолята №6. В последующих экспериментах по изучению свойств гемагглютининов A. paragallinarum использовали эритроциты кур, обработанные глутаровым альдегидом.
Нативный антиген референтного штамма №29545 серогруппы А обладал слабой гемагглютинирующей активностью в отношении как свежих, так и обработанных глутаровым альдегидом эритроцитов. После обработки антигена гиалуронидазой титр гемагглютинирующей активности стал выше в 64 раза (р 0,05). Наличие гиалуроновой кислоты в составе капсулы является характерным свойством возбудителя инфекционного ринита кур, принадлежащим к серологической группе А.
Кроме действия химических факторов на гемагглютинирующие свойства антигенов проводили изучение действия физических факторов, таких как повышенная температура. Результаты изучения действия различных температур на гемагглютинирующую активность антигенов представлены в таблице 8.
При изучении гемагглютинирующей активности антигенов выявлено, что активность антигенов всех изолятов и штамма, кроме изолята №6 при воздействии температуры 60оС значительно снижалась, а при 65оС полностью исчезала. Полученные данные позволяют предположить, что гемагглютинины этих изолятов и штамма имеют белковую природу. Антиген изолята №6 сохранял активность, даже при 80С. Возможно данный гемагглютинин имеет не белковую природу.
Из результатов, представленных в таблице 9, видно, что гемагглютинирующая активность антигенов при добавлении в раствор 10 мМоль хлористого кальция была в 2 и более раз выше, чем без добавления (p 0,05). При внесении в раствор хелатирующего аганта – ЕDТА в концентрации 50 мМоль наблюдали полное исчезновение гемагглютинирующей активности антигенов A. paragallinarum.
Обсуждение результатов собственных исследований
Инфекционный ринит кур, вызываемый бактериями A. paragallinarum, является одной из актуальных проблем ветеринарии. Возбудитель болезни относится к семейству Pasteurellaceae, которое объединяет группу грамотрицательных хемоорганотрофных, факультативно-анаэробных бактерий [21, 33, 98, 117, 118, 134, 151, 161, 170, 174].
В настоящее время опубликовано большое количество работ посвященных этой проблеме. При этом особый интерес представляют работы, касающиеся лабораторной диагностики, разработки и совершенствования иммунобиологических препаратов, используемых для специфической профилактики инфекционного ринита кур.
Анализ эпизоотической ситуации по инфекционному риниту кур в мире за последние десятилетия показывает, что существует тенденция к распространению заболевания. В настоящее время неблагополучными по данной болезни являются: Австралия, Аргентиня, Африка, Бангладеш, Бразилия, Индия, Индонезия, Китай, Малайзия, Мексика, США, Таиланд, Уэльс, Япония [27, 38, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 65, 68, 84, 85, 86, 93, 94, 114, 137, 158, 159, 161, 162, 164, 173].
Первым этапом нашей работы было исследование патологического материала от птиц, поступавшего из хозяйств различных регионов Российской Федерации, с целью выделения возбудителя инфекционного ринита кур.
За период с 2014 по 2018 гг. было исследовано 128 проб патологического материала от птиц в возрасте от 38 до 211 суток, из хозяйств Владимирской, Московской, Костромской, Ярославской, Оренбургской и Ульяновской областей, а также Республики Мордовия и Республики Татарстан. Кроме того, один изолят был выделен от птиц из Республики Беларусь. Всего было выделено 13 изолятов A. paragallinarum.
Для выделения возбудителя инфекционного ринита кур использовали экссудат из носовой полости, содержимое подглазничных синусов и конъюнктивального мешка и легкие от больных птиц. В большинстве случаев выделение A. paragallinarum было затруднено из-за наличия в пробах значительного количества других видов микроорганизмов, таких как, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, E. coli, Proteus spp о чем свидетельствуют и результаты исследований других авторов. Кроме А. paragallinarum у птиц в верхних дыхательных путях могут перситировать и апатогенные виды гемофильных бактерий: А. avium, A. endocarditis и A. volantum [9, 57, 109]. При исследовании проб патологического материала от птиц были выделены 4 изолята A. endocarditis и 3 изолята A. volantum.
По данным литературы возбудитель на различных питательных средах может проявлять широкий диапазон морфологической изменчивости [2, 11, 21, 33, 70, 73, 142, 151, 161].
В наших исследованиях стабильную и типичную морфологию бактериальных клеток наблюдалась в виде коротких палочек и коккобактерий при культивировании на шоколадном агаре и сывороточном агаре с добавлением НАДФ. Кроме того, было отмечено, что возбудитель на всех испытанных нами питательных средах дегенерировал через 72-96 часов, превращаясь в длинные нити и плохо очерченные формы. В тоже время пересев на новые среды аналогичного состава снова сопровождался появлением типичной морфологии бактерий, в виде коротких палочек.
В наших исследованиях все изоляты A. paragallinarum были НАД-зависимыми, хотя в специальной литературе имеются сообщения о выделении и НАД-независимых изолятов возбудителя [31, 44, 67, 73, 79, 117, 156].
В ряде источников литературы имеются сообщения о зависимости роста A. paragallinarum от наличия в атмосфере повышенной концентрации углекислого газа. По сообщениям других авторов углекислый газ не является существенно необходимым компонентом для кульвирования возбудителя, так как микроорганизм способен расти в атмосфере пониженного содержания кислорода или в анаэробных условиях. В наших исследованиях 6 изолятов проявили зависимость роста от наличия в атмосфере повышенной концентрации углекислого газа. Морфология и размер колоний у остальных изолятов, выращенных в условиях обычной атмосферы ничем не отличался от таковых при повышенном содержании углекислого газа [3, 69, 118, 139, 148, 156, 161].
Способность редуцировать нитраты в нитриты и ферментировать глюкозу без выделения газа свойственна различным видам гемофильных бактерий от птиц. В литературе описано большое количество противоречивых данных по ферментации углеводов штаммами и изолятами A. paragallinarum, что скорее всего связано с использованием различных питательных сред при тестировании. В данном случае существенной проблемой являются ложноотрицательные результаты идентификации, возможно связанные со слабым ростом культуры. В наших исследованиях все изоляты ферментировали глюкозу и сахарозу, но не лактозу, трегаллозу и галактозу. Вариабельность признака наблюдали в отношении только в отношении маннита и маннозы [2, 12, 21, 24, 33, 35, 40, 161].
Характерными свойствами изолятов A. paragallinarum являлась способность редуцирования нитратов в нитриты, отсутствие продукции индола, сероводорода, уреазы, каталазы, оксидазы, -фруктозидазы и -галактозидазы. В наших исследованиях зависимость роста изолятов от наличия в питательной среде сыворотки крови была абсолютной. Получить рост A. paragallinarum на среде без сыворотки не удалось, даже если она содержала оптимальное количество V-фактора.
На основании результатов бактериологического исследования патологического материала на инфекционный ринит кур была предложена схема выделения и идентификации A. paragallinarum.
Согласно данным литературы актуальной проблемой при работе с бактериями A. paragallinarum является диссоциация, которая происходит в результате многократных пассажей in vitro. Явление диссоциации характеризуется формированием на плотных питательных средах гладких (S) и шероховатых (R) колоний, а также переходных между ними форм. По данным ряда литературных источников от степени диссоциации A. paragallinarum зависят не только культурально-морфологические признаки, биохимические и вирулентные свойства, но и иммуногенные свойства возбудителя [75, 134, 141]. В наших исследованиях для предотвращения явления диссоциации, штамм и изоляты A. paragallinarum культивировали на сложных питательных средах, проводя не более 5-6 пассажей. Для хранения использовали культуры A. paragallinarum прошедшие пассаж через кур, которые подвергали замораживанию в питательной среде с криопротектором.
Несмотря на большой арсенал антибактериальных препаратов, разработанных и внедренных в ветеринарную практику, лечение бактериальных заболеваний птиц продолжает оставаться одной из актуальных проблем ветеринарии. Одной из причин недостаточной эффективности антибактериальной терапии является то, что широкое использование антибиотиков способствует росту резистентности возбудителя к традиционным препаратам, используемым в ветеринарии.
При исследовании чувствительности изолятов A. paragallinarum к антибактериальным препаратам большинство были чувствительными к полусинтетическим пенициллинам, цефалоспоринам III-IV поколения, азитромицину и флорфениколу. Резистентность к пенициллину была выявлена у 5 изолятов, а к гентамицину у 9 изолятов.
В литературе имеются сообщения о высоком уровне резистентности ( 75%) изолятов A. paragallinarum к неомицину, хлортетрациклину, стрептомицину и эритромицину. По данным зарубежных исследователей растущий уровень устойчивости возбудителя к эритромицину и производным тетрациклина обусловлен наличием плазмиды с множественной лекарственной резистентностью [66, 95, 115].
Сульфаниламиды обладают бактериостатическим эффектом. Являясь по химической структуре аналогами парааминобензойной кислоты, они конкурентно ингибируют бактериальный фермент, ответственный за синтез дигидрофолиевой кислоты - предшественника фолиевой кислоты, которая является важнейшим фактором жизнедеятельности микроорганизмов. В наших исследованиях к сульфаниламидным препаратам резистентность была выявлена у 9 изолятов. О частом выделении изолятов A. paragallinarum, резистентных к сульфаниламидным препаратам, сообщают и другие исследователи [66, 95, 115, 128, 155].
Высокий уровень резистентности изолятов A. paragallinarum к эритромицину, антибиотикам тетрациклиновой группы и сульфаниламидным препаратам ограничивает возможности их применения для эффективного лечения заболевания.
Одним из «последних» антибиотиков, введенных в ветеринарную практику, является флорфеникол. На российском ветеринарном рынке он появился как заменитель широко распространённого левомицетина, который запрещён к применению в ряде стран Европы и в США. Механизм антимикробного действия флорфеникола связан с нарушением синтеза белков микроорганизмов. Препарат является производным тиамфеникола, в молекуле которого гидроксильная группа заменена атомом фтора. Обладает бактериостатическим действием, связываясь с рибосомальной субъединицей 50S в протоплазме бактериальной клетки, блокирует фермент пептидилтрансферазу, что приводит к торможению синтеза белка у чувствительных микроорганизмов на уровне рибосом. Лекарственная устойчивость к препарату развивается относительно медленно, при этом, как правило, перекрёстной устойчивости к другим химиотерапевтическим средствам не возникает. В наших исследованиях все изоляты A. paragallinarum показали высокую чувствительность к флорфениколу.