Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 16
1.1 Антимикробные пептиды – многофункциональные молекулярные факторы врождённого иммунитета животных 16
1.2 Общая характеристика и биологическая активность антимикробных пептидов из тромбоцитов и кровяных пластинок 25
1.3 Общая характеристика бактерий рода Enterococcus 31
1.4 Бактериоцины энтерококков: разнообразие, свойства и практическое применение 41
II Собственные исследования 48
2.1 Материалы и методы исследований 48
2.1.1 Получение кислотных экстрактов из тромбоцитов и кровяных пластинок животных и изучение их функциональной активности 48
2.1.2 Методы изучения биологических эффектов очищенных антимикробных пептидов из тромбоцитов
2.1.2.1 Масс-спектрометрический анализ антибактериальных фракций кислотного экстракта тромбоцитов 54
2.1.2.2 Оценка антибактериальной активности антимикробных пептидов из тромбоцитов 54
2.1.2.3 Флуоресцентная микроскопия и спектроскопия в оценке биологического действия антимикробных пептидов 55
2.1.2.4 Биолюминесцентное тестирование 56
2.1.2.5 Определение дзета-потенциала бактериальных клеток при воздействии антимикробных пептидов 57
2.1.2.6 Измерение концентрации внеклеточных ионов калия при воздействии антимикробных пептидов 57
2.1.2.7 Метод изучения морфофункциональной реакции микроорганизмов на воздействие антимикробных пептидов 58
2.1.3 Выделение и идентификация бактерий рода Enterococcus 59
2.1.4 Методы изучения биологических свойств микроорганизмов
2.1.4.1 Определение факторов патогенности микроорганизмов 64
2.1.4.2 Определение факторов персистенции микроорганизмов 66
2.1.4.3 Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов 71
2.1.4.4 Определение антагонистической активности микроорганизмов 71
2.1.4.5 Определение генетических детерминант вирулентности, персистенции, антибиотикорезистентности и бактериоциногении энтерококков 72
2.1.5 Метод воспроизведения экспериментальной листериозной инфекции 77
2.1.6 Методы статистической обработки результатов 80
2.2 Функциональные свойства АМП из тромбоцитов и кровяных пластинок животных 81
2.2.1 Спектр антимикробной активности кислотных экстрактов из тромбоцитов и кровяных пластинок животных 81
2.2.2 Влияние кислоторастворимых белков тромбоцитов и кровяных пластинок на персистентные свойства микроорганизмов 87
2.2.3 Оценка воздействия кислотных экстрактов из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных на факторы вирулентности микроорганизмов 112
2.2.4 Характеристика антибиотикочувствительности микроорганизмов после соинкубирования с кислоторастворимыми белками тромбоцитов и кровяных пластинок 120
2.2.5 Влияние кислотных экстрактов тромбоцитов и кровяных пласти нок животных на чувствительность условно-патогенных микроорга низмов к антагонистически активным представителям нормальной микрофлоры 128
2.3 Разработка способа получения антимикробных пептидов из тромбоцитов курицы домашней (Gallus gallus) 137
2.4 Изучение биологических эффектов очищенных АМП из тромбоцитов курицы домашней и их механизмов в отношении микроорганизмов 144
2.4.1 Исследование механизма антибактериального действия фракций, выделенных из тромбоцитов G. gallus 144
2.4.1.1 Антимикробная активность пептидных фракций из тромбоцитов G. gallus 144
2.4.1.2 Флуоресцентная микроскопия и спектроскопия в оценке биологического действия антимикробных пептидов из тромбоцитов G. gallus 146
2.4.1.3 Биолюминесцентное тестирование 149
2.4.1.4 Изменение дзета-потенциала бактериальных клеток при воздействии антимикробных фракций из тромбоцитов курицы домашней 150
2.4.1.5 Морфофункциональная реакция микроорганизмов на воздействие антимикробных соединений из тромбоцитов курицы до машней 153
2.4.1.6 Изменение концентрации внеклеточных ионов калия при воздействии АМП 158
2.4.2 Исследование действия выделенных из тромбоцитов G. gallus пептидных фракций на биологические свойства микроорганизмов 160
2.4.2.1 Оценка воздействия АМП из тромбоцитов курицы домашней на персистентный потенциал микроорганизмов 160
2.4.2.2 Влияние АМП из тромбоцитов курицы домашней на факторы вирулентности микроорганизмов 163 2.4.2.3 Характеристика антибиотикочувствительности микроорганизмов после соинкубирования с АМП из тромбоцитов G. gallus 167
2.4.2.4 Влияние АМП тромбоцитов курицы домашней на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным представителям нормальной микрофло ры 170
2.5 Биологические свойства энтерококков, выделенных от животных 175
2.5.1 Характеристика видового состава и факторов персистенции энтерококков, выделенных из клинического материала и фекалий продуктивных животных 175
2.5.2 Характеристика факторов патогенности энтерококков 183
2.5.3 Характеристика антибиотикорезистентности фекальных и клини ческих изолятов энтерококков 186
2.5.4 Разработка математической модели дифференциальной диагно стики клинически значимых штаммов энтерококков и представителей нормальной микрофлоры животных 193
2.5.5 Антагонистическая активность энтерококков in vitro и in vivo 200
III Обсуждение результатов исследований 209
Выводы 222
Рекомендации по использованию научных выводов... 224
Список сокращений 226
Библиографический список
- Общая характеристика бактерий рода Enterococcus
- Методы изучения биологических эффектов очищенных антимикробных пептидов из тромбоцитов
- Методы изучения биологических свойств микроорганизмов
- Оценка воздействия АМП из тромбоцитов курицы домашней на персистентный потенциал микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности. В связи со значительными темпами роста устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам (Meunier O., 2015) активно обсуждается вопрос о создании альтернативных терапевтических средств, резистентность к которым у микроорганизмов будет развиваться ограниченно или полностью отсутствовать (Ashby M. et al., 2014). Такими средствами могут явиться антимикробные пептиды (АМП), синтезируемые организмами различного уровня организации и являющиеся одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета, которая обеспечивает первую линию защиты от инфекций человека и животных и без которой невозможно выживание в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами (Кокряков В.Н. и др., 2006). Эти соединения составляют важный молекулярный механизм врождённого иммунитета животных (Jenssen H. et al., 2006) и в перспективе могут рассматриваться в качестве дополнения и замены в медицинской и ветеринарной практике общепринятых антибиотиков микробного происхождения в силу ряда преимуществ: способности быстро убивать клетки-мишени, необычайно широкого спектра действия, активности в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также определённой трудности в селекции устойчивых мутантов in vitro (Hancock R.E.W., Lehrer R., 1998).
Выделение и структурно-функциональное изучение пептидных антибиотиков животного происхождения создаёт предпосылки для разработки и производства химически или биотехнологически синтезированных гомологов этих соединений (Кокряков В.Н., 2006).
Известно, что клетки крови, в частности, кровяные пластинки, являются источником различных катионных пептидов, обладающих выраженной биологической активностью (Ivanov Y.B. et al., 2015). Однако имеющиеся данные о соединениях этой группы в основном ограничиваются сведениями об АМП кровяных пластинок человека. В то же время остаётся открытым вопрос о структуре и функциональной активности пептидных антибиотиков из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных; не изучен механизм их антимикробного действия.
В поисках решения задачи по изысканию альтернативных традиционным антибиотикам средств, способных обеспечить борьбу с инфекционными агентами, возрос интерес и к антимикробным субстанциям бактериального происхождения. Среди них особое место занимают бактериоцины – экскретируемые за пределы бактериальной клетки антимикробные пептиды, чаще всего катионной природы (Popaganni M., 2003; Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., 2011; Himeno K. et al., 2015). Интерес учёных к микроорганизмам-продуцентам бактериоцинов определяется свойствами данной группы соединений: широким спектром антимикробного действия (Svetoch E. et al., 2008); активностью в отношении бактериальных патогенов в наномолярных концентрациях (Sang Y., Blecha F., 2008); медленным развитием у микроорганизмов резистентности к бактериоцинам
(Lawton E.M. et al., 2007); индукцией иммунных реакций макроорганизма, повышающих его неспецифическую резистентность к инфекционным агентам (Duc le H. et al., 2004).
Учитывая вышеизложенное, поиск микроорганизмов-продуцентов бакте-риоцинов и изучение их биологических свойств представляется актуальным. Наиболее исследованной на сегодняшний день группой продуцентов бактерио-цинов являются молочнокислые микроорганизмы, к числу которых относятся бактерии рода Lactobacillus и явившиеся предметом настоящего исследования бактерии рода Enterococcus. Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении микроорганизмов этого рода (Nigtov K. et al., 2005; Dale J.L. et al., 2015), многое до сих пор остается неясным: в литературе нет данных комплексной оценки биологических свойств антагонистически активных энтерококков – продуцентов бактериоцинов по факторам вирулентности, пер-систенции и антибиотикорезистентности, что затрудняет дифференциацию штаммов – представителей нормофлоры от патогенных вариантов микроорганизмов, использование которых в составе антимикробных биопрепаратов невозможно. Недостаточно исследована распространённость генов бактерио-циногении в популяции фекальных энтерококков. Неизвестно, как модифицируется биологическая активность антагонистически активных Enterococcus spp. в условиях макроорганизма.
Всё вышеизложенное актуализирует постановку цели и задач нашей работы.
Целью настоящего исследования явилось изучение биологических эффектов антимикробных веществ животного и бактериального происхождения.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучить антимикробные свойства кислотных экстрактов из тромбоцитов и кровяных пластинок сельскохозяйственных животных и разработать оригинальную схему очистки наиболее активных антимикробных пептидов.
-
Охарактеризовать биологические эффекты гомогенных препаратов антимикробных пептидов и механизмы их биологического действия в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
-
Изучить биологические свойства (антагонистическую активность, факторы патогенности, персистенции и антибиотикорезистентности на уровне фено- и генотипа) энтерококков, выделенных из клинического материала и из фекалий продуктивных животных.
-
На основе комплекса информативных биологических свойств разработать микробиологические критерии дифференциации бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных, на патогенные штаммы и представителей нормальной микрофлоры.
-
Отобрать штаммы энтерококков – представителей нормальной микрофлоры с заданными биологическими свойствами и оценить их антагонистическую активность in vivo для рекомендации в качестве основы биопрепаратов.
Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология
с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки) по: п. 1. «Природа и происхождение, структура, химический состав, морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий, вирусов и токсигенных грибов. Классификация возбудителей и вызываемых ими инфекционных болезней животных»; п. 9. «Активная специфическая профилактика инфекционных болезней животных, вакцины, вакцинология, способы вакцинации. Средства и методы лечения и лекарственной профилактики инфекционных болезней животных»; п. 14. «Иммунология животных, противо-инфекционный иммунитет, иммунопатология и иммунодефициты. Иммунологический анализ в эпизоотологии. Серология, серопрофилактика и серотерапия инфекционных болезней животных».
Научная новизна исследований. Выявлено наличие антимикробных веществ в кровяных пластинках лошади, крупного рогатого скота, свиньи, собаки, козы. Впервые из тромбоцитов кур выделены антимикробные пептиды, характеризующиеся наибольшей микробоцидной активностью.
Показана модификация биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов под действием тромболизатов сельскохозяйственных животных – повышение чувствительности к антибиотикам и антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, а также преимущественное ин-гибирование факторов персистенции и гемолитической активности. Установлено, что выраженность действия определяется видом животного, являющегося источником АМП, при этом наибольшую активность проявляют тромболизаты кур.
Разработан новый способ очистки, позволивший выделить в гомогенном виде бактерицидные субстанции из тромбоцитов курицы домашней (Gallus gallus), и изучены спектр и механизмы их биологической активности.
Впервые установлены минимальные бактерицидные концентрации (МБК) очищенных АМП из тромбоцитов курицы домашней в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
С использованием атомно-силовой микроскопии, флуоресцентной спектроскопии и биолюминесцентного анализа расшифрован механизм действия природных антимикробных пептидов из тромбоцитов G. gallus на микроорганизмы, заключающийся в нарушении структурной организации клеточной стенки и энергетического метаболизма клеток бактерий. Пороподобные повреждения поверхности бактерий позволили отнести АМП к классу пороформирующих катионных антимикробных пептидов.
Выявлена способность энтерококков, выделенных из кишечника и от больных гнойно-воспалительными заболеваниями животных, к инактивации факторов естественной резистентности хозяина и представлена сравнительная оценка диагностической значимости биологических свойств энтерококков. Полученные данные использованы при разработке математических диагностических моделей для дифференциации бактерий рода Enterococcus (свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ № 2015616670, № 2015619808, № 2015619828).
На основании комплексной оценки фенотипических и генетических характеристик энтерококков, выделенных из кишечника здоровых животных, отобран штамм Enterococcus faecium, обладающий генетическими детерминантами бак-териоциногении (entP, entL50A, entL50B), выраженным антагонистическим эффектом в отношении листерий и не имеющий факторов вирулентности (патент РФ № 2571852). Установлена способность данного штамма снижать летальность животных и микробную обсеменённость внутренних органов (селезенка, печень, кишечник и его содержимое) при экспериментальной листериозной инфекции у морских свинок.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые сведения о биологических эффектах антимикробных соединений животного и бактериального происхождения.
Впервые выделены антимикробные пептиды из тромбоцитов курицы домашней. Изученный спектр антимикробной активности и установленный механизм их бактерицидного действия открывают перспективу для дальнейшего изучения этих эндогенных антибиотиков с целью использования в качестве антимикробного средства. Разработанный способ выделения и очистки антимикробных пептидов из тромбоцитов внедрён в научно-исследовательской работе Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Ур О РА Н .
Сравнительное изучение биологических свойств энтерококков, выделенных из кишечника животных и при инфекционно-воспалительных заболеваниях, позволило разработать программы для ЭВМ, дифференцирующие бактерии рода Enterococcus, которые используются в работе ГБУ «Оренбургская областная ветеринарная лаборатория», а также новый способ дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных, основанный на изучении антикарнозиновой активности выделенных штаммов (подана заявка на изобретение № 2015148532).
Материалы работы использованы в информационно-методическом письме Управления ветеринарии министерства сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности Оренбургской области «Региональный регистр антибиотикорезистентности бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных при инфекционно-воспалительных заболеваниях» (Оренбург, 2015).
Создана коллекция антагонистически активных культур энтерококков с изученными биологическими свойствами, перспективных для использования в качестве основы антимикробных биопрепаратов. На основании комплексной характеристики антагонизма in vitro и in vivo, факторов вирулентности и антибио-тикорезистентности из коллекции культур энтерококков отобран новый штамм Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis (патент РФ № 2571852), а также штамм Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida (решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2015103576/10(005608) от 25.11.2015).
Методология и методы исследования. Методологической основой послужили труды отечественных и зарубежных учёных по вопросам поиска новых ан-6
тимикробных соединений. Основу диссертационного исследования составляют системный подход в изучении рассматриваемой проблемы и комплексный анализ. При проведении исследований и изложении материала были применены общенаучные и специальные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, микробиологические, биологические, биохимические, молекулярно-генетические, молекулярной физики и математического анализа. Использование перечисленных методов и статистический анализ экспериментальных данных обеспечили объективность и достоверность полученных результатов и выводов.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Полученные из тромбоцитов и кровяных пластинок животных кислотные экстракты обладают широким спектром микробоцидной активности и способностью модулировать биологические свойства микроорганизмов с наибольшей выраженностью у кислоторастворимых белков из тромбоцитов курицы домашней.
-
Для трёх из восьми пептидных фракций, выделенных из тромбоцитов курицы домашней, характерна высокая антимикробная активность в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, а также способность подавлять/снижать биологические, в том числе персистентные свойства микроорганизмов. Механизм бактерицидного действия тромбоцитарных АМП определяется их способностью нарушать целостность барьерных структур микробных клеток.
-
Способность антимикробных пептидов тромбоцитов снижать персистент-ный потенциал условно-патогенных микроорганизмов и повышать их чувствительность к антагонистическому действию автохтонной микрофлоры определяет колонизационную резистентность кишечного биотопа.
-
Бактериоцин-продуцирующие энтерококки, характеризующиеся определенной совокупностью биологических свойств, повышают устойчивость организма к листериозной инфекции.
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках тем открытого плана НИР ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Функциональные свойства антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных» (№ государственной регистрации 0120.1252048); «Биологические свойства условно-патогенной и нормальной микрофлоры организма животных в норме и при патологии» (№ государственной регистрации 0120.1450283).
Исследования были проведены при поддержке гранта РФФИ « Новые антимикробные пептиды, продуцируемые тромбоцитами животных, и их биологическая активность в отношении различных групп микроорганизмов» (№ 14 – 04-97067 р_поволжье_а); грантов Оренбургского ГАУ по результатам конкурсов научно-технических и инновационных проектов «Прорыв» (Оренбург, 2011; 2013).
Апробация работы и степень достоверности. Достоверность полученных результатов определяется высоким методическим уровнем исследования, чёт-
ким определением цели и задач исследования; адекватным подбором современных методов исследования, их корректным применением, использованием методов статистической обработки, подтверждающих достоверность полученных выводов, а также апробацией основных результатов работы на научных конференциях.
Результаты научных исследований доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных» (Новочеркасск, 2008); Международной научно-практической дистанционной конференции «Пути научного обеспечения национального проекта по животноводству» (пос. Персиановский, 2008); Всероссийской конференции c международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009); Международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики» (Оренбург, 2012); Международной научно-практической интернет-конференции «Современные тенденции в ветеринарной медицине» (Ставрополь, 2012); II региональном молодежном инновационном конвенте Оренбургской области (Оренбург, 2012); Международной научно-практической конференции «Современные научные тенденции в животноводстве, охотоведении и экологии» (Киров, 2013); Международной научно-практической конференции «Проблемы устойчивости биоресурсов: теория и практика» (Оренбург, 2013); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы животноводства и ветеринарии: состояние и пути решения» (Краснодар, 2013); ежегодной областной молодёжной научно-практической конференции «Молодые ученые Оренбуржья – науке XXI века» (Оренбург, 2013); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии – в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 2014); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в развитии овцеводства и козоводства» (Оренбург, 2014); II Всероссийской молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2014); II Всероссийской школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2015); Международной научно-практической конференции «Проблемы устойчивости биоресурсов и адаптивно-ландшафтного природопользования в различных экологических условиях» (Крым-Ялта, 2015); VIII Российской научной конференции с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов» (Оренбург, 2015).
Материалы диссертации были представлены на III Российском форуме «Российским инновациям – Российский капитал» (Ижевск, 2010); областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2011» (Оренбург, 2011) и отмечены сертификатом победителя; XII ярмарке профессиональных образовательных организаций и организаций высшего образования и науки «Российским инновациям – российский капитал» (Нижний Новгород, 2014) и удостоены медали и диплома. Фрагменты работы были представлены на областных конкурсах научно-исследовательских работ и отмечены персональной стипендией (2013) и премией правительства Оренбургской области для молодых учёных (2015).
Итоги проведённых исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ (протокол № 7 от 26 ноября 2015 года).
Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 47 печатных работах, из них 27 – в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получен 1 патент РФ на изобретение, решение о выдаче патента на изобретение и три свидетельства на регистрацию программ для ЭВМ.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 274 с. компьютерной вёрстки, содержит 13 таблиц и 67 рисунков. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений, списка сокращений, библиографического списка, который включает 417 наименований, в том числе 314 работ иностранных авторов.
Ряд фрагментов работы выполнен совместно с сотрудниками ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Ур О РА Н » (канд. биол. наук Т.М. Пашкова, канд. биол. наук А.С. Васильченко, канд. техн. наук Ю.А. Хлопко), ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет» (канд. биол. наук Е.В. Шейда, канд. биол. наук Л.Ф. Галиуллина, канд. биол. наук В.В. Дымова, Н.Е. Щепитова, Д.В. Пошвина, Ю.И. Пешкова), а также ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РА Н » (канд. хим. наук Е.А. Рогожин).
Общая характеристика бактерий рода Enterococcus
Коэволюция макро- и микроорганизмов привела к возникновению разнообразной группы пептидов и белков, которые составляют важный молекулярный механизм врождённого иммунитета животных (Sаnchez M.L. et al., 2013). Эндогенные антимикробные пептиды, продуцируемые грибами (Mygind P.H. et al., 2005; Oeemig, J.S. et al., 2012), растениями (Odintsova T.I. et al., 2008; Vieira M.E. et al., 2015), позвоночными (Levy O., 2010) и беспозвоночными животными (Х. Заре-Зардини и др., 2015; J. Zhuang et al., 2015) обеспечивают неотложное реагирование организма на инфекцию. Поскольку беспозвоночные организмы лишены приобретенного иммунитета, при контакте с патогенами они могут полагаться только на систему врожденного ответа, и, учитывая «эволюционный успех» беспозвоночных, можно говорить о высокой эффективности сформировавшихся у них систем защиты (Пантелеев П.В. и др., 2014).
В настоящее время описано порядка четырёх тысяч различных АМП (Zhao X. et al., 2013), выделенных из живых существ различного уровня организации, что является убедительным доказательством универсальности и эволюционной древности этих элементов системы врождённого иммунитета.
Сочетание современных методов хроматографии, геномики и протеомики только в 2014 году позволило охарактеризовать 104 новых пептида с известной аминокислотной последовательностью и выраженной антимикробной активностью. Более половины новых АМП (69 пептидов) были выделены от животных. Одним из важных источников природных эндогенных антибиотиков остаются земноводные, из организма которых изолировано около 39% всех антимикробных пептидов, представленных в базе данных APD (Antimicrobial Peptide Database) (Wang G. et al., 2015).
Разнообразие антимикробных пептидов настолько велико, что единственный удобный вариант классификации основан на особенностях вторичной структуры молекулы. В соответствии с этой классификацией все АМП подразделяются на три структурных класса: пептиды, обладающие -спиральной конформацией (LL37, магейнины, цекропины); линейные пептиды, не образующие -спиралей и отличающиеся повышенным содержанием определенных аминокислотных остатков (глицин, пролин, гистидин, триптофан) (индолицидин), и пептиды, в структуре которых наблюдаются антипараллельные -тяжи (-, -, -дефенсины, протегрины, тахиплезины и др.) (Zasloff M., 2002).
Несмотря на значительное многообразие аминокислотных последовательностей и структуры, все антимикробные пептиды имеют сходные черты: как правило, содержат от 12 до 50 аминокислот, обладают основными свойствами за счёт высокого содержания аргинина и лизина. Наличие в молекуле аминокислот с гидрофобными боковыми цепями (около 50%), пространственно разделенными с положительно заряженными группами, характеризует молекулы
АМП как амфипатические (Hancock R.E., 2001). Такие соединения являются активными мембранотропными агентами (Wu M., Hancock R.E., 1999) и способны взаимодействовать не только с фосфолипидами бактериальной мембраны за счёт электростатических свойств, но и внедряться в липидный бислой благодаря гидрофобным взаимодействиям (Selsted M.E. et al., 1993).
Однако АМП объединяют не только вышеописанные сходства, но и способность эффективно уничтожать клетки-мишени.
Установлено, что антимикробные пептиды характеризуются бактерицидной активностью in vitro и in vivo в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: Helicobacter pylori с множественной лекарственной устойчивостью (Narayana J.L. et al., 2015 (а); Narayana J.L. et al., 2015 (б)), Streptococcus pneumoniae (Le C.F. et al., 2015), Staphylococcus epidermidis (Piras A.M. et al., 2015), Klebsiella pneumoniae (Knappe D. et al., 2015), Listeria monocytogenes (Cheng C. et al., 2015), клинических мультирезистентных изолятов Mycobacterium tuberculosis (Ramrez-Carreto S. et al., 2015), Micrococcus luteus, Вacillus thuringiensis (Tonk M. et al., 2015), Enterococcus faecalis, Escherichia coli (Scudiero O. et al., 2015).
Доказана бактерицидная активность АМП в отношении Pseudomonas aeruginosa как in vitro (Snchez-Gmez S. et al., 2015; Mangoni M.L. et al., 2015), так и in vivo в культуре эпителиальных клеток лёгких человека и на модели экспериментальной перитонеальной инфекции (Bucki R. et al., 2015) и сепсиса у мышей (Papareddy P. et al., 2015).
N. Raman et al. (2015) установили, что АМП, представляющие собой структурные миметики природных антимикробных -пептидов, активны в отношении клинических изолятов и лекарственно-устойчивых штаммов C. albicans, а также других оппортунистических культур Candida spp. Причём АМП не только подавляли рост планктонных микроорганизмов, но и предотвращали формирование биоплёнок изолятами С. albicans, С. glabrata, С. parapsilosis и С. tropicalis, что указывает на терапевтический потенциал этого класса соединений в профилактике грибковых инфекций. Аналогичные результаты были получены M. Scarsini et al. (2015) при изучении антимикотической активности кателицидинов в отношении планктонных и биоплёночных культур Candida spp., изолированных от больных с вульвовагинальным кандидозом.
Методы изучения биологических эффектов очищенных антимикробных пептидов из тромбоцитов
Примером таких соединений является бактериоцин AS-48, представляющий собой циклический пептид, состоящий из 70 аминокислотных остатков, с молекулярной массой 7,14 кДа. Энтероцин AS-48 обладает широким спектром антимикробной активности в отношении грамположительных микроорганизмов: Listeria spp., Corynebacterium spp., Mycobacterium spp., Nocardia spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. и Pediococcus spp. Штаммы грамотрицательных микроорганизмов почти в десять раз менее чувствительны к данному бактериоцину, что, вероятно, обусловлено защитным действием наружной мембраны (Grande Burgos M.J. et al., 2014). Другим представителем данного подкласса с широким спектром антимикробной активности является энтероцин NKR-5-3B, продуцируемый культурой E. faecium (Perez R.H. et al., 2015). Циклические бактериоцины благодаря их исключительной стабильности в настоящее время рассматриваются в качестве возможной альтернативы традиционным антибиотикам.
Класс III представлен термолабильными белками с молекулярной массой более 30 кДа (энтеролизин А).
Энтероцины последнего, IV класса, помимо белковой фракции содержат углеводный или липидный компонент.
P.D. Cotter et al. (2005) модифицировали классификацию энтероцинов, предложив разделить их на 2 группы: лантибиотики, которые содержат лантионин (класс I) и бактериоцины, которые не содержат лантионин (класс II). Высокомолекулярные (более 30 кДа) термолабильные энтероцины отнесены к III классу бактериолизинов. Авторы не выделяют IV класс энтероцинов, поскольку до настоящего времени представители этого класса не охарактеризованы должным образом на биохимическом уровне и требуют дополнительного описания.
Для объяснения бактерицидного действия энтероцинов были предложены различные механизмы. Однако, в большинстве случаев бактерицидный эффект этих соединений обусловлен образованием пор в мембране клетки, что сопровождается выходом ионов калия, аминокислот и других низкомолекулярных веществ. Как следствие измененяется ионный баланс с последующей быстрой потерей внутриклеточной АТФ (Ennahar S., Descamps N., 2000). Кроме того, некоторые бактериоцины (лантибиотики) могут блокировать синтез клеточной стенки микроорганизмов за счёт связывания с липидом II универсальным рецептором, обеспечивающим транспорт субъединиц пептидогликана из цитоплазмы.
А.С. Васильченко с соавт. (2015) выделили из метаболитов E. faecium пептидные фракции массой 1,0-3,0 кДа, подавляющие рост L. monocytogenes. С помощью флуоресцентной спектроскопии авторам удалось продемонстрировать мембраноповреждающее действие выделенных бактериоцинов. Аналогичные результаты были получены H.F. Goh, K. Philip (2015) при изучении механизма антимикробного действия энтероцина BacC1, продуцируемого штаммом Е. faecium С1, выделенным из перебродившего коровьего молока.
Многообразие бактериоцинов в популяции Enterococcus spp. позволяет микроорганизмам адаптироваться в условиях любого местообитания, в том числе с большим видовым разнообразием и высокой плотностью заселения биотопа, обеспечивая конкурентное преимущество.
Доказательством в пользу широкого распространения антагонистически активных культур в популяции фекальных изолятов энтерококков служит работа V. Strompfov, A. Laukov (2009), в которой показано, что 73% культур Enterococ cus spp., выделенных из кишечника поросят, продуцировали бактериоцины. Согласно результатам исследования, проведённого P. Poeta et al. (2007), из 140 фекальных изолятов энтерококков, выделенных от диких животных, 25 штаммов (17,9%) характеризовались антилистериозной активностью. В геноме антагонистически активных культур были обнаружены генетические детерминанты бактериоциногении в различных комбинациях: entA, entB, entP, entQ, entL50A/B, и cylL. Наиболее распространёнными генами, кодирующими синтез бактериоцинов, были гены энтероцина А и B. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) была изучена распространённость генов, кодирующих синтез известных энтероцинов, в популяции энтерококков, выделенных из продуктов питания и кишечника животных. Оказалось, что наиболее часто встречающимися генетическими детерминантами бактериоциногении являлись гены энтероцинов А, mr10AB и бактериоцина Т8 (Henning C. et al., 2015).
Установлено, что культуры E. faecium, содержащие генетические детерминанты энтероцинов A, B и L50AB, проявляют выраженную антимикробную активность в отношении мультирезистентных изолятов Entero-coccus spp. (Hassan M. et al., 2015).
В связи с перспективой использования соединений данной группы в терапии инфекционной патологии, а также в качестве консервантов для предотвращения порчи пищевых продуктов (Ramu R. et al., 2015), бактериоциногения энтерококков активно изучается (Yildirim Z. et al., 2014; Starke I.C. et al., 2015).
В работе Э.А. Светоч с соавт. (2011) представлены результаты изучения in vitro антимикробной и антигрибковой активности бактериоцина S760, продуцируемого штаммом E.faecium LWP760. Установлено, что энтероцин S760 активно подавляет рост и размножение чувствительных к антибиотикам типовых и клинических культур S. enteritidis, S. typhimurium, C. jejuni, E. coli О157Н:7, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, L. monocytogenes и C. perfringens, основных возбудителей пищевых инфекций человека. Величина МПК энтероцина для указанных патогенов колебалась в пределах 0,05– 1,5 мг/л. Кроме того, высокочувствительными к энтероцину S760 были штаммы S. pyogenes, S. pneumoniae, а также культуры возбудителя дифтерии человека.
Методы изучения биологических свойств микроорганизмов
Для сохранения возбудителя от бактерицидных факторов сыворотки крови или фагоцитов микробная клетка способна продуцировать секретируемые бактериальные субстанции, направленные на деградацию механизмов клеточной и гуморальной защиты и обеспечивающие длительное переживание патогена в макроорганизме. Подавление препаратами персистирующих свойств возбудителя затрудняет его паразитирование в макроорганизме и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий (Бухарин О.В., 1999), поэтому на следующем этапе мы попытались оценить влияние АМП из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных на персистентный потенциал микроорганизмов: антилизоцимную, антилактоферриновую, антикарнозиновую активности и способность к биоплёнкообразованию.
Одним из наиболее значимых персистентных свойств микроорганизмов, позволяющих им длительно существовать в организме хозяина, является антилизоцимная активность (Бухарин О.В., Валышев А.В., 2006). В работах ряда авторов обсуждается возможная этиологическая роль данного свойства бактерий при различных патологиях (Бала С.С., 2010; Фалова О.Е., Потатуркина-Нестерова Н.И., 2012).
Исследование in vitro показало, что при воздействии тромболизатами происходило изменение антилизоцимной активности микроорганизмов. Под влиянием кислоторастворимых белков тромбоцитов кур в МПК и МПК было отмечено достоверное снижение антилизоцимного признака S. aureus с 1,3±0,22 мкг/мл (в контроле) до 0,6±0,11 мкг/мл (р 0,05) и 0,7±0,15 мкг/мл (р 0,05), соответственно (в соответствии с рисунком 6).
Сходные данные были получены при оценке влияния кислотного экстракта из кровяных пластинок лошади в МПК и МПК на АЛА золотистого стафилококка. Отмечалось уменьшение антилизоцимной активности S. aureus до 0,5±0,31 мкг/мл и 0,6±0,08 мкг/мл (р 0,05), соответственно, что почти в два раза меньше значения рассматриваемого свойства в контроле.
Аналогичное действие оказывал кислотный экстракт из кровяных пластинок крупного рогатого скота: отмечено снижение средних значений АЛА золотистого стафилококка под действием кислоторастворимых белков из кровяных пластинок в МПК и МПК до 0,6±0,20 мкг/мл (р 0,05) и 0,8±0,12 мкг/мл, соответственно.
Изучение влияния соинкубирования тромболизатов с энтеробактериями на АЛА последних показало, что клоны K. pneumoniae и E.coli чувствительны к данному воздействию (в соответствии с рисунком 7).
Максимальное достоверное подавление признака у K. pneumoniae отмечено в результате соинкубирования с кислоторастворимыми белками из тромбоцитов кур в МПК (0,3±0,09 мкг/мл (p 0,01)); кровяных пластинок лошади в МПК и МПК (0,4±0,07 мкг/мл (p 0,01) и 0,4±0,10 мкг/мл (p 0,01), соответственно) и кровяных пластинок крупного рогатого скота в МПК (0,4±0,15 мкг/мл (p 0,01)). В меньшей степени способность клебсиелл деградировать лизоцим изменялась после воздействия тромболизатом кур и кислотным экстрактом из кровяных пластинок крупного рогатого скота в МПК (0,8±0,04 мкг/мл и 0,6±0,06 мкг/мл (p 0,05), соответственно).
Наиболее выраженный подавляющий эффект на АЛА кишечных палочек оказывали антимикробные соединения из кровяных пластинок лошади в МПК (0,2±0,08 мкг/мл (р 0,01)) и тромбоцитов кур в МПК (0,3±0,17 мкг/мл (р 0,05)) (в соответствии с рисунком 8).
Изменение АЛА клонов E.coli под воздействием кислоторастворимых белков тромбоцитов и кровяных пластинок животных В меньшей степени ингибирующая способность была выражена у тромболизатов кур в МПК (0,4±0,23 мкг/мл). Кислоторастворимые белки кровяных пластинок крупного рогатого скота в обеих изученных концентрациях и кровяных пластинок лошади в МПК характеризовались низким ингибирующим эффектом (не более 33%) в отношении антилизоцимного фактора Е. coll. Результаты влияния кислотных экстрактов из тромбоцитов и кровяных пластинок животных на антилизоцимную активность клонов С. albicans представлены на рисунке 9.
Снижение антилизоцимной активности C. albicans под влиянием тромболизатов животных Наиболее выраженный эффект наблюдали при воздействии тромболизатами кур и крупного рогатого скота в МПК. При этом регистрировалось снижение уровня антилизоцимного признака у клонов дрожжеподобных грибов на 56% по сравнению с исходным (р 0,001). Действие этих же кислоторастворимых белков в МПК оказалось менее значимым: подавление АЛА не превышало 33% (р 0,05). Кислотные экстракты из кровяных пластинок лошадей в обеих изученных концентрациях ингибировали способность клонов C. albicans деградировать лизоцим в 1,8 раза (до 0,5±0,12 мкг/мл (p 0,05)).
Результаты экспериментального изучения влияния кислотных экстрактов из тромбоцитов кур, кровяных пластинок лошади и крупного рогатого скота на АЛА демонстрируют снижение персистирующей способности условно-патогенных микроорганимзов по антилизоцимному признаку.
Сравнительный анализ эффективности тромболизатов в отношении способности изученных микроорганизмов деградировать лизоцим, показал выраженный ингибирующий эффект у кислотного экстракта из кровяных пластинок лошади в МПК. Указанная концентрация значимо угнетает антилизоцимный признак у K. pneumoniae и E.coli (на 60% и более), у S. aureus и C.albicans – на 40-60%.
Таким образом, наиболее эффективны по ингибирующему действию на антилизоцимную активность микроорганизмов кислоторастворимые белки из кровяных пластинок лошади в МПК.
Антилактоферриновая активность микроорганизмов широко распространена среди бактерий и грибов, определяя их адаптацию к многофакторному антимикробному действию лактоферрина, и является одним из факторов персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина (Валышев А.В., Валышева И.В., 2006).
Поскольку изучение регулирующего воздействия на АЛфА микроорганизмов открывает новые возможности для поиска эффективных методов терапии и профилактики инфекционной патологии, на следующем этапе нашей работы мы изучили влияние тромболизатов на способность микроорганизмов деградировать лактоферрин.
Полученные данные по модификации антилактоферриновой активности клонов E.coli после соинкубирования с тромболизатами животных представлены на рисунке 10, из которого видно, что под влиянием антимикробных соединений из кровяных пластинок лошади в МПК происходит максимальное снижение изучаемого маркера персистенции до 32,4±11,56 нг/мл против 111,3±8,58 нг/мл в контроле (р 0,001).
Оценка воздействия АМП из тромбоцитов курицы домашней на персистентный потенциал микроорганизмов
Уникальным методом исследования, позволяющим оценить морфологические и механические свойства клеток в живом состоянии, является атомно-силовая микроскопия, поэтому для визуализации последствий воздействия очищенных АМП из тромбоцитов курицы домашней на музейные штаммы Staphylococcus aureus P 209 и Escherichia coli K 12 и детализации механизмов биологической активности этих соединений использовали метод АСМ. Проведённая на атомно-силовом микроскопе визуализация интактных клеток показала, что популяция бактерий контрольной группы была представлена достаточно однородными по морфологии клетками, расположенными преимущественно в группах (в соответствии с рисунком 45а), размерные характеристики которых составляли 0,96±0,18 мкм по длине, 0,97±0,16 мкм по ширине и 0,82±0,12 мкм по высоте. Соответственно рассчитанный на этой основе объём бактериальных клеток равнялся 0,90±0,21 мкм 3.
Атомно-силовая микроскопия ультраструктуры клеточной стенки интактных клеток стафилококков позволила охарактеризовать рельеф поверхности как относительно гладкий (в соответствии с рисунком 45б), среднеквадратичная шероховатость которой составила 1,17±0,11 нм. Исследование механических свойств клеток позволило оценить их упругость величиной 2,24±0,96 МПа.
АСМ-изображения интактных бактерий S. aureus (a, б) и обработанных антимикробными пептидами (в, г). Шкала – 1 мкм
Результаты исследований морфологических и механических свойств клеток S. aureus, обработанных антимикробными пептидами из тромбоцитов кур, свидетельствовали о деструкции клеточной стенки (в соответствии с рисунком 45в). Детальное исследование ультраструктуры поверхности выявило частичное разрушение пептидогликанового слоя (в соответствии с рисунком 45г).
В количественном отношении качественные изменения были выражены достоверным увеличением среднеквадратичной шероховатости поверхности клеточной стенки S. aureus: 3,4±1,17 нм против 1,1±0,11 нм в контроле (р 0,05) (в соответствии с рисунком 46).
Упругие свойства клеток S. aureus, обработанных АМП, были больше контрольных величин и составили 6,2±2,27 МПа (в соответствии с рисунком 47).
Интактные клетки E. coli на сканах визуализировались как расположенные группами палочки (в соответствии с рисунком 48а), имеющие длину 2,51±0,43 мкм, ширину 1,16±0,08 мкм и высоту 0,36±0,02 мкм. Средний объём бактериальных клеток был равен 1,03±0,02 мкм3. Рельеф клеточной поверхности эшерихий оказался несколько более развитым, чем у стафилококков (в соответствии с рисунком 48б): среднеквадратичная шероховатость была равной 1,66±0,20 нм. 9 8
Морфофункциональная реакция грамотрицательных бактерий E. coli при обработке АМП из тромбоцитов кур также оказалась весьма выраженной. Так, большая часть клеток в популяции визуализировалась как уплощённые до 0,21±0,05 мкм образования с признаками нарушения целостности барьерных структур (в соответствии с рисунком 48в).
Анализ размерных морфометрических показателей зафиксировал достоверное снижение значения объема клеток E. coli до 0,86±0,2 мкм 3 (p 0,05). Упругие свойства клеток эшерихий также оказывались сниженными на 40% по сравнению с интактными бактериальными клетками (2,47±0,61 и 0,99±0,84 МПа, соответственно) (p 0,05), что вероятно связано с утратой значительной части клеточного содержимого.