Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая история промысла и разведения медицинской пиявки 11
1.2. Ареал обитания и биологические особенности представителей типа Annelida вида Hirudo medicinalis 14
1.3. Технология выращивания медицинской пиявки 39
1.4. Применение медицинской пиявки в медицине и ветеринарии 50
2. Материал, методика, условия проведения исследований и изучаемые показатели 55
3 Результаты исследований 64
3.1 Оценка «классической» (баночной) технологии содержания пиявок 64
3.2 Описание рециркуляционой системы содержания медицинской пиявки 65
3.3. Этап 1. Определение оптимального потока воды в соответствии с поведенческими характеристиками пиявок в течение суток 67
3.3.1. Опыт 1. Предварительное исследование оптимального потока воды 67
3.3.2 Опыт 2. Основное исследования по изучению оптимального потока воды в системе для взрослых особей и молоди 70
3.3.3 Суточное распределение взрослых особей и молоди пиявок в объёме ёмкости и их тип движения 74
3.4 Этап 2. Выбор оптимальной плотности посадки пиявок в ёмкости в
соответствии с поведенческими характеристиками пиявок в течение суток 78
3.4.1 Опыт 3. Предварительное исследование плотности посадки пиявок в ёмкости 78
3.4.2 Опыт 4. Оценка пищевой активности и интенсивности роста пиявок (основное исследование) 81
3.5 Динамика химических показателей воды 87
3.6 Эффективность применения системы замкнутого оборота воды при выращивании медицинской пиявки 98
Обсуждение результатов исследований 101
Заключение 107
Практические рекомендации 109
Список литературы 110
- Ареал обитания и биологические особенности представителей типа Annelida вида Hirudo medicinalis
- Применение медицинской пиявки в медицине и ветеринарии
- Описание рециркуляционой системы содержания медицинской пиявки
- Опыт 3. Предварительное исследование плотности посадки пиявок в ёмкости
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Европейская медицинская пиявка, H. medicinalis, является разновидностью в семействе Hirudinidae и в настоящее время наиболее широко применяется для кровопускания и в других медицинских целях.
H. medicinalis была когда-то широко распространена в Европе, но теперь относится к редким видам и включена в Красную Книгу беспозвоночных в нескольких странах. В последние годы численность пиявки существенно уменьшилась из-за сверхэксплуатации рыбаками (в качестве приманки) и медицинских целей (особенно в Европе и Азии), и из-за загрязнения среды обитания.
Elliot и Kutschera пришли к заключению, что основным фактором в снижении численности медицинской пиявки была общая потеря заболоченных мест, особенно заливных водоемов и болот повсюду в Европе. Разрушение этих водных образований также привело к снижению амфибий, которые являются важным источником пищи для пиявок и крайне важны для выживания их молоди.
Медицинская пиявка (H. medicinalis) была включена в Красную Книгу беспозвоночных IUCN и Приложение II Соглашения по Международной торговле вымирающими видами Дикой Фауны и Флоры (конвенция CITES) в 1987. Поэтому, необходимо иметь больше информации о медицинской пиявке, чтобы облегчить её сохранение и управление, и предотвратить вымирание в дикой природе.
Известно, что из всех известных видов пиявок только медицинская пиявка (Hirudo medicinalis) содержит целый комплекс БАВ, оказывающих разностороннее воздействие на организм человека и животных.
По причине высокой эффективности при лечении широкого спектра заболеваний, а также в результате практически полного истребления вследствие бесконтрольного вылова, возникла необходимость искусственного разведения медицинской пиявки. Для осуществления этой цели проводились исследования биологии этих животных. В итоге были разработаны эффективные методы воспроизводства медицинской пиявки, основанные на ее биологических особенностях, которые позволили получать высокопродуктивных животных в кратчайшие сроки.
В настоящее время в России и за рубежом медицинская пиявка разводится в промышленных масштабах на биофабриках, которые получают сертифицированных животных для следующих основных нужд: поставка живых особей для лечебных и научных целей; получение экстрактов БАВ для производства медицинских препаратов и косметических средств.
В связи с тем, что «российская» медицинская пиявка пользуется большим спросом не только на родине, но и практически по всему миру, следует принимать меры для оптимизации и усовершенствования технологии воспроизводства медицинской пиявки для повышения объемов поставок этого животного, как на внутренний, так и на внешний рынок.
Степень разработанности темы исследований. На сегодняшний день наиболее удобной и доступной является технология М.В. Синевой и Г.Г. Щеголева, разработанная в 40-50-х гг. Однако она морально устарела и имеет ряд недостатков, которые возможно устранить путем проведения комплексного исследования всех негативных факторов и разработки способов их полной или частичной ликвидации.
Однако необходимо признать, что доступ к большинству разработок в этой области является закрытым. В литературе можно встретить лишь общие понятия и краткие описания.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить биологические и хозяйственно-полезные признаки медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.), выращиваемой в искусственных условиях замкнутого оборота воды.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
изучить и выявить недостатки существующей классической «баночной» технологии выращивания медицинской пиявки;
разработать систему содержания и выращивания медицинской пиявки в искусственных условиях замкнутого оборота воды;
оценить физико-химические параметры воды при содержании медицинской пиявки;
изучить локомоторную активность медицинской пиявки в объёме ёмкости;
изучить пищевую активность медицинской пиявки при разных условиях содержания;
оценить показатели роста молоди медицинской пиявки при «классической» баночной системе и системе с замкнутым оборотом воды;
определить плотность посадки медицинской пиявки в объёме ёмкости при разных условиях выращивания;
оценить эффективность использования технологии выращивания медицинской пиявки в условиях замкнутого оборота воды.
Научная новизна исследования. Особенности технологий разведения медицинской пиявки представляют коммерческую тайну и в литературных источниках не публикуются. Биофабрики торгуют в основном сертифицированными взрослыми пиявками, поэтому получить для исследовательских целей пиявок на разных стадиях онтогенеза практически невозможно.
При отсутствии медицинской пиявки в естественной природной среде, возникает необходимость разработать собственную технологию разведения пиявок.
Кроме того, уже более 70-ти лет для выращивания медицинской пиявки применяется так называемая «классическая» баночная технология, которую можно признать морально устаревшей и нуждающейся в корректировке отдельных технологических процессов.
Следовательно, исследование дополнительных параметров содержания медицинской пиявки в условиях рециркуляционной системы, является необходимым обстоятельством повышения качества получения биомассы пиявок для использования в области фармации, ветеринарии и медицины.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования расширяют и уточняют имеющиеся знания о содержании и разведении медицинской пиявки и дополняют сведения по контролю за технологическими параметрами поддержания оптимальных экологических условий при выращивании медицинской пиявки.
Разработана система замкнутого оборота воды для выращивания медицинской пиявки. Исследованы и рекомендуются к применению оптимальные режимы содержания пиявок в условиях замкнутого оборота и постоянной циркуляции воды.
Установлено, что для технологии содержания пиявок в условиях замкнутого оборота воды наиболее подходит режим, основанный на 48-ми разовом обороте воды в течение суток при плотности посадки взрослых пиявок в 80 особей на одну ёмкость объёмом 3 литра.
Показана возможность применения технологии выращивания медицинской пиявки в условиях замкнутого оборота воды как одного из способов получения качественного биоматериала для фармацевтической промышленности, ветеринарии и медицины.
Основные положения, выносимые на защиту:
обоснование целесообразности разработки технологии выращивания медицинской пиявки в искусственных условиях замкнутого оборота воды;
оценка физико-химических параметров воды при разных условиях содержании медицинской пиявки;
локомоторная активность медицинской пиявки в объёме ёмкости;
показатели роста и пищевая активность молоди медицинской пиявки;
плотность посадки медицинской пиявки в объёме ёмкости;
режимы циркуляции воды в системе замкнутого водооборота;
эффективность использования технологии выращивания медицинской пиявки в условиях замкнутого оборота воды.
Методология и методы исследований. На основе экспериментальных данных разработана методология выращивания медицинской пиявки в условиях замкнутого оборота воды, основанная на применении зоотехнических, этологических, химических и статистических методов.
Степень достоверности и апробация результатов. Исследования выполнены в условиях лаборатории гирудокультуры и вермитехнологии аграрно-технологического института РУДН на достаточном поголовье медицинской пиявки. Определение биологических и хозяйственно-полезных признаков выполнено с применением рекомендованных методик и современных методов исследований.
Достоверность результатов подтверждается наличием первичной
документации, которую вели в ходе выполнения экспериментов. Первичный
материал подвергнут биометрической обработке с использованием
стандартных пакетов статистических программ на персональном компьютере.
Результаты исследований используются в учебном процессе в преподавании дисциплин «Современные проблемы биологии», «Современные проблемы зоотехнии» для студентов-магистров направления «Зоотехния» и дисциплины «Разведение животных с основами частной зоотехнии» для студентов специальности «Ветеринария» Аграрно-технологического института РУДН; элементы диссертационной работы используются в практике ветеринарного центра «Зеленый дракон» при содержании пиявок для лечения животных с применением практической гирудотерапии.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на VII международной конференции «Инновационные процессы в АПК» преподавателей, сотрудников, аспирантов и студентов (23-25 апреля 2015 г.), г. Москва; на межкафедральных заседаниях профессорско-преподавательского состава кафедры стандартизации, метрологии и технологии производства продукции животноводства аграрного факультета Российского университета дружбы народов в 2014-2015 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных статьи, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, в «Вестнике Российского университета дружбы народов», 2015; в журнале «Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса», 2016.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
представлены на следующих конференциях: III международная конференция
«Инновационные процессы в АПК» преподавателей, сотрудников, аспирантов и
студентов (22-26 марта 2012 г.), г. Москва; IVмеждународная конференция
«Инновационные процессы в АПК» преподавателей, сотрудников, аспирантов и
студентов (23-25 апреля 2013 г.), г. Москва; на научно-технических
конференциях профессорско-преподавательского состава кафедры
стандартизации, метрологии и технологии производства продукции
животноводства аграрного факультета Российского университета дружбы народов в 2011-2013 гг.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136
страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов
исследований, результатов и обсуждения собственных исследований, выводов,
практических предложений, списка литературы, включающего 189
наименований, в том числе 95 иностранных авторов. Работа содержит 17 таблиц и 25 рисунков.
Личное участие автора. Автор, при участии научного руководителя, составил программу и разработал методику исследований. Самостоятельно подобрал и систематизировал специальную литературу по теме диссертации, написал главу «Обзор литературы». Лично разработал, собрал прототип
промышленной установки по выращиванию медицинской пиявки в условиях замкнутого оборота воды, выполнил экспериментальные исследования, обработал данные, полученные в экспериментах, обобщил результаты исследований. Подготовил рукописи диссертации и автореферата, научных публикаций, доклады на научных конференциях.
Ареал обитания и биологические особенности представителей типа Annelida вида Hirudo medicinalis
Брюшко покрыто черными пятнами неправильной формы, вдоль спины тянутся 6 узких красно-оранжевых полосок с незначительными правильно повторяющимися расширениями, на которых располагаются черные пятна каплевидной или булавовидной формы. Кольца шероховатые. Восточный подвид более яркий по цвету. Вдоль спины тянутся узкие оранжевые полосы, через равные промежутки покрытые черными 4-угольными пятнами. Брюшко черное, с зелеными пятнами, попарно расположенными через одинаковые промежутки [17, 18, 27, 40, 71, 81, 93].
Внешние покровы тела и сократительный аппарат пиявок формируют кожно-мышечный мешок. Собственно покровная ткань представлена кутикулой, однослойным эпителием и соединительной тканью. Каждые 2-4 дня пиявка линяет, сбрасывая кутикулу, всегда в направлении от головы к хвосту [7, 147]. Мышечная система составляет 60-70% от общей массы тела и представлена 3-мя группами мышц: кольцевые, диагональные и продольные. Такое строение мышечного аппарата позволяет пиявкам осуществлять разнообразные формы локомоции: плавание, «шагание», маятникообразные и «дыхательные» движения [32, 158, 62, 24, 83].
Кровеносная система пиявок редуцирована, вместо нее имеется специальная транспортная система (лакунарная), содержащая красную гемолимфу, цвет которой обусловлен растворенным в ней дыхательным пигментом гемоглобином. Дыхание у пиявок обеспечивается за счет наличия густой сети капилляров, расположенных в толще кожных покровов, путем диффузии кислорода из водной среды. Нервная система построена по типу цепочек и состоит из церебральных ганглиев, подглоточной массы, туловищных ганглиев и задней ганглиозной массы. Выделительная система пиявок представлена парными метанефридиями [62, 24, 7, 39].
У пиявок хорошо развиты обоняние, вкус и осязание. Тактильные и химические раздражители воспринимаются с помощью чувствительных сосочков (папиллом), расположенных на поверхности туловищных сегментов. Восприятие световых раздражителей осуществляется точечными глазками, которые локализованы на начальных сегментах тела и представляют собой ретинальные клетки. Отростки этих клеток сливаются в сенсорный нерв, проходящий по оси глаза [26, 62].
Медицинские пиявки отлично реагируют на запахи, которые исходят от погруженных в воду предметов. Из большого количества разнообразных запахов пиявки безошибочно распознают те, которые исходят от людей и крупных млекопитающих (Зенкевич Л.А., 1968; Давид О.Ф., 1990). Наиболее притягательным для них является запах крови, реакция на которую проявляется незамедлительно [24, 66].
Аргинин является самым лучшим кормовым стимулятором для H. Medicinalis. Elliott обнаружил, что чувствительность H. medicinalis к фагостимуляции аргинином и некоторыми аналогами, локализована в верхней губе, в сенсиллах, содержащих хеморецепторы. Также, H. medicinalis стимулируется глюкозой, хотя и в меньшей степени, чем аргинином [107, 108, 113].
Пиявки остро реагируют на громкий шум и звуковые вибрации. Также при поиске источника питания медицинские пиявки ориентируются по колебаниям воды, которые вызываются любыми относительно крупными животными. Даже слабые всплески воды привлекают множество пиявок в густонаселенных ими водоемах [7, 17, 182].
Известно, что местоположение медицинской пиявки может быть локализовано источниками водных волн. У пиявки есть две сенсорные системы, способных чувствовать движение воды: механосенсорные волоски вдоль их тела; а также примитивные глаза, ощущающие изменения в уровне света, которые происходят, когда поверхностные волны отбрасывают тени на их теле. Оба эти типа датчиков имеют обширное распределение по телу пиявки. У пиявки каждый из 21 сегментов в середине тела имеет семь пар механосенсорных сенсилл, которые являются чувствительным к малейшим движениям воды. Кроме того, пиявка имеет пять пар простых глаз, расположенных на ее голове. Не один тип глаз не способен сформировать изображение, но головные глаза способны чувствовать направление движения луча света [122].
Медицинские пиявки, как и многие водные животные, используют возмущения воды для локализации своей добычи, поэтому они должны быть способны определить, создано ли волновое возмущение движением добычи или другим источником. Поскольку трофическое предпочтение у пиявок меняется в течение их развития, Harley и др обнаружили, что нитчатки более легко локализовают источники волн с более низкими частотами (2 Гц), чем их взрослые коллеги (8-12 Гц). Кроме того, в мультимодальном состоянии, поведение взрослых особей в большей мере определяется механосенсорной информацией, а поведение нитчаток в большей степени визуальными наблюдениями [122].
Кроме выше указанных чувств, медицинская пиявка обладает также тепловым чувством. Терморецепторы способны улавливать незначительную разницу в нагретой поверхности. Эта особенность имеет определенный биологический смысл, так как в ходе эволюции у них выработался термотропизм, т.е. стремление перемещаться в область с температурами, несколько более высокими, чем нормальные. Также медицинская пиявка хорошо чувствует электромагнитное излучение [24].
Медицинская пиявка относится к эктопаразитам, ведущим активный свободный образ жизни [7]. Нападение пиявок на мелких животных часто приводит к гибели последних от кровопотери, что дает основание классифицировать их и как хищников. Также известны случаи ложного паразитизма, когда пиявки случайно попадают в глотку животных или человека вместе с водой и, закрепившись там, некоторое время паразитирует [16, 17, 71].
Строение пищеварительной системы. В соответствии с особенностями питания пиявка имеет черты глубокой специализации пищеварительной системы: особое строение челюсти, наличие слюнных желез с секретом, содержащим различные БАВ, наличие выростов на желудке. Основными объектами питания медицинской пиявки являются земноводные рептилии, водоплавающие птицы, выдры, крысы. Частыми являются случаи нападения пиявок на крупных теплокровных млекопитающих, приходящих на водопой, таких как косули, кабаны, домашний скот. Они нападают и на человека [24, 32, 55, 62].
Применение медицинской пиявки в медицине и ветеринарии
Медицинская пиявка является относительно простым в содержании и разведении биологическим объектом. Однако, для обеспечения наиболее эффективного процесса выращивания пиявок необходимо соблюдение ряда биотических и абиотических факторов [48].
Из биотических факторов наибольшее значение имеет концентрация особей в ёмкостях. Плотность посадки молодых и голодных пиявок с достаточно малыми размерами может составлять 50 особей на 3-литровый сосуд [38]. Концентрация взрослых пиявок в ёмкостях для содержания должна быть ниже. По данным Е.В. Рассадиной при содержании взрослых пиявок в сосуде объемом 3 л при концентрации 30 и более особей проявляются признаки угнетения их жизнедеятельности: они без видимых причин выпускают кровь, слизь и другие продукты жизнедеятельности в большом количестве. Возникает эффект перенаселенности – отравление особей собственными метаболитами. При этом вода в сосуде приобретает желто-зеленый, палевый цвет. Пиявки становятся агрессивным, возникает явление каннибализма. Таких пиявок автор рекомендует рассаживать по 20 особей на 3-литровый сосуд, при этом их суммарная масса не должна превышать 91,4-100 г. [72].
Плотность посадки маток для спаривания по данным Михайлова С.В. может составлять 7-10 особей на 3 л. В исследованиях Каменева О.Ю. наиболее продуктивным является содержание маток в ёмкостях для спаривания в количестве 5 особей на 3 л. По другим данным, наибольшее число коконов получают от маток при их одиночной посадке в ёмкости для откладки [38, 55, 78, 93].
В отношении массы маток, используемых для размножения, в литературе имеются противоречивые данные. По данным Рассадиной Е.В. масса маток после последнего кормления должна составлять не менее 18 г, что обеспечит получение наиболее качественного потомства. Напротив, в работах Синевой М.В. указывается, что для спаривания вполне пригодны пиявки с массой после кормления 10-15 г. [72, 78].
Среди абиотических факторов, имеющих значение для жизнедеятельности медицинской пиявки, выделяют следующие: водный режим, температура, минерализация, рН воды, концентрация в воде растворенного кислорода, световой режим.
В литературных источниках рекомендуется ежедневная замена всего объема воды в ёмкостях для содержания пиявок, в жаркие дни – 2 раза в день. При возникновении заболеваний воду также меняют 2 раза в день [91]. Каменев О.Ю. в своих исследованиях рекомендует производить замену воды 1 раз с интервалом в 72 ч. При этом наблюдается наименьший отход пиявок [38].
Температурный фактор является наиболее важным для жизнедеятельности медицинской пиявки. Она является теплолюбивым животным, при этом колебания температуры на нее действуют неблагоприятно. Температурный диапазон, подходящий для жизнедеятельности пиявок, установленный в лабораторных условиях, составляет +16-+28С. При соблюдении заданных температур медицинская пиявка остается активной в течение всего года вне зависимости от освещенности. Для содержания взрослых особей рекомендуется температура +17-+19С. Описана способность взрослых пиявок переносить кратковременное повышение температуры воды. Так, например, она успешно переживает температуру воды +37-+39С днем и +33-+35С ночью в течение 30 дней. При таком режиме смертность особей составляет 1-3% от общего количества при регулярной смене воды 1 раз в 2 дня. Повышение температуры до 40-41С вызывают беспокойство пиявок, при этом возникает так называемое движение страха. При дальнейшем повышении температуры от +41 до+45С пиявки сначала прекращают двигаться, затем наступает тепловое оцепенение, которое приводит к смерти животного в течение 1-12 ч. Нитчатка не способна выдерживать температуру выше +40С. Также пиявки способны переносить небольшое похолодание. При снижении температуры воды ниже +14-+16С наступает холодовое оцепенение. Гибель взрослых особей наступает в интервале температур от +9 до +10С, молодняка – от +5 до +7С [55, 72].
В работах ряда авторов [29, 70, 72, 78] установлены оптимальные температурные режимы для спаривания и для откладки коконов: +22-+25С и +24С соответственно. При температуре ниже +15-+16С совокупления не регистрируются. Также существенное влияние температура оказывает на продолжительность развития нитчатки в коконах. Так при температуре +18-+20С оно составляет 35-44 дней, а при +24-+26С – 28-29 дней. Для успешного выхода нитчатки из коконов рекомендуется температура не ниже +18-+20С, оптимальная – +23-+25С [55, 62, 72, 78].
Температура оказывает существенное влияние на рост нитчатки. Показано, что наибольший прирост живой массы отмечается при температуре воды до +22-+25С. Снижение ее до +12-+16С вызывает резкое угнетение роста пиявок [30].
Пиявки являются эвриоксиобионтами, т.е. способны переносить колебания содержания кислорода в воде в широких пределах. Медицинская пиявка предпочитает водоемы, дефицит кислорода в которых сильно не выражен или наблюдается редко. Чувствительность молодых особей к недостатку кислорода значительно выше, чем взрослых [72].
По литературным данным медицинская пиявка способна длительное время сохранять жизнеспособность при показателях рН от 6,1 до 9,0, т.е. ее можно отнести к эврибионтным организмам. Однако в природных условиях она встречается в водоемах с нейтральной реакцией среды (рН от 6,5 до 7,5). В исследованиях Михайлова С.В. установлено, что оптимальной для нормальной жизнедеятельности медицинской пиявки является слабокислая (рН 5,0-6,5) реакция среды [55, 72].
Медицинская пиявка является пресноводным организмом. Оптимальной является минерализация воды 1,5-3 г/л, менее предпочтительны водоемы с содержанием солей до 4-5,5 г/л. В водоемах с более высокой минерализацией воды медицинская пиявка, как правило, не встречается. При содержании в искусственных условиях в воде с высокими показателями минерализации погибает. Данные по минеральному составу вод, предпочитаемых медицинской пиявкой в литературе отсутствуют [54].
Медицинские пиявки очень чувствительны к любым загрязнениям водоемов и окружающей среды (химическим, бактериологическим, радиоактивным и др.), поэтому их можно встретить только в чистых районах. Данное свойство медицинской пиявки позволяет использовать ее, как биоиндикатор экологической чистоты водоемов [37, 55, 72]. В опытах Каменева О.Ю. установлено, что наибольшую опасность для медицинской пиявки представляют фосфорорганические пестициды и пестициды из класса пиретроидов. Среди тяжелых металлов самым токсичными являются соли ртути, менее токсичными – соли никеля. При этом нитчатка менее устойчива к вышеуказанным загрязнителям, чем взрослые особи. Ряд исследователей указывают на способность пиявок к биоаккумуляции тяжелых металлов, таких как медь, цинк и свинец [37, 38, 72, 90].
Описание рециркуляционой системы содержания медицинской пиявки
Как видно из данных рисунка 19, в контрольной группе концентрация кислорода в воде в течение нескольких часов после замены воды резко снижалась (до уровня менее чем 2 мг/л). В то время как во всех опытных группах концентрация растворенного кислорода в воде в течение 15-дневного периода исследования, существенно не изменялась (колебание от 5 до 7 мг/л) и поддерживалась на оптимальном уровне.
Водородный показатель (рН). В исследованиях ряда авторов указывается, что оптимальной для обитания медицинской пиявки является слабокислая, нейтральная или слабощелочная среда. Результаты наших исследований вполне соответствуют литературным данным и представлены в таблице [54, 72]. Анализ полученных данных показал, что в контрольной («классическая» баночная система) и в опытных (рециркуляционная система) группах рН воды находился в пределах от 7,7 до 8,1, то есть среда являлась слабощелочной. Средний показатель рН в воде, где содержались пиявки опытных группа, составил 7,95±0,02 при колебаниях от 7,9 до 8,1. В контрольной группе отмечено достоверное увеличение рН от 7,7±0,00 до 8,07±0,03 через 2-е суток пребывания в ней пиявок. Таким образом, в опытной системе показатель рН отличается меньшей вариабельностью, обеспечивая наиболее стабильные показатели среды.
Минерализация воды. В литературных источниках указывается, что для медицинской пиявки наиболее оптимальной является минерализация воды от 1,5 до 3,0 г/л., менее предпочтительно повышение ее уровня до 4,0-5,5 г/л. Также отмечается, что в естественной среде в водоемах с более высокой концентрацией солей данный вид не встречается, а в аналогичных показателях минерализации в искусственной среде погибает [55].
В наших экспериментах минерализация воды не превышала 1,0 г/л (рисунок 20, приложение 4). В опытных группах средний показатель минерализации составил 372,0 ± 2,20 мг/л. В контрольной группе отмечено увеличение минерализации воды от 347,3±1,20 до 443,3±4,41 мг/л через 2-е суток пребывания в ней пиявок. Таким образом, в рециркуляционной (с замкнутым оборотом воды) и контрольной системах показатель минерализации отличается существенной изменчивостью. воды в ёмкостях через 2-е суток пребывания в ней пиявок.
Обозначения: 1 – контрольная группа с плотностью посадки 50; 2 – опытная группа с плотностью посадки 50; 3 – опытная группа с плотностью посадки 80; 4 – опытная группа с плотностью посадки 110 пиявок в ёмкости соответственно.
Несмотря на низкую, по сравнению с литературными данными, минерализацию воды, в наших экспериментах не отмечено отрицательного влияния данного показателя на жизнедеятельность медицинской пиявки. Нормальные поведенческие реакции пиявок указывали на то, что такая вода вполне пригодна для их содержания.
Концентрация аммиака, нитритов, нитратов. Аммиак: Аммиак является важным показателем загрязнения водной среды и главной проблемой в аквакультурных системах. Токсические эффекты включают вредные гематологические факторы, нарушение дыхания и кровообращения, ставя под угрозу метаболические и неврологические системы организмов, водный и солевой дисбаланс, гистопатологию печени и структуры почечной ткани и в конечном итоге приводящий к смерти [103, 143, 169].
Как правило, не являющиеся млекопитающими водные организмы выделяют большую часть своих азотосодержащих отходов в виде аммиака. У медицинской пиявки, заглатывание крови вызывает восьмикратное повышение потребления кислорода и выделение аммиака в течение нескольких дней [96, 135] .
Аминокислоты, возникающие в результате переваривания белков крови, должны быть использованы в качестве субстратов в катаболических путях в дополнение к их анаболическим реакциям, так как кровь позвоночных содержит в основном белки. Для того, чтобы быть использованными в катаболическом метаболизме, аминокислоты должны быть деаминированы, что может привести к крупномасштабному образованию аммиака. Именно это на самом деле можно наблюдать у пиявки вскоре после кормления кровью, сывороткой или искусственными диетами, содержащими аминокислоты: выделение аммиака в окружающую воду существенно повышается [129] (см. рисунок 21, приложение 4).
Обозначения: 1 – контрольная группа с плотностью посадки 50; 2 – опытная группа с плотностью посадки 50; 3 – опытная группа с плотностью посадки 80; 4 – опытная группа с плотностью посадки 110 пиявок в ёмкости соответственно.
Как видно из диаграммы (рисунок 21), количество аммиака в контрольной группе (10,2 ± 0,44) в течение двух дней после замены воды в ёмкости резко возросло и было значительно выше, чем в других группах. Это показывает, что выделение метаболита пиявками в качестве азотных соединений, оказывает огромное влияние на повышение концентрации аммиака и, следовательно, снижение качества воды. Хотя вода в зависимости от ситуации (вес, возраст, плотность посадки в ёмкости, кормление и т.д.) меняется периодически и предотвращает сильное воздействие на пиявок и их смертность. Но в долгосрочной перспективе метаболиты могут оказывать неблагоприятное воздействие на их здоровье и жизнедеятельность.
Нитриты: Присутствие нитритов внутри аквакультурного пруда часто является причиной биологического окисления аммиака. Эту реакцию осуществляет бактерия, которая естественным образом существует в аквакультурной среде. Бактерия рода Nitrosomonas является основным ответственным за нитрификацию воды в аквакультуре, но существуют и представитеоли других родов, участвующих в этом процессе. В общем случае, абсорбция NO2 бактериями представлена в танках и прудах. Для повышения их активности, рекомендуется биофильтрация. [95].
Согласно полученным результатам, наименьшее количество нитритов (как промежуточный продукт нитрификации) было зарегистрировано в контрольной группе (0,32 ± 0,020) (рисунок 22, приложение 4).
Обозначения: 1 – контрольная группа с плотностью посадки 50; 2 – опытная группа с плотностью посадки 50; 3 – опытная группа с плотностью посадки 80; 4 – опытная группа с плотностью посадки 110 пиявок в ёмкости соответственно.
В ёмкостях с проточной водой концентрация нитритов превышала примерно в 2 раза показатели контрольной группы. В то же время можно отметить, что среди опытных групп значительных различий в концентрации нитритов не наблюдалось. Причина этого заключается в том, что указанная реакция практически не происходит в воде, где содержались пиявки контрольной группы, из-за последовательной (относительно частой) замены воды. Поскольку бактерии не могут заселить водный объём ёмкости и действовать в такой ситуации в воде. В то время как в опытных группах, вода циркулирует через биологический фильтр и бактерии имеют достаточно времени для проявления своего действия. В связи с этим, количество нитритов постепенно увеличивается в воде в качестве промежуточного продукта нитрификации.
Нитраты: В целом, нитраты являются нетоксичной формой азота в водоеме [95]. Наличие нитратов в воде аквакультуры проявляется в качестве продукта органической бактериальной активности в пруду. Реакция включает в себя наличие нитритов и кислорода. В аквакультурных водоёмах, наиболее представительный род нитрифицирующих бактерий, который может выполнять преобразование нитритов в нитраты, является Nitrobacter, но и бактерии других родов, как правило, участвуют в ходе нитрификации. Концентрация нитратов обычно контролируется в системах аквакультуры путем разбавления (частичной замены воды). В интенсивных рециркуляционных системах от 5 до 10% воды удаляются и заменяются каждый день. В системах с низким уровнем механизации, ежедневный обмен воды, как правило, составляет более 10%. [95].
Опыт 3. Предварительное исследование плотности посадки пиявок в ёмкости
Можно констатировать, что в группах с более высоким потоком воды, картина была существенно лучше, по сравнению с группами с более низким уровнем потока воды.
Согласно этологического этапа эксперимента было установлено, что система выращивания пиявок с замкнутым оборотом воды имеет непосредственное воздействие на распределение пиявок в разных слоях ёмкости.
В результате наших наблюдений установлено, что в течение дня распределение пиявок в ёмкостях оказалось неравномерным. При этом отмечены характерные отличия в процентном распределении особей по условным зонам ёмкости для содержания пиявок.
Такое распределение пиявок объясняется водным режимом и качеством воды. В контрольной группе, где отсутствует движение воды в емкостях, пиявки стараются располагаться в зонах наилучшего газообмена, т.е. на границе водной и воздушной средой, а также непосредственно вне зоны воды. В опытной группе отмечается обратное распределение. Благодаря тому, что в емкостях обеспечено постоянное движение воды, происходит перемешивание слоев и, следовательно, постоянное обогащение её кислородом. При этом верхние слои, насыщенные кислородом, в процессе перемешивания поступают на дно емкости. Таким образом, пиявки располагаются в зоне наибольшего комфорта, то есть на дне емкости.
Раздельное исследование по изучению оптимального потока воды в системе для взрослых особей и молоди показало, что в контрольной группе пиявки ведут себя более активно в течение дня, чем в опытных группах. В контрольной группе достоверно чаще пиявки осуществляют дыхательные движения, что служит явным критерием обеспеченности пиявок кислородом. При его недостатке пиявка прикрепляется задней присоской к какой-либо поверхности, а свободным концом тела производит волнообразные движения, создавая принудительный ток воды. Данное поведение способствует более эффективному газообмену при недостатке кислорода. По нашим данным реже всего дыхательные движения отмечались у особей в опытных группах, т.е. в проточной системе обеспечивается наиболее благоприятный режим для жизнедеятельности медицинской пиявки.
Суточное распределение пиявок в объёме ёмкости и их тип движений в системе замкнутого водного обмена (при обороте воды 48 раз в сутки) существенно отличались от аналогичных показателей пиявок, содержащихся в условиях «классической» баночной технологии. Полученные данные показали, что минимальный процент взрослых пиявок в нижней части ёмкости зафиксирован утром и составлял 71,31 ± 1,02%. Наиболее низкий процент пиявок в толще воды отмечен днем (15,53 ± 0,65), а наибольшее количество пиявок без движений наблюдали в вечернее время (P 0,05). Схожее поведение отмечали и у молодых пиявок.
В контрольной группе процент пиявок в нижней части ёмкости утром составил 48,84±1,70, что существенно ниже опытной группы (P 0,05). Минимальный процент пиявок над водой был зафиксирован утром (13,26 ± 1,19) (Р 0,05). В тоже время, можно заключить, что из-за плохого качества воды и низкого содержания кислорода в нижней части банки при «классической» баночной системе содержания взрослых пиявок, большее количество пиявок днем и вечером перемещались в верхние слои воды, где содержание кислорода выше.
Концентрация особей в ёмкостях относится к биотическим факторам, которые имеют наибольшее влияние на поведенческие реакции пиявок. Изучая поведение пиявок при разной плотности посадки в ёмкости, установили, что наблюдалась тенденция к снижению абсолютных значений измеренных показателей при чрезмерном повышении плотности посадки (группы с плотностью посадки от 90 до 110 пиявок в каждой ёмкости), может быть из-за конкуренции за пространство или относительно низкого качества воды.
Оценка пищевой активности и интенсивности роста пиявок показала, что после 105 дней экспериментального периода были отмечены существенные различия между группами по массе тела. Минимальная живая масса тела была зафиксирована в контрольной группе (1,58 ± 0,010 г) с существенной разницей по сравнению с другими опытными группами (р 0,001), в то время, как наиболее крупные пиявки после 105 дней экспериментального периода были обнаружены в 3-й группе (2,61 ± 0,016 г). Это подтвердилось и результатами исследования линейных промеров. После 105 дней исследований были отмечены существенные различия между группами в отношении длины тела. Максимальная длина тела пиявок была зафиксирована в опытных группах 3 и 4 (4,74±0,112 и 4,53±0,097 cм соответственно), что существенно превышало средние размеры тела пиявки в контрольной группе (3,82±0,086 см) (Р 0,01).
Кроме того, максимальное количество поглощенной крови одной пиявкой было отмечено в 3-й и 4-й опытных группах (6,9 ± 0,08 и 5,3 ± 0,11 г соответственно), а минимальное потребление крови было зафиксировано в контрольной группе (4,8 ± 0,02 г).
Согласно полученным результатам, наибольшие средняя масса тела и среднее количество поглощенной крови, были зафиксированы в 3-й группе с плотностью посадки взрослых пиявок в количестве 80 особей в одной ёмкости. Это означает, что условия окружающей среды и обитания для пиявок, созданные в условиях постоянного водообмена, являются лучшими, пиявки быстрее переваривают потребленную пищу и готовы к получению новой порции крови. Химический анализ биологического материала пиявок из контрольной группы и группы 3 (с оборотом воды 48 раз в сутки и плотностью посадки 80 взрослых особей в ёмкости) показал, что по содержанию органических веществ в теле пиявок не выявлено существенных различий между группами. По содержанию минеральной части в теле пиявок можно отметить тенденцию к большему наличию железа (разность составила 26 мг/кг) и меди (разность составила 16,1 мг/кг) у особей опытной группы по сравнеию с контрольной.
Изучение химического состава воды выявило значительные различия в отдельных показателях качества воды между опытными и контрольными группами. В контрольной группе концентрация кислорода в воде в течение нескольких часов после замены воды резко снижалась (до уровня менее чем 2 мг/л). В опытных группах концентрация растворенного кислорода в воде в течение 15-дневного периода исследования, существенно не изменялась (колебание от 5 до 7 мг/л) и находилось на оптимальном уровне.
Показатели общей минерализации воды, аммония, щелочности, БПК и ХПК, мутности и цветности воды в контрольной группе существенно превосходили аналогичные показатели в опытных группах к концу вторых суток пребывания пиявок в ёмкости (P 0,01). Это указывает на существенное ухудшение качества воды в контрольной группе, что негативно влияет на этологические и зоотехнические характеристики пиявок.
По концентрации нитратов и общей жесткости воды не выявлено заметных различий.
Концентрация нитритов в опытных группах превышала примерно в 2 раза показатели контрольной группы. Это обясняется тем, что в опытных группах вода циркулирует через биологический фильтр и нитрифицирующие бактерии имеют достаточно времени для проявления своего действия. В связи с этим, количество нитритов постепенно увеличивается в воде в качестве промежуточного продукта нитрификации.