Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Экспериментальные и теоретические исследования гидратации нуклеотидных оснований (литературный обзор).
1.1. Экспериментальные подходы 9
1.1.1. Оптическая спектроскопия 9
1.1.2. Низкотемпературная калориметрия 14
1.1.3. Диэлектрометрия и ультразвуковая методика 18
1.2. Теоретические подходы 23
1.2.1. Квантовомеханические расчеты и метод атом-атомных потенциальных функций 25
1.2.2. Метод статистической механики и Монте-Карло 29
1.3. Постановка задачи исследования 37
Глава II. Экспериментальные методики
2.1. Измерение энтальпий сублимаций 39
2.1.1. Метод низкотемпературного кварцевого резонатора 41
2.1.2. Масс-спектрометрический метод 51
2.2. Калориметрические измерения энтальпий растворения 54
2.3. Методы расчета воднодоступных молекулярных поверхностей и объемов биомолекул 59
Глава III. Энтальпии сублимации и растворения 64
3.1. Препараты, статистическая обработка результатов 64
3.2. Цитозин и его метилпроизводные 67
3.3. Метил и алкилпроизводные тимина и урацила 68
3.4. Производные аденина 73
3.5. Краткие выводы 77
Глава ІV. Энтальпии гидратации 82
4.1. Энтальпии взаимодействия молекул оснований с водой
4.2. Влияние алкилирования на гидратацию урацила и тимина 84
4.3. Влияние л/-метилирования на гидратацию аденина 91
4.4. Энтальпии взаимодействия с водой цитозина и его метилпроизводных 94
4.5. Краткие выводы 96
Заключение 99
Литература
- Низкотемпературная калориметрия
- Квантовомеханические расчеты и метод атом-атомных потенциальных функций
- Калориметрические измерения энтальпий растворения
- Метил и алкилпроизводные тимина и урацила
Введение к работе
В настоящее время установлено, что структурные свойства биополимеров ДНК, РНК-материальных носителей информации о наследственности - существенно зависят от контакта с ионно-водным окружением. Поэтому изучение гидратационных особенностей нуклеиновых кислот и их компонент является одной из актуальных проблем биофизики и молекулярной физики.
В связи с этим особое значение приобретает исследование гидратации нуклеотидных оснований и их производных, т.к. взаимодействие их с водой играет важную роль в стабилизации и конформаци-онной подвижности двойной спирали ДНК. Определение основных термодинамических характеристик гидратации нуклеотидных оснований и их производных представляет существенный интерес для понимания структуры гидратных оболочек молекул нуклеиновых кислот.
В последние годы значительно возросло число теоретических работ, связанных с расчетами взаимодействий нуклеотидных оснований и их метилпроизводных с водой. Прямые квантовомеханические исследования таких систем возможны только для небольшого числа ио-лекул воды из-за чрезвычайной сложности математических расчетов и ограниченных возможностей существующих ЭВМ. В настоящее время наиболее эффективными являются различные методы машинного моделирования. Они позволяют расчитать гидратацию нуклеотидных основа-
р ний с довольно большими кластерами воды ( ~10 молекул). Однако
корректность теоретических предсказаний нельзя было определить ввиду отсутствия соответствующих экспериментальных результатов.
Именно поэтому исключительную важность приобретают экспериментальные исследования термодинамических параметров гидратации
нуклеотидных оснований и их производных.
Целью данной работы являлось получение величин энтальпий гидратации оснований нуклеиновых кислот и их метил- и алкилпро-изводных, анализ полученных значений. Для этого потребовалось решить целый ряд задач.
Для получения энтальпий гидратации необходимо было экспериментально определить энтальпии сублимации и растворения кристаллов нуклеотидных оснований. Была разработана экспериментальная установка, в основу которой лег метод низкотемпературного кварцевого резонатора. Этот метод позволил с высокой точностью определить энтальпии сублимации (д.Нсу^) большого ряда легколетучих производных кристаллов нуклеотидных оснований.
Для определения &НС некоторых производных урацила использовалась масс-спектрометрическая методика, позволившая, кроме всего, контролировать состав сублимированного пучка.
Определенные трудности представляли калориметрические измерения энтальпий растворения (ДНШС) кристаллов оснований, которые из-за трудности синтеза имелись в очень ограниченном количестве и обладали низкой растворимостью в воде.
Для анализа полученных значений энтальпий гидратации (дНри ), определения влияния метилирования, вклада различных полярных и неполярных групп в общую энергию гидратации были расчитаны объемы исследуемых молекул и их воднодоступные молекулярные площади поверхности. Для этих целей были использованы различные подходы.
В результате проделанной работы на защиту выносятся следующие основные положения:
I. Создан прецизионный метод низкотемпературного кварцевого резонатора для измерения теплот сублимации органических кристал-
лов различной степени летучести.
Установлено, что взаимодействия молекул в кристаллах пу-риновых оснований превышают аналогичные взаимодействия в кристаллах пиримидиновых оснований, кроме цитозина, для которого характерно более сильное водородное связывание между молекулами в плоскости по сравнению с остальными видами взаимодействий.
Установлено, что энтальпии взаимодействия пиримидиновых молекул оснований с водой, в расчете на единицу площади, выше по сравнению с аденином. Полярные группы молекул пиримидиновых оснований гидратируются сильнее, чем у Jcle. Вклад специфических взаимодействий в суммарную энергию гидратации исследованных оснований составляет величину ~15-20%.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав и заключения. Рисунков 18 , таблиц 16, библиография 152 наименования.
Во введении показана актуальность работы, даны основные положения, выносимые на защиту.
Низкотемпературная калориметрия
Калориметрический метод является очень информативным при исследовании гидратации нуклеиновых кислот и их компонентов [20-23J, т.к. он позволяет непосредственно с большой точностью ( 0,15%) оценить количество связанной в растворе воды.
Большое развитие в последние годы получил метод низкотемпературной калориметрии при изучении гидратации биомолекул и их фрагментов [II,24-31J , в котором исследуется фазовый переход лед-вода в растворах ДНК.
Чатторай и Булл [ZQ] исследовали такой переход путем прямого измерения теплопоглощения в увлажненных препаратах различных солей ДНК при температурах -20С-0С. При охлаждении раствора ДНК гидратная вода оставалась "незамерзающей", не переходила в фазу льда. Авторы определяли количество "незамерзающей" воды на нуклео-тид в зависимости от концентрации одновалентных солей ДНК при тем пературе -6С: Li -ДНК-30,4; /\/д,-ДНК-24,1; Х-ДНК-22,1; Ж-ДНК-16,7; ,-ДНК-13,6. Авторы пытались исключить вклад гидратации противоионов экстраполяцией зависимости числа "невымороженной" воды в растворе ДНК от концентрации соли к нулевой концентрации противоиона. Правда, погрешность при этом была значительной.
Мревлишвили с соавторами [її,24-27, 29-31] для исследования термодинамических эффектов взаимодействия различных групп биомакромолекул с водой применяли очень чувствительный метод сканирующей низкотемпературной калориметрии.
При исследовании гидратации ДНК [26,Зі] снималась температурная зависимость теплоемкости (Ср) нативной и денатурированной ДНК при различной влажности. Авторы показали, что в системе натив-ная ДНК-НрО при малой концентрации воды ( 18%Нг 0) отсутствуют отклонение от линейной зависимости Ср ДНК и теплопоглощение в области фазового перехода лед-вода. Это свидетельствует о том,что вся вода жестко связана с молекулами ДНК. При дальнейшем повышении влажности наблюдается изменение теплоемкости и появляется пик теплопоглощения, связанный с определенным количеством воды, закристаллизовавшейся при охлаждении. Этот пик вначале сдвинут (на Z&fo) относительно температуры плавления чистой воды, а затем, при дальнейшем увеличении влажности, смещается к 273К. Температурный интервал растянутого перехода и характер кривой теплопоглощения зависят от конформации биополимера. Причиной вырождения такого фазового перехода первого рода, как указывают авторы, является взаимодействие молекул воды с ДНК и влияние ДНК на структуру растворителя.
Для денатурированных препаратов ДНК, находящихся в состоянии статистического клубка, кривая теплоемкости меняется слабо. Гидра тация денатурированной ДНК отличается от гидратации нативной (рис.1). По данным калориметрии на начальной стадии гидратации ( 0 до 20%) с молекулами ДНК связывается 7 молекул & 0 на пару оснований (одинаково для нативной и денатурированной). На втором этапе гидратации (H«0 20-40%) у нативной ДНК связывается на 9 молекул Нг 0 больше на пару оснований, а в денатурированной ДНК на 4 молекулы 0 больше, т.е. гидратация нативной ДНК больше, чем денатурированной. На третьем этапе происходит полное насыщение всех гидратационных центров (26 молекул 0 на пару оснований), причем гидратация денатурированных препаратов превышает гидратацию нативных образцов. Авторы отмечают, что вода в гидратных слоях (вторая и третья фракции связанной воды) образуя структуру,обладающую спиральной симметрией молекулы ДНК, может претерпевать структурные переходы как при температурах внутримолекулярного плавления двойной спирали, так и при более низких температурах [26].
Важным вопросом при исследовании различных вкладов в стабилизацию структуры ДНК является вопрос об оценке влияния А«Т и СгС -пар на состояние молекул растворителя (воды). Т нис и Херст [32] изучали влияние отдельных нуклеотидных пар на структуру воды по результатам измерения гидратации ДНК с различными нуклеотидным составом. Авторы показали, что звеличение содержания АТ-пар приводит к увеличению гидратации ДНК. Но это были лишь качественные оценки, не были получены точные значения абсолютных величин гидратации.
Квантовомеханические расчеты и метод атом-атомных потенциальных функций
При исследовании процесса гидратации биомолекул рассматриваются, как известно, так называемые слабые взаимодействия: электростатические, с образованием водородных связей и ван-дер-ваальсо-вые (индукционные, ориентационные, дисперсионные) [63,64] . Для получения более адекватной картины гидратации при квантово-механи-ческих расчетах энергию межмолекулярного взаимодействия разлагают по отдельным составляющим электронной энергии. Ее можно представить в виде суммы обменной энергии отталкивания EQgM, электростатической Еэс, дисперсионной Е п поляризационной Епод и энергии переноса заряда (делокализации)
Однако, при проведении квантовомеханичвских расчетов, как правило, учитываются не все слагаемые выражения (I). Например, Едис, представляющая межмолекулярную часть корреляционной энергии, не может
быть вычислена с помощью однодетерминантных волновых функций, используемых в методах самосогласованного поля ССП. Поляризационная энергия Еол может быть различной в зависимости от метода расчета и способа разделения энергии. Так, она может содержать в себе либо Е ис, либо Е , из нее можно вычесть индукционную энергию и т.д. Но, тем не менее, представление энергии в виде (I) дает возможность исследовать физическую природу межмолекулярного взаимодействия биомолекул с водой.
Пюльман [[59,69] показал, что основной вклад в энергию взаимодействия через водородные связи вносит электростатическая составляющая, поэтому при расчетах а initio сложных молекул, когда невозможны полные квантовомеханические вычисления, можно ограничиться вычислением этой составляющей. Исходя из этого приближения, Пюльман с соавторами разработали процедуру перекрывающихся мульти-полей (ОМТР) для вычисления электростатического взаимодействия между молекулами [70-72] . В этом методе используется многоцентровое мультипольное разложение электронной плотности каждой из взаимодействующих молекул. В соответствии с процедурой минимизации находится оптимальное расположение молекул воды вокруг лиган-да. Мультипольное разложение получается непосредственно из ССП ссЬ initio волновых функций отдельных молекул (пуриновых, пирими-диновых оснований и воды).
Для вычисления электростатического взаимодействия авторы использовали 2 варианта программы:
1. Моногидратная схема - молекула воды перемещалась в сетке, построенной вокруг биомолекулы (атом кислорода воды помещался в каждую точку сетки). Путем вращения вокруг трех локальных осей с центром на атоме кислорода находилось наиболее выгодное ее положение.
2. Полигидратная схема - в определенные по первой схеме места гидратации помещались молекулы воды. Затем изменялось геометрическое расположение пробной молекулы воды вокруг такой "супермолекулы" и, используя технику минимизации, определялась оптимальная энергия взаимодействия данной молекулы. Затем эта процедура повторялась с использованием первой оптимизированной молекулы воды до тех пор, пока общая энергия взаимодействия не изменялась значительно.
Авторы рассчитали, кроме предпочтительных мест посадки воды, энергии гидратации для отдельных оснований по полигидратной схеме [70, 72] : для системы аденин (А) + 4 Н20 энергия гидратации равна -18,4 ккал/моль; для тимина Т -н- 3 Н«0 - 11,4 ккал/моль, у гуанина бчьб-НрО получили две эквивалентных схемы гидратации с энергиями - 24,1 ккал/моль и -23,3 ккал/моль, для цитозина С -н-4 НоО получена энергия гидратации - 12,7 ккал/моль. "Наилучшая" полигидрационная схема для оснований соответствует следующему ряду: G(5H20)-24,I A(4H20)-I8,4 C(4H20)-I2,7 T(3H20)-II,4 т.е. энергия гидратации пуринов выше, чем у пиримидинов. Как показали эти расчеты, образование водородных связей происходит по полярным группам, энергия Н-связей для разных групп составляет от 6 до 13 ккал/моль. Энергетически наиболее выгодным являются расположение молекул НрО в плоскости оснований.
Калориметрические измерения энтальпий растворения
Вакуум в рабочем объеме был не хуже 1,5.10" тор. Для предотвращения дополнительного разогрева ионного источника между ним и испарителем помещался медный экран с отверстием 10 мм, охлаждаемый жидким азотом.
Энтальпия сублимации определялась по относительным измерениям при помощи температурных зависимостей.
При ионизации нейтральных частиц электронным ударом регистрируется ионный ток l23] : где fei - число нейтральных частиц в области ионизации, С - длина свободного пробега электронов, 2 - электронный ток, о - поперечное сечение ионизации, у светосила прибора. Учтя связь между tl L и г , исходя из молекулярно-кинетической теории, получим: где К - константа, содержащая в себе поперечное сечение ионизации и другие параметры, не зависит от температуры. Исходя из уравнения (4) получим:
Калибровка прибора проводилась по антрацену, т.к. его AHC S дНсуз близка к энтальпиям сублимаций исследуемых кристаллов нук-леотидных оснований. Для антрацена получена А Нсу « 101,5 1,7 кДж/моль в интервале температур 323-353 К, что хорошо согласуется с дНсуб« 101,1+0,9 кДж/моль для того же температурного интервала, приведенной в работе б4І» На рис.9 представлены типичные зависимости для некоторых метилпроизводних оснований. Относительная ошибка определения д Н g была не хуже 2,5%.
Данный метод масс-спектрометрического определения д Н , кроме таких достоинств, как высокая чувствительность, сравнительно небольшая погрешность эксперимента, малый расход вещества, относительно небольшое время эксперимента (4-5 часов), обладает и рядом существенных недостатков. Это, прежде всего, невозмож-нолсть определения молекулярных кристаллов с массой выше 200. Погрешность при определении дН б легколетучих веществ больше 2,5%, необходимо регулярно очищать источник ионов от осевшего на нем сублимированного вещества, иначе измерения ухудшаются, падает разрешение и чувствительность.
Поэтому большинство энтальпий сублимаций д Н g кристаллов нуклеотидных оснований и их метил- и алкилпроизводных были определены методом низкотемпературного кварцевого резонатора.
Как уже говорилось, для определения энтальпии гидратации молекулы необходимо знать еще одну термодинамическую величину - энтальпию растворения.
Как известно, энтальпия растворения (дНшс) - это изменение энтальпии в процессе переноса I моля вещества из его стандартного состояния (в нашем случае - кристалл) в бесконечно разбавленный раствор.
Это сдвоенный прибор с объемом сосудов Дьюара по 200 мл. Исследуемая система находится в одном из калориметрических блоков. В другом блоке, стандартном, помещают воду. Разность сигналов напряжения на опытном и стандартном блоках дает дифференциальный сигнал, который записывается. Сдвоенная ячейка позволяет добиться стабильности результатов в течение длительного времени.
Предварительно работа откалиброванного по току калориметра проверялась по теплотам растворения хлорида калия в воде С&НШС» »17,51 кДжДкШ) при 298 К и соотношении молей КСб и воды 1:200). Отклонение данных от литературных не превышало 1-1,5$.
Ввод вещества в калориметрический сосуд осуществляли с помощью специального шприца, предназначенного для введения как твердых, так и жидких образцов. Использовались навески в 70-100 мг в растворе различного состава. Измерения производились с 2-3 навесками для растворов одного и того же состава, расхождения не превышали 1,5%. Вариации в величине навески не отражались на значениях дН___. Измерения проводили при температуре 295 К. рас
Энтальпии растворения всех остальных производных нуклеотид-ных оснований были измерены на калориметре, разработанном в лаборатории калориметрии института Физической химии ПАН. Принципиальная схема микрокалориметра представлена на рис. 10.
Метил и алкилпроизводные тимина и урацила
Сравним нормализованные по воднодоступной площади поверхности группы СНд инкрименты взаимодействия пиримидинов (#t&,7At/,) И JWe.
Значение инкримента для молекул Шь., T/w, и m Wax. с CHq-rpyn-пой по л/(1) и //(3) равно: 5дНвз(СН3): д$в(СНд)= 0,62 кДж/моль1 А . Полученная величина значительно ниже по сравнению с аналогичной для л/-метиладенинов. Это означает, что вклад в энергию взаимодействия полярных групп л/-Н молекул ЇЇШ, и T/w, с водой заметно выше дНвз по этим же группам, чем в сдав.
Кроме того, полная энтальпия взаимодействия на единицу водно-доступной молекулярной площади дНвз:-$з для чі (1,79 кДж/моль A"2), 2Zftb(I,58 кДж/моль_1А 2) и тимина (1,54 кДж/моль_1А"2) более чем на 10$ превышает соответствующую величину для Jtde (1.407 кДж/ т моль А ). Это означает, что дикетопиримидиновое кольцо гидрати руется сильнее, чем 6-аминопуриновое.
Вклад специфических взаимодействий по карбонильным группам для ряда т 71гои изменяется аналогично вкладу для соответствующего ряда Jide, .
На основании проведенных расчетов можно сделать вывод о том, что вклад специфических взаимодействий в общую энергию гидратации как пуриновых, так и пиримидиновых оснований невелик и составляет приблизительно 15-20% от общей энергии.
Представляет интерес сравнение энтальпий взаимодействия с водой дНвз, полученные нами, с результатами теоретических вычислений, выполненных в модели крупного кластера воды.
В работе [77J авторы рассмотрели кластер, состоящий из 40-50 молекул воды вокруг канонических оснований при Т=300 К. Они расчитали энергии взаимодействия оснований с такими гидратными оболочками. Все полученные в работе значения энергий взаимодействия в системе основание-вода оказались положительными величинами. Так, длященина дЕа+54,4 кДж/моль , для урадила дЕ=+8,4 кДж/моль . Необходимо отметить, что выбранное авторами число молекул воды соответствует первому гидратному слою вокруг основания и, поэтому, не точно описывает реальное гидратное окружение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что такая система является энергетически неустойчивой или же используемые авторами атом-атомные потенциальные функции подобраны не совсем правильно.
В противоположность результатам работы [77] , в последних работах Данилова с соавторами [106,107,152] получены расчетные данные, хорошо согласующиеся с результатами настоящей работы. Авторы провели расчеты гидратации молекул 2/хл и Tku, с помощью модифицированного метода Монте-Карло в кластере из 200 молекул воды при температуре 298 К. В отличие от результатов работы [77]авторы получили правильный знак энергии взаимодействия такой системы. Кроме того, наблюдается не только качественное, но и неплохое количественное согласие их расчетных данных с результатами, полученными в настоящей работе. Действительно, для урацила и тимина рас-читанная энергия взаимодействия основания с водой Еач) соответственно равна -226.1 кДж/моль для 2(га и -236,6 кДж/моль для Тки, а в данной работе получены значения -180,3 кДж/моль и -201.9 кДж/моль"1 соответственно. Отсюда можно заключить, что система из 200 молекул воды адекватно отражает реально существующее гидратациойное равновесие молекул оснований в водном растворе. Кроме того, используемые авторами fl06,I07,I52J полуэмпирические атом-атомные потенциальные функции правильно описывают межмолекулярные взаимодействия в исследуемых системах.
Следует отметить, что наблюдаемое согласие теоретических расчетов гидратации оснований в кластере из 200 молекул воды с результатами настоящей работы свидетельствует в пользу сделанного выше заключения о незначительном вкладе специфических взаимодействий молекул воды с молекулами оснований в суммарную энергию гидратации.
Целью настоящей работы являлось получение значений энтальпий гидратации оснований нуклеиновых кислот, их метил- и алкилпроиз-водных с целью выявления гидратационных особенностей данных объектов в связи с проблемой гидратации ДНК. Для определения этих величин были измерены энтальпии сублимации этих соединений и их энтальпии растворения.
Определение энтальпий сублимации легколетучих метил- и алкил-производных нуклеотидных оснований потребовало создания высокочувствительного экспериментального метода низкотемпературного кварцевого резонатора, пригодного для измерения энтальпий сублимации веществ различной летучести.
С помощью методов микрокалориметрии определены энтальпии растворения исследуемых соединений, большинство из которых имеют очень низкую растворимость в воде.
Анализ значений энтальпий сублимации кристаллов нуклеотидных оснований и их производных позволил качественно оценить вклад специфических взаимодействий молекул в кристалле по сравнению с другими видами взаимодействий, показано влияние алкилирования на энергию решетки кристаллов в зависимости от места алкилирования. Дальнейший анализ величин энтальпий гидратации оснований и их производных показал влияние алкилирования на энергетику гидрата-ционного взаимодействия молекул оснований.