Введение к работе
'
Актуальность проблемы. Исследование динамического поведения белков а водных растворах является актуальной проблемой современной биофизики. Задача при этом распадается па два самостоятельных раздела: исследование локального движения внутри глобулы и поведение макромолекулы как целого. Первая задача имеет огромное значение для понимания функционирования белка. Как показали недавние исследования, знание статической структуры биополимеров является необходимым, но недостаточным условием раскрытия тайны жизни белка. Поэтому в последние годы многие исследователи направили свое внимание па анализ внутренней подвижности макромолекул. Что же касается второй задачи, то актуальны не только ее биологические аспекты, такие как узнавание взаимодействующих молекул субстрата и белка, удержание субстрата белком и т. Д. , но и проблемы физики жидкости, такие как электростатические взаимодействия макромолекул в растворе, поляризация и релаксация.
Вопросу получения информации о структурных и динамических характеристиках белка и растворе с помощью диэлектрической спектроскопии было посвящено немало работ. Связано это с наличием уникальной природной метки в белках - большим дипольным моментом. Удивительное сочетание достаточной жесткости структуры глобулы и некоторой подвижности ее составных частей, также обладающих дипольным моментом, позволяют наблюдать за поведением как целой макромолекулы, так и ее внутренних структур. Однако интерпретации результатов в этих работах различаются, не совсем ясна природа некоторых релаксационных процессов. Имеется большое поле деятельности по анализу структуры и динамики белка при различных условиях среды, таких как температура, рН, наличие де натура нто в, и т. д.
Среди многочисленных современных физических методов, использующихся для физико-химического анализа вещества метод диэлектрической спектроскопии (ДС) занимает особое место. Связано это с необычайно широким диапазоном частот, перекрываемых этим методом. Однако, несмотря на большую историю своего развития, 'лот метод до недавнего времени не находил широкого распространения для всесторонних исследований. Дело в том, что используемые ранее методы в частотної"! области обладали рядом неудобств и даже
ограничений, не позволявших тщательно исследовать обЬскты, подверженные изменениям во времени (например биологические объекты). Успехи последних лет в развитии метода временной диэлектрической спектроскопии (ВДС) позволили преодолеть многие трудности и коренным образом изменили отношение к ДС, превратив ее в эффективный метод исследования вещества на макроскопическом и микроскопическом уровне.
Данная работа вносит свой вклад п развитие метода ВДС в виде новых методических подходов и в исследование механизмов поляризации и релаксации водных растворов белка, отражающих структурные и динамические свойства протеинов.
Целью работы является анализ механизмов поляризации и
релаксации водных растворов белка; нахождение связи параметров
релаксационных процессов с характеристиками молекулярных
движений; изучение межбелкопых электростатических
взаимодействии; исследование температурно- и рН-индуцнроваиных конформацнонных переходов в глобулярных белках; разработка новых методических подходов в ВДС-экспсримснтс.
Научная новизна. В настоящей работе получены новые результаты о процессе релаксации дииольной поляризации водных растворов миоглобипа в. диапазоне частот от 500 кГц до 2 Ггц, широком диапазоне концентраций от 0.6% до 53% и температурном интервале от 5 до 35С. Проведен анализ функций дииольной корреляции в рамках безмодельного подхода, получены параметры релаксационных процессов и найдена их связь с характеристиками молекулярного движения белка в растворе. Проанализирована предложенная ранее для анализа данных по ЯМР релаксации модель электростатических взаимодействии и связь ее с трансляционным движением макромолекул. Получены параметры температурно- и рН-индуциропанпых конформацнонных переходов и глобулярных белках (лнзоцим и рибонуклеаза А). Развиты новые методические подходы в ВДС-экспернмснтс.
Практическая применимость.
Полученная информация о диэлектрических свойствах растворов белков может быть полезна как для развития теории жсткости, так и для анализа внутренней структуры и динамики белка, что в перспективе ведет к пониманию функционирования белка.
Знание о характере проявления электростатических
взаимодействий макромолекул поможет грамотно выбрать условия
'1
проведения эксперимента (например, при исследовании внугреннси динамики белка) к избежать ошибок в интерпретации результатов.
Адекватный анализ корреляционной функции вращения белка как целого весьма важен при обработке данных Я MP релаксации высокого разрешения.
Представленные и работе новые методические подходы и ВДС-эксперименте внедрены в ряде научно-исследовательских институтов и вузов: Ин-т Химической Физики АН, химический факультет МГУ, НПО Союзнефтеотдача (Уфа), КГУ, Башкирский гос. университет, ЮСТИ, НПО "Позитрон"(С Петербург), где работают установки, созданные в лаборатории Молекулярной Биофизики.
Апробация работы. Результаты работы докладывались и
обсуждались на 1 Всесоюзной конференции "Химия и применение
неводных растворов" (Иваново, 1986), на конференции "Физико-
химические методы исследования в области химии, физики, биологии,
медицины и народном хозяйстве" (Казань, 1987), на VI, VII
Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров" (Харьков,
1988), на VI Всесоюзной конференции "Физика диэлектриков" (Томск,
1988), на Всесоюзной конференции "Нуклеазы микроорганизмои и их
практическое использование" (Рига, 1989), на IX Международном
конгрессе по молекулярной спектроскопии (Дрезден, ГДР, 1989), на
Всесоюзном совещании "Метрологическое обеспечение
диэлектрических измерений" (Иркутск, 1991), на Гордоиовской научной конференции "Диэлектрические явления" (Ныо-Хампшир, США, 1992), на ежегодной конференции Диэлектрического общества (Англия, 1993, 1994), на Российской научно-технической конференции "Диэлекгрики-93" (С.Петербург, 1993), на 11 Международном Биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993), на Международной конференции Ампера (Казань, 1994), на Всероссийском совещании "Физико-химические методы исследования структуры и динамики молекулярных систем", (Йошкар-Ола, 1994, 1995), на Международной конференции "Диэлектрические и связанные явления" (Закопане, Польша, 1994), на Международном симпозиуме "Молекулярная подвижность и порядок в полимерных системах" (С. Петербург, 1994), па ежегодной Международной конференции Биофизического общества (Сан-Франциско, США, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опублпковамо 9 статен и 23 тезиса докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы (171 наименование). Содержание работы изложено на 171 странице, включая 46 рисунков и J таблицы.