Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ современных методик микроскопического анализа биоматериалов 13
1.1. Исследуемые объекты 13
1.2. Сравнение характеристик цитологических анализаторов 16
1.3. Современное состояние отрасли 28
Глава 2. Разработка системы распознавания клеток крови 30
2.1. Постановка задачи 30
2.2. Требования к алгоритму обнаружения 31
2.3. Исследование и выбор критериев для обнаружения
2.3.1. Основные принципы, положенные в основу алгоритма обнаружения 33
2.3.2. Характерискики, используемые при обнаружении ядер 34
2.3.3. Гистограмма яркости поля зрения исследумого препарата 35
2.3.4. Выбор цветовых характеристик, используемых при обнаружении ядер лейкоцитов 36
2.3.5. Возникающие проблемы и пути решения 38
2.4. Алгоритм обнаружения и классификации клеток 41
2.4.1. Модель цветовых характеристик односвязного объекта 43
2.4.2. Модель цветовых характеристик группы однородных объектов 44
2.4.3. Общая схема алгоритма обнаружения лейкоцитов 46
2.4.4. Алгоритм обнаружения, основанный на гистограмме яркости 48
2.4.5. Алгоритм обнаружения первичных объектов 51
2.4.6. Алгоритм обнаружения вторичных объектов 53
2.4.7. Примеры обнаружения ядер, артефактов и эритроцитов на плоскости относительных цветов 58 Стр.
2.4.8. Автоматическая сегментация границ клеток крови 60
2.4.9. Распознавание клеток 77
2.5. Алгоритм автоматической фокусировки
2.5.1. Критерии оценки фокуса 78
2.5.2. Фокусировка при скрининге мазка крови 79
2.5.3. Общая характеристика методов оценки качества фокуса 81
2.5.4. Спектральная оценка фокуса 82
2.5.5. Алгоритм оценки фокуса, основанный на исследовании перепадов гистограммы яркости 83
2.5.6. Значимость изменения оценки фокуса 84
2.5.7. Алгоритмы оценки фокуса полного кадра 85
2.5.8. Алгоритмы оценки фокуса изображения лейкоцита 88
Глава 3. Разработка оптимальной сканирующей системы 101
3.1. Уровень техники. Аналоги 101
3.2 Область исследований при определении оптимальной конструкции СКАМ 106
3.3. Аналитический критерий качества СКАМ 109
3.3.1. Зависимость увеличения и площади препарата от характеристик адаптера камеры 111
3.3.2. Условия сканирования без потери разрешения цифрового изображения 113
3.3.3. Скорость перемещения препарата, соответствующая максимальной скорости передачи цифрового изображения 113
3.3.4. Допустимое время экспозиции при съемке на максимальной скорости передачи цифрового изображения 114
3.3.5. Допустимые скорости перемещения препарата при заданном времени экспозиции 114 Стр.
3.3.6. Увеличение в адаптере, максимизирующее скорость сканирования 115
3.3.7. Зависимость времени сканирования от параметров объективов, адаптеров и камер 116
3.3.8. Скорость сканирования при оптимальном времени экспозиции 116
3.3.9. Скорость сканирования при заданном времени экспозиции 117
3.3.10. Сканирование с заданной выдержкой при неравномерном перемещении препарата 118
3.4. Зависимость фокусной поверхности от глубины фокуса и плоскостных характеристик препарата и оборудования 118
3.4.1. Выбор размеров области сканирования и кусочно-линейная аппроксимация поверхности оптимального фокуса с использованиемзначений глубины фокуса и плоскостных характеристик оборудования 121
3.4.2. Измерение фокусной поверхности в опорных точках с помощью дополнительного объектива 122
3.5. Применение теоретических исследований конструкции СКАМ 123
Глава 4. Результаты исследований 127
4.1. Методика испытаний комплекса автоматизированной микроскопии 127
4.1.1. Испытания системы съемки 128
4.1.2. Испытания системы навигации 129
4.1.3. Испытания системы сбора выборки 130
4.1.4. Испытания системы классификации лейкоцитов 132
4.1.5. Испытания системы контроля качества препарата 133
4.1.6. Испытания системы измерения 134
4.1.7. Испытания системы диагностики 135
4.1.8. Испытания системы информатизации 135 Стр.
4.2. Результаты экспериментов с программами сегментации изображений клеток крови 136
4.2.1. Материалы и методы исследования 136
4.2.1. Результаты исследований 137
4.3. Теоретические оценки скоростей сканирования СКАМ 141
Выводы и заключение 158
Список литературы
- Сравнение характеристик цитологических анализаторов
- Основные принципы, положенные в основу алгоритма обнаружения
- Условия сканирования без потери разрешения цифрового изображения
- Испытания системы контроля качества препарата
Сравнение характеристик цитологических анализаторов
Производители ИКАМ снабжают их программным обеспечением общего назначения для выполнения таких функций, как сканирование заданных траекторий, возврат в заданные точки, визуализация траектории просмотра, фиксация изображения поля зрения в базе данных, автофокусировка, удаленное управление микроскопом. ИКАМ комплектуются либо на базе обычных ручных микроскопов с заменой штатного предметного стола на моторизованный и с добавлением узлов моторизованной фокусировки, смены объективов, фильтров и блока управления [12, 13, 14, 15], либо ИКАМ разрабатывается как отдельный полностью интегрированный тип микроскопа [8, 9, 10, 11]. Первый путь позволяет выпускать широкую линейку ИКАМ на базе ручных микроскопов разных типов.
Основное назначение ИКАМ - автоматизация рутинных повторяющихся операций микроскопии. Примером является виртуальная микроскопия, когда формируется и сохраняется сплошное расширенное сфокусированное изображение препарата, состоящее из множетсва соседних полей зрения. ИКАМ могут автоматизировать операции по выбору условий наблюдения, но сохраняют за врачом ответственность за сбор выборки объектов анализа. Таким образом, ИКАМ относятся к информационному уровню автоматизации микроскопии. В перспективе ИКАМ способны в ближайшие 5-10 лет вытеснить ручные микроскопы.
Последний класс образуют КАМ, позволяющие снять с лаборанта ответственность за сбор выборки объектов и за выбор условий их наблюдения. Такие системы микроскопии называются автономными (АКАМ), offline microscopy. АКАМ могут решать все основные задачи медицинской микроскопии: съемка препарата, сбор выборки объектов анализа, сортировка и/или измерение популяции, информатизация. Наибольшие отличия АКАМ от ранее рассмотренных систем микроскопии состоят в самостоятельном решении задачи сбора представительной выборки объектов препарата. АКАМ автоматически перемещает препарат и фокусируется, выбирает траекторию просмотра в зависимости от распределения биоматериала, контролирует качество освещения и окраски, обнаруживает и записывает в базу данных изображения объектов заданных типов. Выполняется измерение и анализ автоматически собранной выборки объектов. Кроме автоматизированного микроскопа и системы анализа изображений в состав АКАМ входит система управления моторизованным оборудованием. АКАМ зависит от уровня стандартизации подготовки биоматериала. Поэтому система подготовки препарата является либо его частью, либо АКАМ имеет средства контроля качества препарата. Таким образом, АКАМ создает все 3 уровня автоматизации микроскопии (информатизация, анализ отдельных изображений, автоматизация микроскопа).
Главное назначение АКАМ - анализ препаратов с невысокой и низкой концентрацией анализируемых объектов, когда поиск и обнаружение выборки объектов для анализа является наиболее трудоемкой операцией. Обслуживание АКАМ может осуществляться младшим медицинским персоналом. При этом врач-лаборант рассматривает отобранные галереи объектов на экране компьютера, что значительно повышает информативность и качество анализа, а также повышает производительность труда. Концентрированность и наглядность информации, защита данных, система подсказок, контроль качества, ретроспективный анализ дополнительно уменьшают вероятность диагностических ошибок. Появляется реальная возможность массового применения углубленных количественных анализов, увеличивается диагностическая значимость анализа.
В настоящее время на рынке гемоанализаторов наиболее широко представлены автоматические проточные системы, основанные на измерениях электромагнитных свойств отдельных клеток [16], и ручные микроскопы для визуальных исследований мазков крови. Доля последних постепенно снижается, уступая часть рынка комплексам автоматизированной микроскопии (КАМ), выполняющим функции автоматического гемоанализатора с диалоговой поддержкой визуальных и количественных анализов. К методикам ручной микроскопии относятся такие, в которых не применяются компьютерные информационные средства, отсутствуют функции автоматического сбора и количественного анализа выборки объектов.
Морфологические свойства клеток, в соответствии с современными представлениями, имеют весьма значительную диагностическую значимость, идентифицируя функциональные типы клеток [16, 17]. Морфологические свойства выявляются при применении разнообразных методик приготовления препарата. Морфология клеток при постановке задачи цитоанализа представлена основанными на визуальной микроскопии качественными понятиями, такими как округлость, зернистость, гомогенность и т.п. Почти полное отсутствие в справочниках по медицинской цитологии количественных характеристик морфологии (за исключением простейших оценок площади или диаметра) связано со сложностью пространственной структуры клеток и с отсутствием до последнего времени приемлемых по трудоемкости и точности средств количественного анализа. В существующих руководствах [18, 17] до сих пор отсутствуют диапазоны норм для морфологических характеристик эритроцитов. Качественные описания морфологии клеток принципиально не позволяют провести между морфологическими типами клеток четких границ, поэтому наличие или отсутствие промежуточных форм, их доля, соответствие функции, остаются открытыми вопросами. Количество фактически различаемых морфологических типов ограничено возможностями зрительного анализатора среднестатистического врача. Высокая вариабельность представительности известных визуальных типов клеток в исследуемых препаратах приводит к широким диапазонам нормы, что ограничивает диагностическую значимость анализа. Вместе с тем эта вариабельность вызвана не только естественной биологической изменчивостью, но и вынужденной расплывчатостью определений и связанной с этим ограниченностью состава различаемых морфологических типов. Для увеличения состава различаемых типов функций клеток во все возрастающей степени применяются неморфологические признаки (цитохимические, иммуноцитохимические и другие типы меток). Наибольшей диагностической значимостью (по крайней мере, потенциально) обладают методики, позволяющие определять как морфологические, так и неморфологические признаки одной и той же клетки. Реализация таких комплексных методик вызывает значительные технические трудности. В настоящее время число таких методик невелико, но, по-видимому, будет нарастать по мере развития лабораторной техники.
Основные принципы, положенные в основу алгоритма обнаружения
В режиме поиска атипичных клеток крови ставится задача обнаружения редких единичных объектов на большой площади препарата, требуемая вероятность обнаружения этих объектов достигает = 0,99-0,999. Это происходит из-за того, что благодаря специфике распределения и ограниченности объема выборки клеток в мазке крови обнаружение происходит не в оптимальной зоне действия модели Пуассона для редких событий. Действительно, при доле атипичных клеток р 1 вероятность того, что из п клеток, попавших в зону поиска, к атипичных, равна плотности атипичные клетки в процессе приготовления мазка вымываются на его края. В типичном случае нам задан объем выборки на краях пк , например, 100-400; вероятность рк может быть равной, например, 0,01; получаем, что мы в принципе не можем получить значение Р0 = 0,05, оно будет больше даже при а=1. Увеличивая выборку за счет клеток в центре мазка, где рц может быть, например, 0.001, мы при крайне низкой эффективности поиска все равно не сможем набрать необходимый объем выборки (их в мазке не более 2-4 тысяч), обеспечивающий Р0 = 0,05 при а 1. Возможный выход - использовать несколько мазков. Точное количество неизвестно, поскольку неизвестно р, кроме того, это существенно усложняет процедуру анализа. Поэтому приходится ставить технически сложную задачу максимизации а при ограниченном значении п, при этом уменьшение Ро (то есть наиболее опасной доли ложноотрицательных анализов) будет медленным, и оно не достигнет желаемого значения 0,05. Оправдание затрат на увеличение а связано со статистикой патологий онкогематологии.
В режиме массового анализа (подсчет лейкоцитарной формулы), с максимальными требованиями к времени анализа ставится задача сбора выборки минимально допустимого объема N на минимально допустимой площади препарата. Поскольку площадка сбора выборки определяется случайно, при определении допустимой вероятности пропуска можно не учитывать случайные пропуски, зависящие от положения объектов в площади поля зрения (пропуски обрезанных клеток на краях), что значительно упрощает и ускоряет анализ поля зрения. Вероятность пропуска при этом практически совпадает с систематической ошибкой алгоритма обнаружения и может определяться в соответствии с моделью Пуассона, то есть ненадежность обнаружения может быть компенсирована за счет относительно небольшого увеличения объема выборки. Удовлетворительным можно считать значение а=0,95. Вероятность ложных тревог определяется комфортабельными условиями контроля качества врачом автоматической сортировки: Рлтр 0,2.
На практике при обнаружении лейкоцитов можно столкнуться с основным и типичным для медицинских приложений компьютерного зрения препятствием - большой вариабельностью изображений. Несмотря на подробное описание стандартной окраски мазка, сформулировать количественные критерии нелегко.
Первичными данными являются значения B,G,R полученные в каждом пикселе из связного множества N пикселей, составляющих объект. По этим 3N числам и уровню фона G0 вычисляются новые 3N чисел: относительные цвета fR=R/(B+G+R), fB=B/(B+G+R) и оптическая плотность пикселя ODG =ln(Go/G). Простейший способ упрощенного представления таких данных -переход к статистикам первого и второго порядка: вычисление средних, вариаций (дисперсий) и ковариаций. Даже в этом случае число соответствующих параметров достаточно велико (3+6=9). Дальнейшее упрощение состоит в раздельном описании яркостной и цветовой характеристик. Яркостная характеристика задается гистограммой зеленой компоненты, а цветовая характеристика через эллипс рассеяния цветов. Гистограмму яркости объекта можно заменить одним числом - средней оптической плотностью. Таким образом, каждый объект характеризуется своей средней оптической плотностью и эллипсом рассеяния цветов на плоскости (fR,fB). Эллипс рассеяния определяется 5 параметрами: двумя средними значениями E(fR), E(fB), двумя дисперсиями и одной ковариацией - Var(fR), Var(fB), Cov(fR,fB). На основании этих 5 чисел следует принять решение о том, имеет ли данный объект цвета, характерные для ядра лейкоцита. Сравнительно устойчивыми характеристиками являются только средние значения. Параметры разброса могут меняться в десятки раз. Внутри одного препарата размеры эллипса рассеяния меняются в зависимости от качества фокуса кадра. Для размытого из-за плохого фокуса изображения размер эллипса цветов существенно уменьшается, а центр эллипса сдвигается в более зеленую область. Между препаратами может иметься огромное различие в степени неоднородности цвета (в десятки раз), поэтому ни о каких предписанных пороговых значениях для параметров разброса говорить нельзя.
Условия сканирования без потери разрешения цифрового изображения
Существует большое количество методов автоматической сегментации объектов различной природы, выбор которых определяется спецификой конкретной задачи. Для контрастных окрасок (Papanicolaou, Фельген) обычно применяются хорошо отработанные методы пороговой обработки в сочетании с морфологическими операциями эрозии и дилатации [32, 33, 34].
В более сложных случаях, например, при исследовании характеристик ядер и цитоплазмы клеток белой крови, даже в случае отдельно лежащих клеток практически при окрасках любых типов некоторые объекты имеют слабоконтрастные границы и значительные пересечения распределений оптических плотностей различных объектов (цветностей в случае цветных изображений). В этих наиболее информативных случаях эффективность указанных методов невысока [35]. В ряде работ границы таких объектов определяют с помощью общих методов сегментации, выделяющих пространственные неоднородности оптической плотности (watershed, watermar, wavelet и др.).
Эксперименты показывают, что эффективность этих методов для рассматриваемой весьма сложной задачи сегментации также недостаточна. В целом в настоящее время отсутствует математический аппарат, который позволял бы достаточно надежно определять границы (сегментировать) слабоконтрастные структуры.
Для подобных задач необходимо применять алгоритмы, использующие кроме общих характеристик распределения оптических плотностей геометрические и другие специфические свойства сегментируемых объектов. Эффективность таких методов в решающей степени зависит от адекватности используемой модели объекта, заложенной в методе сегментации.
Для выделения границ эритроцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов используется известный метод адаптивной пороговой сегментации [36]. Для сегментации клеток крови при окраске по Романовскому используется комбинация ряда известных алгоритмов предобработки (фильтрации), разбиения изображения на первичные зерна, выращивания объектов путем склейки первичных зерен.
Непосредственное применение известных методов разбиения на первичные зерна часто приводит к гиперсегментации, то есть первичные зерна слишком многочисленны и/или не соответствуют границам объекта. Современные видеокамеры позволяют получать изображения высокого качества с низким уровнем шума, поэтому причины гиперсегментации связаны не с шумом, а с наличием весьма неоднородной текстуры в площади клетки, особенно в площади цитоплазмы. Контур цитоплазмы бывает тонким, рядом с точками контура может находиться значительное число точек внутренней части цитоплазмы или фона со значительным отличием в цветности (оптической плотности). Поэтому обычные методы фильтрации, основанные на усреднении или выборочной медиане, могут весьма значительно искажать положение границы цитоплазмы. Поэтому в качестве предобработки изображения для уменьшения влияния текстуры на качество сегментации и выделения границ объекта нами применяется нелинейная фильтрация. Идея метода прменяемой нелинейной диффузной фильтрации, также как и группы ряда других методов нелинейной фильтрации, состоит в том, что сглаживание обратно пропорционально градиенту характеристики (н-р, оптической плотности) точек изображения объекта. Поэтому области со значительными изменениями оптической плотности, характериные для контуров объектов, деформируются меньше, чем внутренние области объекта. В отличие от линейной диффузионной фильтрации (эквивалентной гауссовой свертке) границы остаются хорошо локализованными и даже могут быть усилены. Уравнение диффузии ди(х, уЛ) , , „, _ ч = ащ С(х, у, t)\u(x у, п) (2.14) где t является параметром (шагом) шкалы, u(x,y,t) - шкало-пространственный образ исходного изображения f(x,y) и C(x,y,t)- коэффициент диффузии. Пусть Q= (0,Ьі)х(0,Ьг) - 2-мерная область образа, содержащая f(x,y) как ограниченную проекцию из Q в вещественный вектор Rm с т=3 в случае цветного образа. Тогда фильтр образует фильтрованный образ u(x,y,t) функции f(x,y) как решение (13), для которого исходный образ f(x,y) является начальным состоянием и(х,у,0) и для которого граничные условия предполагаются на границе образа (Эпи=0 на дСЇ). Как показывают эксперименты, выбор нелинейного коэффициента диффузии C(x,y,t) = G(\ V(uCT)2), обеспечивает положительные результаты фильтрации. Также предлагается более сложный вариант коэффициента диффузии с параметром регуляризации, зависящим от гистограммы образа. Диффузная фильтрация весьма затратна в вычислительном отношении, поэтому практически используется упрощенный модифицированный вариант диффузной фильтрации, пример результата применения которого представлен на Рисунке 2.10.
Для определения тонких контуров существуют еще более затратные методы, основанные на восстановлении контура путем рассмотрения многих линий окна [37, 38]. Ввиду ограничений на допустимое время микроскопического анализа в обычной лаборатории применение подобных методов проблематично.
Преобразование watershed, применяемое для формирования первичных зерен, относится к области математической морфологии и может быть классифицировано как region-based segmentation метод. Идея метода водораздела состоит в том, что исходное полутоновое изображение можно рассматривать как ландшафт местности, на которой высота каждой точки над уровнем моря равна значению ее яркости. Результатом выполнения алгоритма являются разделенные линиями ячейки изображения, границы которых соответствуют хребтам яркости. Алгоритмическое определение метода может быть следующим.
Пусть f-.D N есть цифровой черно-белый образ, с hmm и hmax -минимальным и максимальным значением f. Определим рекурсию с уровнем серого h увеличивающегося от Ivn до hmax, в которой бассейны, связанные с минимумом f последовательно расширяются. Пусть Xh обозначает объединение набора бассейнов, вычисленных на уровне h. Связанный компонент набора порогов Th+1 на уровне h + 1 Tbl ={рєD\ f(p) h+\} может быть как новым минимумом, так и расширением бассейна в Xh: в последнем случае вычисляется зона влияния Xh в Th+1, обновляя Xh+1. Пусть MINh обозначает объединение всех региональных минимумов на высоте h. Определим геодезическое расстояние (1д(х,у) между пикселами х и у в наборе А: СІА(Х,У)=ІПІ"{ЦР), Р - путь между х и у, полностью включенный в А}. Предположим, что А содержит набор В, созданный из нескольких связанных компонентов Bi, i=l,2,...,k. Геодезическая зона влияния izA(Bi) связанного компонента Bi из В есть izA(Bj) = {рє AY/є [\,к]/{і},dA(p, Bt) dA(p,Bj)}. к Объединение геодезических зон влияния есть IZAB) = \ \izAB).
Испытания системы контроля качества препарата
Для лейкоцита с хорошим качеством фокуса типичная кривая зависимости MeanG(x) для х=0,...8 приведена на Рисунке 2.24 (средние значения изображены кружками, с ср. кв. отклонения в виде отрезков). Для хорошо фокусированного кадра ширина зоны переходного слоя оказывается небольшой: 2 пикселя или 0,7 мкм (Рисунок 2.16). Вертикальная черта, определяющая границу переходной зоны, соответствует номеру того слоя (х=2), для которого производная от величины яркости статистически незначимо отличается от нуля. Напомним, что средние значения яркости (кружки) и среднеквадратичные отклонения (отрезки) сосчитаны внутри слоев, удаленных на заданное расстояние х от границы ядра. Рисунок 2.25. Зависимость среднего MeanG(x) и среднеквадратичного SigmG(x) значений яркости от номера циркулярного слоя х на границе ядра и цитоплазмы. Случай плохо фокусированного изображения лейкоцита
На Рисунке 2.25 показано типичное поведение кривой яркости для изображения плохо фокусированной клетки. Переход от области ядра к области цитоплазмы размыт и занимает 5 пикселей (1,7 мкм), то есть увеличился более чем в два раза.
По-видимому, бессмысленно пытаться аппроксимировать кривые MeanG(x) какой-либо функциональной формой. Практически нужно знать всего одно число - параметр масштаба этих кривых, имеющий смысл ширины. Можно предложить, как минимум три варианта: 1. Построить горизонтальную асимптоту G=G(x=infmity) и найти полуширину кривой хуг из равенства G(xi/2)=G(x=infmity)/2. При этом следует считаться с тем, что ситуация не всегда так проста, как на Рисунках 2.24, 2.25: горизонтальной асимптоты может не существовать. 2. Искать первый слой, для которого производная dG/dX=dMeanG(x0 )/dx статистически незначимо отличается от нуля. На Рисунках 2.16, 2.17 это значение х0 отмечено вертикальной чертой. Этот вариант имеет те же ограничения что и №1. 3. Возможно, наилучший на первый взгляд способ состоял бы в том, чтобы аппроксимировать яркость внутри каждого слоя гауссовским распределением, сложить соответствующие распределения и искать точку минимума, разделяющую распределения внутри ядра и в окружающем слое f(G)=min (см. Рисунок 2.16). Данные значения G указаны на Рисунках 2.16, 2.17 горизонтальными чертами (G=99, G=94) . Введенная таким образом ширина кривой хь есть корень уравнения MeanG(xi)=G. К сожалению, по непонятным причинам величина Xi оказывается существенно менее чувствительной к ухудшению фокуса, чем х0.
Предварительные эксперименты показывают, что из всех трех предложенных величин хуг, х0, X! наилучшей чувствительностью к выявлению потери фокуса обладает величина х0. На Рисунке 2.26 изображены соответствующие значения производной, сосчитанные для кривой рис.2.24.
Вариант №3 анализа кривой MeanG(x) изображенной иллюстрируется на Рисунке.2.25. На нем показано наложение распределений яркости для ядра и отдельных, циркулярных слоев с использованием для каждого слоя гауссовской аппроксимации. Значение величины G, соответствующее переходу между яркостью характерной для ядра и цитоплазмы, показано стрелкой. Тогда в качестве ширины кривой MeanG(x) можно принять корень уравнения MeanG(x!)=G. Необычным событием здесь является присутствие не одного, а двух пиков относящихся к цитоплазме. По-видимому, более темный пик (среднее = 120) соответствует размытой переходной области на самой границе ядра.
В итоге результат анализа зависит от правильности выделения границы ядра, и, что самое существенное: оценка ширины переходной зоны требует изучения кривой MeanG(x) для достаточно больших значений х (2 х 6). При этом поиск корня уравнения MeanG(x)=C в области, где производная dMeanG(x)/dx мала невозможен.
Оценка выраженности пика соответствующего ядру лейкоцита на гистограмме яркости.
Этот метод аналогичен оценке фокуса всего кадра по эритроцитарному пику. После сглаживания гистограммы находим значение уровня зеленого Gi, в точке перехода пика ядра в пик цитоплазмы (или эритроцитов). В качестве меры качества фокуса изображения принимаем отношения - (число измерений в окрестности Оі)/(число измерений в окрестности среднего значения пика). Эмпирически установлено, что при хорошем фокусе это отношение не должно превосходить 0.5. Введенное отношение полностью аналогично величине ErDf, использованной для определения качества фокуса кадров с эритроцитами. Однако имеется одно отличие: в силу того, что размеры кадра существенно меньше следует учесть статистические флуктуации для числа измерений в разрядах гистограммы. Необходимо пользоваться критерием проверки гипотезы: отношение двух нормально распределенных величин 0.5: N2/Ni C (в данном случае С=0.5). Можно использовать любой из двух вариантов: Z=(C N2-Ni)/ (C2 N2+Ni)12 или Z=2( (C N2) ш -Ni 1/2)/(1+С) т (первый использует нормальную аппроксимацию, а второй - аппроксимацию квадратного корня для распределения Пуассона). Гипотеза принимается, если величина Z оказывается достаточно большой, например: Z FLaplace(l-Alfa) для Alfa=0.05. На Рисунках 2.28, 2.29 показаны соответствующие гистограммы для тех же двух клеток с хорошим и плохим качеством фокуса.