Введение к работе
Актуальность работы. Загрязнение окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки представляет особую опасность, что связано с большими масштабами добычи, транспортировки, переработки энергоносителей и несовершенством технологических процессов. Потери нефти только в России достигают 50млн.т/год, из них более трети - за счет аварийных ситуаций; при переработке нефти ежегодно образуется 700тыс.т отходов (Гос.доклад ГП НТЦ,2008). Углеводороды нефти (УВН) приводят в негодность огромные массивы сельскохозяйственных почв вследствие уменьшения их плодородия и негативных изменений в почвенном биоценозе, являются основными загрязнителями внутренних водоемов и морей, создавая различные формы загрязнения - плавающие на воде нефтяные пятна, осевшие на дно тяжелые фракции, что значительно нарушает жизнедеятельность аэробной биоты (Кобзев,2002). Компоненты тяжелых фракций нефти (нафталин, фенантрен) и в особенности их метаболиты, диол- и эпоксипроизводные, представляют собой высокоактивные соединения, являющиеся канцерогенами и мутагенами, т.к. способны образовывать ковалентные связи с ДНК (Park,2004; Ojo,2007). Именно поэтому нефть и нефтепродукты (НП) относятся к приоритетным загрязнителям биосферы (Другов,2000; Карпенко,2006).
Перспективным способом очистки почв и вод от НП считается биоремедиация (Widada,2002). Ведущая роль в разложении нефтекомпонентов (НК) принадлежит микроорганизмам-нефтедеструкторам родов Pseudomonas и Rhodococcus, широко распространенным в биогеоценозах и отличающихся выраженной способностью к биодеградации УВН в связи с наличием у них широкого набора ферментных систем (ФС) (Van Hamme, 2003; Compant,2005).
Широкому практическому использованию микроорганизмов предшествует стадия фундаментальных исследований, направленная на изучение физиолого-биохимических свойств бактериальных клеток и закономерностей изменений функционирования входящих в них ФС. Обработка информации, полученной при исследовании таких сложных и многофакторных систем, позволяет провести комплексное исследование микробной деградации УВН. С этих позиций становится возможным оценить влияние на интенсивность процессов биоокисления нефти и НП биотических и абиотических факторов: присутствия плазмид деградации, состава микробной популяции, физических и химических свойств ксенобиотиков, колебаний рН среды и температуры, высокой засоленности почв и естественной солености морских акваторий (Margesin,2001; Roling,2004; Zhang,2006).
Для решения поставленных задач необходима разработка методов и алгоритмов определения метаболической активности микроорганизмов (Кузнецов,2006) и прогнозирования поведения бактериальных ФС в реальных условиях. Наиболее перспективными сейчас являются методы биофизической и биохимической диагностики, в частности, биосенсорные технологии, сочетающие чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров (D’Souza,2001; Sakaguchi, 2003; Chang, 2004; Rodriguez-Mozaz,2006; Tizzard,2007; Решетилов,2007). Таким образом, представляется актуальным провести обработку информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов при изменении их окислительной активности под действием эндо- и экзогенных факторов.
Цель исследования: исследовать зависимость дыхательной активности микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus и их ассоциаций от эндо- и экзогенных факторов путем обработки информации биосенсорных систем для совершенствования средств оценки биокаталитических свойств микроорганизмов в условиях биоремедиации.
Задачи исследования:
Разработать лабораторную модель биосенсорной установки на основе иммобилизованных микробных клеток, позволяющую проводить визуализацию, трансформацию и обработку информации по дыхательной активности аэробных бактерий-деструкторов УВН.
На основе сравнительного изучения профилей субстратной специфичности (ПСС) ФС бактериальных штаммов проанализировать влияние коньюгативных плазмид деградации нафталина (эндогенный фактор) на изменение окислительного потенциала бактериальных хозяев.
Оценить изменение окислительной активности нефтедеструкторов р. Pseudomonas и Rhodococcus в результате воздействия факторов экзогенного характера (природы доступного субстрата, повышенной осмолярности среды, колебаний рН и влажности, низких положительных температур) для прогнозирования деградативных свойств нефтедеструкторов в условиях биоремедиации.
Обработать информацию ПСС искусственно составленных ассоциаций микроорганизмов и оценить кооперативный эффект при совместном окислении штаммами УВН в присутствии экстремального фактора и без него.
Выявить корреляцию между результатами биосенсорных исследований по определению окислительной активности природных и модифицированных штаммов и величинами удельных активностей ключевых ФС этих штаммов, а также их ростовыми и культуральными характеристиками.
Применить биосенсорные системы для постановки длительного контролируемого экологического эксперимента, натурной концептуальной моделью которого будут иммобилизованные штаммы микроорганизмов и их ассоциации с правом выбора анализируемого фактора в качестве лимитирующего и обработать информацию по трансформации биокаталитических свойств нефтедеструкторов.
Научная новизна работы
Показано, что биосенсорная регистрация дыхательной активности иммобилизованных клеток микроорганизмов обеспечивает оперативность и надежность получаемых данных и является эффективным инструментом оценки деградативных свойств аэробных штаммов в отношении широкого круга УВН и их производных.
Впервые установлено, что биосенсорная оценка субстратной специфичности искусственно составленных микробных ассоциаций позволяет регистрировать возникающий в ассоциациях кооперативный эффект, а также антагонистические взаимодействия микроорганизмов.
Впервые показана возможность использования биосенсорных технологий для экспертного анализа результатов модифицирования нефтедеструкторов плазмидами биодеградации.
Определено, что обработка информации биосенсорных систем может быть использована для экологического мониторинга факторов окружающей среды при оценке их воздействия на окисляющую способность бактерий-деструкторов. Впервые такой подход применен для исследования возникновения адаптаций бактериальных клеток к ряду экзогенных факторов.
Впервые показана принципиальная возможность использования биосенсорных систем для постановки длительного контролируемого экологического эксперимента, натурной концептуальной моделью которого являются иммобилизованные штаммы микроорганизмов и их ассоциации с правом выбора анализируемого фактора в качестве лимитирующего. Установлено, что обработка информации биосенсорных систем позволяет регистрировать происходящие при этом направленные сукцессионные изменения в микробоценозе и может лежать в основе метода характеристики биохимического поведения нефтедеструкторов и их ассоциаций в условиях биоремедиации.
Практическая значимость работы
Развит экспрессный, аналитический и безреагентный способ скрининга нефтедеструкторов для быстрой и комплексной оценки эффективности бактериальных штаммов и прогнозирования их полезных свойств в условиях биоремедиации.
Результаты создают основы для использования микробных сенсоров в прикладных исследованиях трансформаций биохимического поведения модифицированных штаммов, а также искусственно составленных ассоциаций в условиях изменения доступности ростовых субстратов и постоянного воздействия абиогенных факторов в течение длительного времени биоремедиации. Это позволит избежать незапланированных потерь активности интродуцируемых биопрепаратов в конкретных условиях.
Выявленные в работе закономерности функционирования биосенсоров на основе бактерий родов Pseudomonas и Rhodococcus могут быть использованы в качестве научной основы при разработке микробных биосенсоров на основе других аэробных микроорганизмов-деструкторов УВН.
Макет микробного биосенсора на основе микроорганизмов-нефтедеструкторов характеризуется экспрессностью, высокой чувствительностью и низким пределом обнаружения токсичных поллютантов. Он может быть использован для количественного определения селективного или совокупного содержания ароматических УВ в реальных образцах посредством одновременного измерения проб двумя сенсорами, модифицированными штаммами с отличающимися окислительными характеристиками в отношении аналитов-НК. Разработанная установка может служить прототипом опытного образца прибора для серийного освоения, а также применяться в учебном процессе, что позволит усовершенствовать экспериментальную и приборную базу университетов и повысить качество образования.
Внедрение.
Результаты исследований внедрены на кафедрах химии и биотехнологии ГОУ ВПО Тульского государственного университета; в ГУП ТО НИИ новых медицинских технологий (г.Тула); в Институте теоретической и экспериментальной биологии РАН (г.Пущино).
Работа выполнялась при поддержке грантов РФФИ 04-04-96705 «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности», 2004-2005г., 06-04096318 «Особенности механизмов биодеградации углеводородов нефти бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus», 2006г. и 08-04-99019-р_офи «Изучение метаболических особенностей и генетических систем биодеградации микроорганизмов-нефтедеструкторов и разработка на их основе подходов к созданию новых биопрепаратов и технологий биоремедиации почв, загрязненных нефтью и НП», 2009-2010г.; в рамках ФЦП "Интеграция" (проект Л0145), НОЦ «Экобиотехнология» (2005-РИ-16.0/ 025/026 ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006г., госконтракт 02.438.11.7021.), программы ФА по образованию «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008г.)», РНП 2.1.1.7789.
Апробация работы и публикации
Результаты работы были представлены и обсуждены на: IV Региональной научно-практ. конференции «Современные проблемы экологии и рационального природопользования в Тульской области» (Тула, 2004); IX и X Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006); IV Международной научной конференции «Химия, хим. технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск,2006); II Всероссийской научно-техн. Интернет-конферен-ции «Современные проблемы экологии и безопасности» (Тула, 2006); Всероссийской научно-техн. конференции «Современные проблемы экологии» (Москва-Тула, 2006); V Cъезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Х Юбилейном международном форуме «Высокие технологии ХХI века» (Москва 2009).
По теме диссертации опубликовано 4 статьи (в журналах, рекомендованных ВАК), 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.
Структура и объем работы
