Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I.Обзор литературы 11
1.1.Современные представления о строении костной ткани 11
1.2.Регенерация кости, механизмы ее регулирования 16
1.3.Современные материалы для восстановления костных дефектов .22
1.4. Синтетические костнозамещающие материалы: на основе гидроксиаппатита и – комбинированные 30
ГЛАВА II.Материалы и методы исследования .39
2.1. Экспериментальные исследования .39
2.1.1.Методика выделения полимера и создание пасты на основе полиоксибутирата 40
2.1.2. Методы исследования полученного материала 44
2.1.2.1 Световая микроскопия .44
2.1.2.2 Электронная сканирующая микроскопия .45
2.1.2.3 Исследование физико-термических свойств матриксов методом дифференциальной сканирующей калориметрии .46
2.1.2.4 Исследование биосовместимости материала на основе полиоксибутерата in vitro на культуре мезенхимальных стволовых клеток 47
2.1.2.5. Методика экспериментальных исследований свойств разработанного материала на основе полиоксибутерата при регенерации костных дефектов 48
2.1.2.6. Гистологическое исследование 52
2.2. Материалы и методы исследования (клинический этап) 54
2.2.1. Общая характеристика пациентов .54
2.2.2. Методы клинико-лабораторного обследования пациентов 56
2.2.3. Методы оперативных вмешательств .58
2.2.4. Методы статистической обработки полученных данных 64
ГЛАВА III. Результаты экспериментальных исследований 65
3.1. Общая характеристика материала 65
3.1.1. Результаты сканирующей электронной микроскопии 66
3.1.2 Результаты дифференциальной сканирующей калориметрии 66
3.1.3. Результаты изучения биосовместимости синтетического биорезорбируемого материала in vitro 67
3.2. Результаты экспериментальных исследований биосовместимости разработанного синтетического биорезорбируемого материала на основе полиоксибутерата in vivо .68
3.2.1. Результаты тканевой совместимости при подкожной имплантации материала гидроксиапатит-полиоксибутерат .68
3.2.2. Экспериментальное исследование имплантации материала полиоксибутерата в дефект - костной ткани бедренной кости крыс 70
3.2.3. Результаты экспериментальных исследований процессов заживления костных дефектов под влиянием материала на основе гидроксиапатит-полиоксибутерата у мини-пигов 73
ГЛАВА IV. Результаты клинических исследований 80
Заключение .90
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы .
- Синтетические костнозамещающие материалы: на основе гидроксиаппатита и – комбинированные
- Исследование физико-термических свойств матриксов методом дифференциальной сканирующей калориметрии
- Результаты дифференциальной сканирующей калориметрии
- Экспериментальное исследование имплантации материала полиоксибутерата в дефект - костной ткани бедренной кости крыс
Синтетические костнозамещающие материалы: на основе гидроксиаппатита и – комбинированные
Основной компонент, составляющий матрикс — это белок коллагена со специфической структурой. Молекула коллагена образовывается тремя спирализованными полипептидными а-цепями, которые закручены одна вокруг др. в правую суперспираль с диаметром о 110 нм. Индивидуальные а цепи отличаются др. от др. первичной структурой, а также молекулярной массой. Особенность аминокислотного состава коллагена заключается в высокой концентрации глицина, наличии пролина, оксипролина и оксилизина. Все соли кости представлены в основном кальцием и фосфатом. Молекула коллагена содержит некоторое количество моносахаридов, ее трехспиральная структура, - это жесткое и упорядоченное образование, которое фиксируется благодаря различным типа связям, которые формируются между радикалами аминокислот и функциональными группами гексоз [72].
В ходе рентгеноструктурного анализа установлена кристаллическая структура коллагена. Кристаллическая структура позволяет ему идеально минерализироваться. Между волокнами коллагена находятся глобулярные белки, фосфо- и гликопротеиды, которые цементируют органический матрикс. Синтез коллагена и гетерополисахаридов идет интенсивно в остеобластах. [135].
В матриксе присутствуют и неколлагеновые белки, важные для регуляции минерализации и укрепления основы коллагена. Кальций-связывающие белки содержат остеокальцин и матриксный Gla-протеин, содержащие, в свою очередь, карбоксиглютаминовую кислоту и витамин К. Данные белки позволяют созреть костному матриксу, т.к. задерживают минерализацию. Остеокальцин является наиболее специфическим белковым продуктом остеобластов. При этом подавляется ген остеокальцина, но это понижает рост и минерализацию скелета. С кальцием и коллагеном связываются костный сиалопротеин и остеопонтин, что стимулирует процесс прилипания остеокластов к поверхности кости. Кристаллы гидроксиапатита содержат карбонат, фторид и различные другие минералы в следовых количествах. Их содержание зависит от окружающей среды [63].
Минеральная часть костной ткани также включает микрокристаллы игольчатой формы диаметром 400—800 нм, длиной 400—600 нм. По составу и строению они такие же, как и гидроксиапатит. Характеризуются маленькими размерами и образуют большую поверхность с площадью 10 м /г неорганического материала, на которой адсорбируются анионы (карбонат, цитрат, гидроксил, хлорид, фторид), катионы (магний, натрий, калий) и диполи воды [16].
Костная ткань по составу содержит 99 % кальция, 80 % фосфора, 60 % магния, 25 % натрия от всего объема отмеченных элементов в организме, а также др. макро- и микроэлементы [84].
Основное вещество кости имеет три типа клеток: остеобласты, остеокласты и остеоциты [122].
Остеобласты формируются из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), из которых также могут формироваться клетки мышечной, хрящевой ткани, адипоциты. Вероятно, есть клетки - предшественники, которые дифференцируются только в остеобласты. Они есть в надкостнице и строме костного мозга [145]. После того, как остеобласты завершают продуцирование коллагеновых и неколлагеновых белков, отдельные из них внедряются в матрикс, преобразуюсь в остеоциты. Первые и вторые соединяются посредством клеточных отростков, находящихся в канальцах в пределах кости. Синцитий взаимосвязанных клеток дает ощущение механических сил. В этом соединении остеоциты передают сигналы активации во время ремоделирования. Главная функция остеобластов, - это синтезирование органического матрикса. В их цитоплазме, - высокий уровень активности щелочной фосфатазы (ЩФ) [143].
Остеокласты - это большие по размеру многоядерные клетки, которые резорбируют кость. Активные остеокласты включают от 2 до 5 ядер. Они содержат большое количество цитоплазмы и аппаратов Гольджи, а также митохондрий и лизосом. Остокласты активно резорбируют, прикрепляясь к кости зоной мембраны, частично лишенной субклеточных частиц. Время жизни остеокластов, - от 3 до 4 недель. После этого периода времени они теряют ядро апоптозом и становятся неактивными. Клетки-предшественники есть в костном мозге, селезенке, и частично в циркуляции. Положительная реакция на тартрат резистентную кислую фосфатазу (КФ), является специфическим гистохимическим маркром зрелых остеокластов, она способствует резорбции ткани [49].
Остеоциты являются клетками, характерными для зрелой костной ткани. Их главная функция связанна с транспортированием питательных веществ и минералов [80].
Перестройка кости за счт резорбции, и новообразование костной ткани идет непрерывно. Это физиологическое проявление самообновления костных структур [126; 121]. Костная ткань характеризуется высоким уровнем обменных процессов. Органическая матрица постоянно обновляется и рекальфицируется, при этом идет обмен ионами между поверхностью кристаллов и тканевой жидкостью, которые тесно контактируют. В процессе взросления организма размеры кристаллов увеличиваются, а поверхность соприкосновения их с жидкостью уменьшается, в связи с чем, метабо лические процессы замедляются. Губчатая костная ткань характеризуется более высоким уровнем обменных процессов, чем компактная, что объясняется большей площадью соприкосновения трабекул губчатого костного вещества с тканевой жидкостью [26]. Процессы разрушения и созидания костной ткани – это ее ремоделирование, которое начинается с активации, опосредованной клетками остеобластного происхождения. Она может включать преостеобласты в костном мозге, остеоциты, остеобласты на поверхности кости. Дальнейший цикл ремоделирования – это фазы резорбции, реверсии, формирования. [82] Постоянный идущий обмен костных солей обеспечивает ремоделирование кости, что поддерживает ее прочность в течение всей жизни. Об интенсивности обменных процессов в костной ткани свидетельствует высокая активность в костных клетках различных ферментов и ряда метаболитов, связанных с циклом Кребса: лимонной кислоты, др. органических кислот, находящихся в костной ткани в гораздо более высокой концентрации, чем в мягких тканях [143].
Интенсивность оборота кости значительно увеличивается при гипертиреозе, когда часто происходит потеря костной ткани. Существенно влияют на костный обмен и половые гормоны. Эстрогены влияют на развитие скелета и у мужчин, и у женщин. Андрогены стимулируют остеогенез как непосредственно, так и посредством влияния на примыкающие мышечные ткани [69]. Таким образом, строение костной ткани, наличие клеток остеобластного происхождения, постоянный обмен костных солей обуславливают ремоделирование и регенерацию костной ткани. Костная ткань может быть восстановлена в большей степени, чем другие виды тканей, благодаря остеобластическому дифферону [15].
Исследование физико-термических свойств матриксов методом дифференциальной сканирующей калориметрии
В середине 70-х гг. ХХ века был синтезирован искусственный ГАП, который минерализирует костную ткань посредством отложения его кристаллов вдоль фибрилл коллагена. Кристаллы откладываются из межклеточной жидкости, которая перенасыщенна ионами кальция и фосфата межклеточной жидкости. Минерализация органического матрикса связанна и с секрецией остеобластами матричных пузырьков, содержащих в высокой концентрации фосфат кальция и ЩФ. Очаги минерализации растут в размерах, сливаясь др. с др., и превращая новообразованный остеоид в костный матрикс.[93; 32]
Костнозамещающие материалы можно разделить на две группы: 1. Нерезорбируемая при высоких температурах керамика: порошки, гранулы, блоки; 2. Резорбируемый ГАП: мелко- и крупнодисперсные порошки. Они характеризуются и свойствами остеокондукторов, и также стимулируют остеогенез. Частицы ГАП сорбируют на своей поверхности КМБ, который и запускает процесс костной регенерации.[6]
В России на основе ГАП создали материалы (Гидроксиапол, Остим -100, Коллапан). За рубежом выпускают также ряд материалов на основе гидроксиапатита. Также получили распространение метериалы на основе трикальцийфосфата.
Кальций- фосфатные материалы используются в медицине с 1890 гг. Но лишь Albee в 1920 г впервые продемонстрировал, что трикальций-фосфат стимулирует образование кости. Существенный прогресс при разработке и применении фосфатных материалов был в 1970- 1980 гг. Иундаментальные исследования и клиническое применение этих материалов показало, что материалы, - биосовместимы, остеоиндукктивны, способствуют образованию на их поверхности новообразованной кости.[7; 3; 5]
Материалы по составу близки костной ткани человека, и в период резорбции продукты деградации кальций-фосфатных материалов естественным путем метаболизируются, в связи с чем, не повышают уровень кальция или фосфатов в моче, сыворотке и различных органах. Кальций-фосфатные материалы могут вызывать эктопический остеогенез, также как КМБ, но механизмы формирования кости имеют различия. При использовании КМБ всегда наблюдается энхондральный остеогенез, а при кальций-фосфатных, - интрамембранозный остеогенез, без образования хряща [166].
Кальций-фосфатные материалы остеоиндуктивны. Это свойство обеспечивается физико- химическими и структурными параметрами: размером, формой, порозностью, величиной, химическим составом, поверхностной микроструктурой и др. У материалов с одинаковым химическим составом остеоиндуктивные свойства различаются от величины макропор. Рекомендуется их величина, – не менее 300 мкм; она способствует питанию и клеточному распространению по поверхности макропор, позволяет активно формироваться капиллярам в имплантате. Желательно увеличивать число макропор. Уменьшая их размеры, что позволяет увеличить реактивную поверхность и остеоиндуктивную активность материалов [64; 90; 147].
Сразу после имплантации на поверхности биоматериала абсорбируются белки крови и межклеточного матрикса. Клеточная адгезия стимулируется слоем белков, который также обеспечивает передачу информации клеткам через интегрины. Из них бронектин и витронектин ответственны за адгезию остеобластов и их предшественников к поверхности кальций-фосфатных биома-териалов [ 43; 111; 137].
В клинической практике применяется много кальций фосфатных материалов, но исследователи считают, что наиболее целесообразно использовать биокомпозиционный гидроксиапатит-содержащие препараты, который активизирует репаративный остеогенез.[7; 3; 5]
Все они биосовместимы, резорбируемы, имеют разный уровень остеокондуктивных свойств. На их поверхности и идет формирование новообразованной кости. Однако наиболее активное формирование, созревание и замещение дефекта новообразованной костью наблюдается при имплантации в костный дефект композиционного препарата [36].
Согласно основным принципам тканевого инжиниринга, с целью активизации регенерации костной ткани, сотрудниками ЦИТО разработан метод сочетанного применения Коллапана и обогащнной тромбоцитами аутоплазмы. В качестве живых клеток используется концентрат собственных тромбоцитов, которые разрушаясь в костном дефекте выделяют многочисленные факторы роста, активирующие процессы остеогенеза, а Коллапан выполняет роль постепенно лизирующейся матрицы, характеризующейся остеокондуктивными, антибактериальными, остеоиндуктивными свойствами.[7; 3; 5] Синтетические кальций-фосфатные материалы являются эффективной альтернативой аутотрансплантатам аллоимплантатам. Последующее развитие клеточной и молекулярной биологии, нанотехнологий в области биоматериалов, будет способствовать созданию синтетических кальций-фосфатных материалов с еще более лучшими остеоиндуктивными свойствами [38; 151].
Результаты дифференциальной сканирующей калориметрии
Разработанная система - это паста из микросфер с ГАП в альгинатном золе. Система разработана специально с целью применения для заполнения дефектов костной ткани. Средний диаметр полученных микрочастиц составил 52 ± 11 мкм. Данная методика позволяет получать микрочастицы с размером от единиц до 300 - 400 мкм. Такой размер был выбран, т.к. соразмерен с клетками, которые смогут прикрепляться к опорному субстарту из микрочастиц и расти на нем. На фотографии, которую получили методом СЭМ, видна высокопористая поверхность микрочастиц, состоящая из переплетенных полимерных тяжей. Такая характеристика поверхности может способствовать прикреплению клеток к микрочастицам и росту на них. Основное отличие пасты от простого альгинатного геля заключается в наличии твердых микрочастиц размером 52 ± 11 мкм, при размере клеток в 25-35 мкм. Можно предположить, что данные частицы обладают хорошей адгезией, в связи с чем клетки могут использовать их как подложку для прикрепления и последующего активного роста.
Таким образом, структура разработанного материала имеет элементы твердой подложки, а также вещество, которое способно поддерживать оптимальное микроокружение для клеточной культуры. Внешний вид полученных микрочастиц в пасте показан на рис.40. Данные СЭМ (рис. 40) показали скопление микрочастиц, которые связанных между собой и погружены в альгинатный гель. Отчетливо наблюдаются кристаллы гидроксиапатита (ГАП), которые находятся на поверхности микрочастиц [36]. Это важно в полученной системе, так как данная конструкция должна стимулировать формирование костной ткани посредством остеостимулирующих свойств ГАП, который находится на поверхности микрочастиц и высвобождается в процессе их биодеградации.
Исследование теплофизических характеристик композиции было проведено с помощью DSC 204 F1 Phoenix (Netzsch, Germany). Из результатов исследования было выявленно, что введение ГАП и альгината в полимерную систему существенно меняет общий вид кривых ДСК (рис.41).
Здесь сопоставлены результаты плавления полимерной матрикса в сравнении с микрочастицами из ПОБ. Как видно из рисунка, при введении альгината и ГАП появляется широкий дополнительный пик плавления в области низких температур (от 30 до 100 С), а основной пик плавления полимерного композита в области высоких температур также смещается в область более низких температур. Появление пиков плавления в области низких температур свидетельствует об уменьшении общей степени кристалличности в композите матрикса.
Исследования in vitro проводились на клетках линии COS-1 (Биолот, Россия) и заключались в оценке жизнеспособности клеток в различных средах. Были поставлены эксперименты в альгинатном геле, на микрочастицах и на плоском матриксе. В каждый из этих вариантов добавляли одинаковое количество клеток в размере пяти тысяч и
фиксировали их количество через определенное количество дней (2, 5, 7, 9, 12). Рост клеток оценивался методом ХТТ( метод на выживаемость и пролиферацию клеток. Контроль производился с помощью теста, основанного на реакции преобразования нерастворимой соли тетразолиума в растворимую окрашенную соль формазана, осуществляемой активными митохондриальными ферментами клеток (XTT Cell Proliferation Kit, Biological Industries, Израиль)) .Измерялась оптическая плотность через определенные промежутки времени. После чего, с помощью калибровочной кривой, построенной с известным количеством клеток, пересчитывалась на количество клеток.Все эксперименты были выполнены в шести поверхностях. Результаты представляют собой среднее от этих значений.
И хотя из литературных источников известно, что альгинат является хорошим субстратом для роста клеток, из этого опыта можно сделать вывод, что комбинированная полимерная конструкция обладает лучшим субстратом для роста клеток, что обуславливается наличием твердых частиц, которые служат опорой для клеток, а рост клеток наблюдается в объеме.
При гистологическом исследовании образцов подкожно-жировой клетчатки крыс через 14 после имплантации материала ГАП ПОБ было выявлено, что поверхность материала окружена рыхлой соединительной тканью, которая построена из рыхлых пучков коллагеновых волокон. В них обнаруживались редкие лимфо- и плазмоциты, а так же макрофаги. Кровеносные сосуды с обычным кровенаполнением, а нейтрофилов не было обнаружено. Материал имеет начальные признаки резорбции гигантскими клетками инородных тел, которые активной каемкой проникают в толщу материала и растворяют его. В некоторых местах в месте существования небольших гранул уже могут быть обнаружены псевдокисты, содержащие жидкие массы (рис. 42-45).
При гистологическом сравнении образцов подкожно-жировой клетчатки крыс через 14 после имплантации костного недеминерализованного ксеноколлагена было выявлено следующее: - поверхность материала окружена рыхлой соединительной тканью с инфильтрацией плазмоцитами и макрофагами; - соединительная ткань состоит из рыхлых и плотных пучков коллагеновых волокон; - кровеносные сосуды с обычным кровенаполнением; - материал набухший, деструирующий, расслаивающийся на волокна, имеются начальные признаки резорбции гигантскими клетками инородных тел (рис. 42-45).
Экспериментальное исследование имплантации материала полиоксибутерата в дефект - костной ткани бедренной кости крыс
В настоящее время в рамках биоинженерии разработано большое количество различных видов костно-пластических материалов. Большинство из них –это ксенно- и аллогеные материалы. Используются и ауто – костные материалы. Ни один из современных материалов не обладает всем набором необходимых свойств в полной мере.[34;102] Аутогенные материалы запускают все механизмы ее новообразования: остеокондуктивный, остоиндуктивный, остеогенный.[25;47], они биосовместимы, способны к быстрой реваскуляризации с формированием органотипичной костной ткани. Однако, во время взятия пересадки костного аутотрансплантата погибает много остеогенных клеток, необходимо учитывать, что донорские зоны для забора материала ограничены. Алломатериалы требуют сложной обработки, деминерализации. Проблема данных материалов-биосовместимость. Ксенногенные материалы – наиболее эффективны, активно используются для трансплантации костной ткани биоматериалы на основе коллагена. Костная ткань содержит порядка 57% всего запаса коллагена организма, метаболическая активность костного коллагена выше, чем в соединительной ткани других органов. Коллаген характеризуется следующими достоинствами; он-низкотоксичен и обладает антигенностью, у него высокая механическая прочность, устойчивость к тканевым протеазам.[46] Коллаген может образовывать комплексы с антисептиками и антибиотиками, гликозаминогликанами и др. биологически активными веществами. Поэтому можно создавать препараты, которые стимулируют регенеративные процессы в условиях инфицированной раны. Материалы на основе коллагена – это временный каркас, который рассасывается по мере замещения собственной соединительной тканью, а продукты распада оказывают стимулирующее действие на процессы репарации. Научные исследования подтвердили, что гели на основе коллагена стимулируют кальцификацию тканей in vitro. Гистологические данные подтвердили, что препараты на основе коллагена стимулируют репарацию костной ткани.[155]
Несмотря на высокую степень очистки, материалы животного происхождения могут вызывать ответную реакцию иммунной системы организма, а также посслужить источником переноса инфекции, что может вызвать инфекционные осложнения в постоперационном периоде.
Синтетические материалы представляют собой композиты, керамику, цементы на основе синтетического гидроксиапатита кальция, сульфата кальция и их комбинации. Данные материалы характеризуются остеокондуктивными свойствами. Есть данные о возможном наличии остеоиндуктивных свойств и у наноразмерных частиц гидроксиапатита кальция.[160] В клиническом аспекте важна форма материала; особенно при заполнении дефектов челюстных костей сложной формы с поднутрениями (полости кист, лунки удаленных зубов, полость ВЧ синуса при синуслифтинге). При данных костных дефектах оптимально использовать материалы в виде пасты или гелей. При разработке таких материалов существенное значение имеет выбор оптимального состава композиции. Современная полимерная биоинженерия позволяет использовать в качестве основных компонентов новые биоразлагаемые и биосовместимые полимеры – поли-3-оксибутират (ПОБ) и альгинат. ПОБ – это биоразлагаемый полиэфир, который получают биотехнологическим методом [76,77]. ПОБ характеризуется важными для медицинского использования биологическими свойствами: биосовместимость [41,12], способность к биоразложению в живых тканях, причем без образования побочных токсических продуктов [17]. Данные свойства позволяют в рамках его использования сочетать эффективные свойства коллагена, однако, риск послеоперационных воспалительных осложнений при использовании композиционного материала на основе ПОБ и альгината ниже, ем при применении коллагена. В тканевой инженерии применяют гидрогели на основе альгината, который способен образовывать нерастворимый гидрогель при добавлении двухвалентных катионов. Обратимое гелеобразование идет за сет ионных взаимодействий в альгинатах. Эти гели также характеризуются высоким уровнем биосовместимости. Представляется, что композиционный материал в виде гели или пасты на основе отмеченных материалов, будет оптимальным по своим свойствам.
На основании вышеперечисленного, нами была определена цель и поставлены задачи работы, для решения которых был проведен ряд экспериментальных и клинических исследований.
Разработка и экспериментально - клиническое исследование синтетического материала на основе ПОБ, альгината и наноГАП в виде пасты для повышения эффективности восстановления кости при дефектах костной ткани.
Исследование включало в две части: экспериментальную и клиническую. Экспериментальная часть включала себя III этапа: I этап – получение полимера, апробация технологии получения материала, изготовление экспериментальных образцов в лаборатории; II этап – исследование биосовместимости материала in vitro на культуре МСК человека. I и II этапы были осуществлены на базе лаборатории Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, с участием кафедры челюстно-лицевой хирургии и имплантологии ФПКВ. Экспериментальные исследования in vivo проводились на животных моделях. III этап - изучение свойств разработанного материала при регенерации костной ткани. Этап проводился на свиньях породы «мини-пиги» в ФГБУН НЦБМТ ФМБА России