Морфологическое и функциональное состояние тканей пародонта при хроническом и агрессивном течении пародонтита Заболотнева Светлана Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1 Этиология и патогенез воспалительных заболеваний пародонта 11

1.2 Матриксные металлопротеиназы и их роль в развитии воспалительных заболеваний пародонта 14

1.3 Коллагеновые структуры и их изменения при воспалительных заболеваниях пародонта . 20

1.4 Гемомикроциркуляция и ее изменения при воспалительных заболеваниях пародонта . 29

Глава 2. Материалы и методы исследования 34

2.1 Общая характеристика пациентов 34

2.2 Клинические методы исследования 37

2.3 Параклинические методы исследования 38

2.3.1 Рентгенологические методы исследований 38

2.3.2 Морфологические методы исследований 39

2.3.3 Функциональные методы исследований 43

2.4 Методы комплексного лечения пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени при хроническом и агрессивном течении 45

2.4.1 Гигиеническое обучение 45

2.4.2 Метод местной противовоспалительной терапии 45

2.4.3 Хирургический метод лечения 46

2.5 Статистические методы исследования 47

Глава 3. Результаты собственных исследований 48

3.1 Клинико-рентгенологическая характеристика пародонта пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени при хроническом и агрессивном течении 48

3.2 Лечение пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени 50

3.2.1 Местная противовоспалительная терапия и ближайшие результаты после ее проведения . 50

3.2.2 Хирургическое лечение 53

3.2.3 Результаты клинических исследований состояния пародонта при динамическом наблюдении 54

3.3 Динамика пародонтальных индексов 55

3.3.1 Динамика индекса гигиены Silness-Loё 55

3.3.2 Динамика индекса кровоточивости Muhlemann (Cowell) 58

3.4 Результаты морфологических исследований 62

3.4.1 Результаты поляризационной микроскопии 62

3.4.2 Результаты иммуногистохимического исследования 70

3.5 Результаты функциональных исследований 74

3.5.1 Результаты компьютерной капилляроскопии 74

Глава 4. Обсуждение результатов собственных исследований и заключение 94

Выводы 105

Практические рекомендации 107

Список литературы 108

• Коллагеновые структуры и их изменения при воспалительных заболеваниях пародонта
• Морфологические методы исследований
• Динамика индекса кровоточивости Muhlemann (Cowell)
• Результаты компьютерной капилляроскопии

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Изучение звеньев патогенеза воспалительных заболеваний пародонта остается актуальным в связи с недостаточной эффективностью лечебных вмешательств – как консервативных, так и хирургических. В связи с почти 100%-ной распространённостью и все возрастающей поражаемостью лиц молодого возраста агрессивной формой пародонтита, углубленное исследование состояния структур пародонта представляет не только научный, но и сугубо практический интерес для обоснования индивидуализированного подхода к прогнозированию течения заболевания и лечению пациентов [Грудянов А.И., 2009; Субанова А.А., 2015; Костригина Е.Д. и др., 2017; Laforgia A. et al., 2015; How K.Y. et al., 2016; Kinane D.F., 2017; Gursoy U.K. et al., 2018].

Особое значение имеет изучение морфологического и функционального состояния пародонта, а именно: коллагеновых структур, содержания матриксных металлопротеиназ и гемомикроциркуляции тканей пародонта в зависимости от характера течения в нем воспалительного процесса.

Сосудистые изменения приводят к повреждению эпителия, вызывая изменения к системе микроциркуляции с признаками продуктивного васкулита, лейкоцитарную инфильтрацию через стенки сосудов и нарушения в соединительной ткани в виде дезорганизации межклеточного матрикса [Gurses N. et al., 1996; Hoff D.A. et al., 2009; Scallan J. et al., 2010; Kordiyak O.J. et al., 2014; Lira-Junior R. et al., 2014; Kazeko L. et al., 2017].

По литературным данным, особую роль в деградации компонентов экстрацеллюлярного матрикса при пародонтите играют такие матриксные металлопротеиназы, как желатиназы ММП-2 и ММП-9 и коллагеназа ММП-8. [Andonovska B. et al., 2008; Isaza-Guzman D.M. et al., 2011].

Проведение местной противовоспалительной терапии значительно снижает активность матриксных металлопротеиназ, а начинающийся репаративный процесс проходит целый ряд стадий. Он начинается с формирования незрелой

4 соединительной ткани с преимущественным образованием коллагена III типа, а затем зрелой - с преимущественным формированием коллагена I типа. Степень зрелости соединительной ткани зависит от их соотношения – I/III [Prescher N. et al., 2007; Sorsa T. et al., 2011; Gonalves P.F. et al., 2013].

Превалирование образования незрелого коллагена III типа говорит о неполном устранении воспаления, в результате чего процесс созревания соединительной ткани остается незавершенным [Garcia-Moreno F. et al., 2015].

В этой связи изучение морфологического и функционального состояния пародонта в зависимости от характера течения в нем воспалительного процесса (хронического или агрессивного) и в динамике после проведения консервативного и хирургического лечения является чрезвычайно актуальным направлением фундаментальных исследований, направленных на разработку новых подходов к диагностике и лечению пациентов с различными формами пародонтита.

Степень разработанности темы исследования

Соотношение коллагена I и III типов активно изучается в различных отраслях медицины (косметологии, герниологии, кардиологии, экспериментальной хирургии, геронтологии) [Смирнова Г.О. и др., 2012; Иванов И.С. и др., 2013; Бабиченко И.И. и др., 2016; Monique M. H. et al., 1995; Taniguchi S. et al., 2006; Cheng W. et al., 2011], поскольку этот показатель позволяет выявить системные нарушения в соединительной ткани, прогнозировать течение заболеваний и индивидуализировать подход к их лечению. Работ по изучению соотношения коллагена I и III типов в тканях пародонта, в доступной литературе нами обнаружено не было.

Изучение матриксных металлопротеиназ привлекает большое внимание ученых как в России [Соловых Е.А. и др., 2013; Румянцев В.А. и др., 2014; Борзикова Н.С., 2015; Жигулина В.В. и др., 2016], так и за рубежом [Sorsa T. et al., 2006; Ehlers V. et al., 2011; Liu N. et al., 2015; Beklen A. et al., 2017; Chen P. et al., 2017], однако в большинстве работ материалом для их изучения были ротовая и десневая жидкости, которые могут содержать в себе матриксные

5 металлопротеиназы активированные не только в результате развития воспалительного процесса в пародонте, но и другими этиологическими факторами. Работ по сравнительному изучению матриксных металлопротеиназ в зависимости от характера течения воспалительного процесса в пародонте нами обнаружено не было.

На сегодняшний день компьютерная капилляроскопия является одним из наиболее информативных методов изучения гемомикроциркуляции. В доступной литературе представлены результаты ее изучения как при интактном пародонте, так и при его воспалительных заболеваниях – гингивите и пародонтите различных степеней тяжести [Кречина Е.К., 2010, 2017; Смирнова Т.Н., 2017; Scardina G.A. 2005, 2009, 2012; Lira-Junior R., 2014]. Однако, работ по сравнительному изучению гемомикроциркуляции пародонта у пациентов с пародонтитом в зависимости от характера течения воспалительного процесса – хронического или агрессивного, а также в динамике – в доступной литературе нами обнаружено не было.

В связи с вышеизложенным, актуальным представляется изучение морфологических и функциональных изменений в пародонте в зависимости от характера течения в нем воспалительного процесса – хронического или агрессивного, а также в динамике после проведения консервативного и хирургического лечения.

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики и лечения генерализованного пародонтита средней степени при хроническом и агрессивном течении на основе изучения морфологического и функционального состояния тканей пародонта.

Задачи исследования

1. Изучить соотношение коллагена I и III типов при интактном пародонте и у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита.

2. Провести сравнительное изучение ММП-2, ММП-8 и ММП-9 при интактном пародонте и у пациентов с пародонтитом при хроническом и агрессивном течении.

3. Провести изучение гемомикроциркуляции в пародонте у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита.

4. Провести сравнительное изучение соотношения коллагена I и III типов, ММП-2, ММП -8 и ММП -9 и гемомикроциркуляции в пародонте у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита в динамике после проведения местной противовоспалительной терапии и хирургического лечения.

Научная новизна

Впервые изучено соотношение коллагена I и III типов в тканях пародонта у пациентов с интактным пародонтом и с генерализованным пародонтитом средней степени при хроническом и агрессивном течении до лечения и в динамике после проведения консервативного и хирургического лечения.

Впервые выявлены оптимальные значения соотношения коллагена I и III типов в тканях пародонта для определения степени зрелости соединительной ткани, эффективности местной противовоспалительной терапии и обоснования возможности проведения хирургических вмешательств.

Впервые проведено морфологическое изучение матриксных металлопротеиназ у пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени в зависимости от характера его течения (хронического или агрессивного) и в динамике после консервативного и хирургического лечения.

Впервые изучена гемомикроциркуляция в пародонте с помощью компьютерной капилляроскопии у пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени в зависимости от характера течения воспалительного процесса (хронического или агрессивного) до лечения и в динамике после консервативного и хирургического лечения.

Теоретическая и практическая значимость

По данным морфологических исследований соотношения коллагена I и III типов, характеризующего степень зрелости соединительной ткани, и матриксных металлопротеиназ, которые определяют наличие воспалительного процесса,

7 изучены особенности морфогенеза в тканях пародонта в зависимости от характера течения генерализованного пародонтита средней степени.

По результатам компьютерной капилляроскопии изучены особенности гемомикроциркуляторных изменений в зависимости от характера течения воспалительного процесса в пародонте.

На основании результатов морфологических и функциональных исследований обоснован дифференциальный подход с целью повышения уровня диагностики и эффективности лечения пациентов с пародонтитом средней степени при различном характере течения воспалительного процесса в пародонте.

Методология и методы исследования

Диссертация выполнена в соответствии с принципами и правилами доказательной медицины. Использованы клинические, рентгенологические (ортопантомография), морфологические (иммуногистохимия и поляризационная микроскопия) и функциональные (компьютерная капилляроскопия) методы исследования. Объектом изучения были 80 пациентов: 15 с интактным пародонтом (в возрасте от 18 до 62 лет), 40 с хроническим течением генерализованного пародонтита средней степени (в возрасте от 36 до 62 лет) и 25 – с агрессивным (в возрасте от 18 до 35 лет). Предметом исследования были морфологические и функциональные изменения в тканях пародонта у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита.

Положения, выносимые на защиту

1. По результатам проведения поляризационной микроскопии установлено, что соотношение коллагена I и III типов, характеризующее степень зрелости соединительной ткани, у пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени снижено по сравнению с интактным пародонтом, причем при агрессивном течении в значительно большей степени (на 65%), чем при хроническом (на 23,9%).

2. Изучение матриксных металлопротеиназ ММП-2, ММП-8 и ММП-9 методом иммуногистохимии показало, что ММП-8 и ММП-9 в тканях десны характеризуют активную фазу воспалительного процесса в пародонте, а ММП-2 не отражает клиническое состояние тканей пародонта.

3. По данным компьютерной капилляроскопии установлено, что все гемомикроциркуляторные изменения при пародонтите средней степени выражены в большей степени при агрессивном его течении как в артериальном, так и в венозном отделе микроциркуляторного русла.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов подтверждается достаточным количеством пациентов (80 человек), информативными методами исследования (клинические исследования – 80, рентгенологические – 80, морфологические – 765; функциональные – 405) и статистической обработкой данных. Добровольное участие пациентов в исследовании подтверждено их письменным согласием.

Результаты исследований доложены на международной конференции 102^nd Annual Meeting of the American Academy of Periodontology, San Diego, USA (12.09.2016), на международном конгрессе XVIII Congresso Internazionale Parodontologia e salute orale, Rimini, Italia (16.03.2017), на международном конгрессе SFPIO International Congress The Pink Matter!!, Toulouse, France (09.07.2017), на VIII научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 55-летию Центрального научно-исследовательского института стоматологии и челюстно-лицевой хирургии «Современные научные достижения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (19.05.2017), на общеинститутской утренней конференции ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» МР (12.01.2018), на IX научно-практической конференции молодых ученых «Современные научные достижения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии», (25.05.2018).

Апробация диссертации состоялась 29 июня 2018г. на заседании сотрудников структурных подразделений: отделения пародонтологии, отделения кариесологии и эндодонтии, отделения хирургической стоматологии, отделения

9 ортодонтической стоматологии, отделения госпитальной терапевтической стоматологии, отделения профилактики стоматологических заболеваний, отделения функциональной диагностики, лаборатории патологической анатомии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения пародонтологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России. Материалы используются при обучении ординаторов и аспирантов.

Личный вклад автора в выполнении работы

Автор принимал непосредственное участие на всех этапах выполнения данного исследования: самостоятельный анализ научной литературы по теме исследования, самостоятельное проведение клинических исследований и забора биопсийного материала для проведения морфологических исследований, проведение консервативного и хирургического лечения пациентов с пародонтитом средней степени и динамическое наблюдение за ними, статистическая обработка данных и анализ полученных результатов, подготовка материалов диссертации для публикаций и докладов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 6 в журналах, рекомендованных ВАК и 2 – в зарубежных изданиях.

Объем и структура работы

Коллагеновые структуры и их изменения при воспалительных заболеваниях пародонта

Коллаген является основным фибриллярным белком межклеточного матрикса соединительной ткани, который составляет от 25 до 33% общего количества белка в организме и 6% от общего количества массы тела. Коллаген является важным элементом костей, зубов, сухожилий, кожи и сосудов [68].

Основную массу коллагеновых белков (95%) составляют (по Уайту А. и др., 1981):

1. Интерстициальные коллагены:

- Коллаген I типа: кость, кожа, сухожилия;

- Коллаген II типа: хрящ, межпозвоночные диски;

- Коллаген III типа: сердечно-сосудистая система, кожа эмбриона.

2. Коллаген IV типа – коллаген базальных мембран;

3. Коллаген V типа – перицеллюлярные коллагены. В разных тканях преобладают разные типы коллагена, что определяется его ролью в конкретном органе или ткани. В тканях эластичных органов (миокард, желудок) преобладает коллаген III типа, а в тканях пародонта, где важна прочность, преобладает коллаген I типа [10, 65, 83].

В организме человека самым распространенным коллагеном, составляющим 90% от всего коллагена, является коллаген I типа. Коллаген III типа содержится в тех же тканях, что и коллаген I типа, но в различных с ним пропорциях, он синтезируется в гладких мышцах наряду с коллагеном I типа. После секреции во внеклеточное пространство молекулы коллагенов I, II и III типов образуют упорядоченные полимеры, называемые коллагеновыми фибриллами, которые затем группируются в большие пучки толщиной в несколько микрометров и образуют коллагеновые волокна [68, 83].

Синтез и созревание коллагена – сложный и многоэтапный процесс, начинающийся в клетке, а завершающийся в межклеточном матриксе. Синтез коллагена происходит, главным образом, в фибробластах, которые регулируют состав межклеточного матрикса осуществляя синтез, секрецию и частичное разрушение коллагена. В периодонтальной связке фибробласты различаются между собой по скорости продукции коллагенов I и III типов, которая с возрастом снижается, сочетаясь с редукцией синтетического аппарата. Часть коллагена (около 30 %) расщепляется коллагеназой ММП-2 и выводится из организма, а остальная часть превращается в нерастворимый коллаген. Процесс фибриллогенеза осуществляется при взаимодействии гликозаминогликанов с протеогликанами и гликопротеидами [57, 68].

Обновление коллагена происходит очень активно и зависит от типа ткани, возраста человека, условий его питания. Активность метаболизма коллагена определяется соотношением процессов его биосинтеза и катаболизма, которые находятся в динамическом равновесии, и осуществляются фибробластами [5, 19, 55, 56].

Коллаген, как и любой белок, функционирует в организме определенное время, его катаболизм протекает довольно медленно, от нескольких дней до года. Разрушение коллагеновых волокон осуществляется активными формами кислорода или путем фагоцитоза фибробластами, с последующим перевариванием их лизосомальными ферментами. Основной фермент катаболизма коллагена -коллагеназа, расщепляющая пептидные связи в определенных участках спирализованных областей коллагена [49, 69].

Внеклеточный распад коллагена связан с работой различных протеолитических ферментов, выделяемых поврежденными и интактными клетками соединительной ткани. Внеклеточный коллагенолизис контролируется балансом между работой коллагенолитических ферментов (в большей степени ММП), а также работой их физиологических активаторов (в частности, плазмина и стромилезина) и ингибиторов, таких как тканевые ингибиторы ММП (ТИМП) [26, 68, 83].

Внутриклеточный механизм разрушения коллагена обеспечивается высокой фагоцитарной активностью фибробластов и наличием у них развитого эндосомально-лизосомального аппарата. Фагоцитоз коллагеновых фибрилл фибробластами обусловлен экспрессией на их поверхности адгезионных гликопротеинов — рецепторов коллагена. Благодаря частичному разрушению межклеточного матрикса соединительной ткани, фибробласты свободно перемещаются по его пространству, последовательно прикрепляясь к различным его компонентам (коллагену, фибронектину), обновляя таким образом ткань [57].

При развитии воспалительного процесса в тканях пародонта деструкция коллагена в соединительной ткани связана с нарушением регуляции деятельности фибробластов, с миграцией лейкоцитов и инфильтрацией ими тканей. С усилением воспаления продолжается инфильтрация тканей лейкоцитами, потеря коллагена происходит как в латеральном, так и в апикальном направлениях относительно воспалительного очага. Даже на начальных стадиях развития гингивита уже происходит набухание коллагеновых волокон и их разрушение для создания полостей для инфильтрации коллагена [6, 26, 68].

По мере прогрессирования воспалительного процесса возрастает и площадь инфильтратов, которые приобретают диффузный характер. Рядом авторов было показано, что плазмоклеточные инфильтраты играют особую роль, соответствуя продвинутым фазам воспалительного процесса в десне, и их прогрессирование свидетельствует о выраженности хронического гингивита и предрасположенности к его переходу в пародонтит [15, 69, 140, 161, 162, 193].

В области плотных плазмоцитарных инфильтратов наблюдается разрушение тканевых, в частности коллагеновых структур соединительной ткани, которые располагаются под сохранившимся эпителиальным прикреплением, а нередко проникают достаточно глубоко в направлении альвеолярного гребня [2, 185].

По мере распространения воспалительного инфильтрата, рыхлая соединительная ткань подвергается склерозу, с резким утолщением сосудистых стенок. В костных балках появляются лакуны с гигантскими остеокластами. Плотные очаговые, иногда обширные, лимфомакрофагальные инфильтраты с полинуклеарами и инфильтраты из плазматических клеток, постепенно разрушают коллагеновый каркас подэпителиальной соединительнотканной стромы десны. С увеличением активности воспалительного процесса инфильтрат достигает круговой связки зуба, частично ее разрушает, образуя пародонтальный карман [31, 124].

Таким образом воспалительный процесс постепенно переходит в воспалительно-деструктивный, с сохранением морфологических изменений в поверхностных отделах пародонта [15, 175].

При клинически диагностированном воспалении в пародонте уже на ранних стадиях появляются воспалительные лимфомакрофагальные инфильтраты с примесями сегментоядерных лейкоцитов, которые достигают гребня альвеолярного отростка и проникают в костномозговые структуры альвеолярной кости. Это сопровождается активными резорбтивными изменениями в костной ткани альвеолярного отростка сначала на вершине гребня, постепенно распространяясь по костному краю альвеолы проксимально. Чаще изменения протекают по типу гладкой резорбции, проявляясь изъеденностью костного края, изредка с образованием ниш, заполненных клеточноволокнистой соединительной тканью [8, 15, 100].

В одних случаев, в результате резорбтивных процессов в альвеолярной кости, отмечается горизонтальное распространение процесса рассасывания костного вещества, в других – происходит истончение верхушки гребня и его расщепление на две пластинки, пространство между которыми заполняется рыхлой соединительной тканью, содержащей преимущественно лимфомакрофагальные инфильтраты [15].

В области дна сформированных карманов происходит активное разрастание грануляционной ткани и активная пролиферация с прорастанием в нее сохранившегося эпителия в виде тяжей. Сформированная на дне пародонтального кармана грануляционная ткань представляет собой стабильное образование, с преимущественным содержанием рыхлого коллагена III типа, не способное самоликвидироваться. В ее поверхностных слоях, как правило, обнаруживаются очаги некроза различной величины, часто обнаруживаются колонии микробов. В ряде случаев с поверхности в грануляционную ткань прорастают тяжи плоского эпителия. В таких участках не определяется базальная мембрана, а эпителиальные клетки характеризуются базофилией часто с вакуолизированной цитоплазмой и стертостью рисунка набухшего ядра, как правило, бледного с пылевидным ядерным хроматином [15, 27].

Морфологические методы исследований

Для изучения биопсийного материала использовали 2 метода: иммуногистохимический и поляризационную микроскопию.

Забор биопсийного материала для проведения морфологических исследований проводили методом Punch-биопсии (Рисунок 2). Полученные биоптаты помещали в 10% раствор формалина (Рисунок 3) и передавали в лабораторию патологической анатомии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» МР.

Иммуногистохимический метод использовали для определения матриксных металлопротеиназ ММП-2, -8 и -9 в тканях пародонта. Метод проводили в соответствии со стандартным протоколом, используя аппарат для автоматизации иммуногистохимического окрашивания (Lab Vision Autostainer 360, Thermo SCIENTIFIC, США) и аппарат для депарафинизации препаратов и демаскировки антигенов при иммуногистохимическом методе исследования (PT Module, Thermo SCIENTIFIC, США) (Рисунок 4).

Биоптаты фиксировали в забуференном 10% р-ре формалина (рН 7,4) и заливали в парафин (температура плавления +54 С). Серийные срезы нарезали толщиной 5 мкм, после чего их наклеивали на поли-L-лизиновые стекла. Депарафинизацию проводили в термостате при температуре +60 С в течение 1 часа. Срезы после погружения в ксилол регидрировались проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 минут.

Восстановление антигенной активности осуществляли с помощью метода теплового демаскирования в 0,01М цитратном буфере в микроавтоклаве Паскаль (Дако, Дания).

Блокирование эндогенной пероксидазной активности проводили 0,3% перекисью водорода в течение 10 минут.

В работе использованы следующие антитела к антигенам человека:

Поликлональные кроличьи антитела к ММП-2 (Epitomics Rabbit Polyclonal, 1:100);

Моноклональные кроличьи антитела к ММП-8 (GeneTex Clonality Rabbit monoclonal, 1:100);

Поликлональные кроличьи антитела к ММП-9 (Thermo SCIENTIFIC Rabbit Polyclonal, 1:100). При проведении иммуногистохимической реакции на срезы наносили 50 мкл разведенной первичной сыворотки. Срезы инкубировали при t +37 С в течение 30 минут. При помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена выявляли иммунные комплексы (BioGenex, США).

Срезы после каждой инкубации тщательно отмывали в фосфатно-солевом буфере, подсушивали вокруг, после чего на них наносили ДАБ (3,3-диаминобензидин) для оценки реакции, которую определяли по наличию гранул специфической коричневой окраски. Контроль иммуногистохимической реакции в каждом препарате проводили под микроскопом с увеличением х400. После достижения необходимой интенсивности окрашивания, срезы отмывали в дистиллированной воде и затем докрашивали гематоксилином Майера в течение 2 минут. Реакцию с матриксными металлопротеиназами оценивали по наличию или отсутствию в цитоплазме клеток коричневых гранул.

Фотографировали объекты с помощью бинокулярного микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) и цифровой видеокамеры для микроскопии Axiocam MRc 5 (D) (Carl Zeiss, Германия). Полученные изображения имели расширение 2584х1936 точек (5 млн. точек). Формат сохранения изображений .jpg с увеличением х400.

Метод поляризационной микроскопии использовали для сравнительного анализа распределения коллагена I и III типа в соединительной ткани десны с использованием набора реактивов Picro Sirius Red Stain Kit, connective tissue stain.

Срезы толщиной 5 мкм погружали в раствор для окрашивания Picro Sirius (0,1% раствор Sirius Red F3BA с пикриновой кислотой, рН 2) на 30 минут. Затем срезы промывали в 0,01% NHCl 2 минуты, дегидратировали и заключали в синтетическую заливочную среду Bio-Mount (Bio Optica Milano S.P.A., Италия).

Готовые препараты изучали в поляризационном свете при увеличении объектива 400 с помощью микроскопа Axio Imager.M2 (Carl Zeiss, Германия) и цифровой видеокамеры для микроскопии Axiocam MRc 5 (D) (Carl Zeiss, Германия) (Рисунок 5).

Для количественной оценки результатов поляризационной микроскопии проводили морфометрические исследования в программе ImageJ. Соотношение коллагена I типа к III (I/III) определяли после изучения цветных гистограмм, где считали соотношение красных и зеленых пикселей, что соответствовало распределению коллагена I типа (красные пиксели) и III (зеленые пиксели).

Динамика индекса кровоточивости Muhlemann (Cowell)

Исходные значения индекса кровоточивости у пациентов с пародонтитом средней степени при хроническом и агрессивном течении были 2,9 ± 0,1 и 2,91 ± 0,07 соответственно.

Через 1 неделю после завершения МПВТ отмечали резкое снижение значений индекса до 0,16 ± 0,35 при хроническом течении и до 0,22 ± 0,4 при агрессивном, что было ниже исходных значений на 94,5% и 92,4% соответственно.

Через 1 месяц после МПВТ (перед началом хирургического лечения) индекс сохранялся на хорошем уровне: у пациентов с хроническим течением пародонтита – 0,09 ± 0,02, с агрессивным – 0,1 ± 0,02, что было ниже исходных значений на 96,9% и 96,6% соответственно.

Через 1 месяц после завершения хирургического лечения отмечали дальнейшее снижение значений индекса кровоточивости Muhlemann: до 0,02 ± 0,05 при хроническом течении и до 0,045 ± 0,08 при агрессивном, что было ниже исходных значений на 99,3% и 98,5% соответственно.

Через 3 месяца было зафиксировано максимальное снижение индекса кровоточивости в обеих группах: до 0,003 ± 0,01 при хроническом течении и до 0,007 ± 0,02 при агрессивном, что было ниже исходных значений на 99,9% и 99,8% соответственно.

Через 6 месяцев индекс кровоточивости повышался в обеих группах: при хроническом течении до 0,4 ± 0,13, при агрессивном – до 0,7 ± 0,12, однако значения оставались ниже исходных на 86,2% и 75,9% соответственно. В этот срок пациентам обеих групп была проведена профессиональная гигиена.

Через 9 месяцев у пациентов с хроническим течением пародонтита значения индекса кровоточивости несколько снижались – до значений 0,3 ± 0,08 и оставались на 89,7% ниже исходных, у пациентов с агрессивным течением – несколько возрастали – до 1,1 ± 0,2, но оставались на 62,2% ниже исходных значений.

Через 12 месяцев отмечали выраженное повышение значений индекса кровоточивости в обеих группах: при хроническом течении до 1,3 ± 0,16, при агрессивном – до 1,5 ± 0,2, но при этом значения оставались ниже исходных на 55,2% и 48,5% соответственно.

Динамика индекса Muhlemann у пациентов с генерализованным пародонтитом средней степени представлена в Таблице 7 и на Рисунке 9.

Динамика значений индекса кровоточивости Muhlemann у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита была однотипна, различия между значениями в группах были достоверны в сроки: 1 месяц после МПВТ; 6, 9 и 12 месяцев после хирургического лечения (Таблица 8).

Таким образом, исходные значения индекса кровоточивости Muhlemann у пациентов как с хроническим, так и агрессивным течением пародонтита, были приближены к максимальным. После проведения МПВТ значения индекса кровоточивости резко снижались, а в сроки наблюдения 1 и 3 месяца после хирургического лечения они приближались практически к нулю. В отдаленные сроки (6, 9 и 12 месяцев) значения индекса постепенно повышались, в группе пациентов с агрессивным течением более выраженно, чем с хроническим. Однако несмотря на возрастание значений индекса в срок 12 месяцев они оставались ниже исходных на 43,5% и 55,2% при хроническом течении пародонтита и на 50% и 48,5% при агрессивном.

Таким образом, результаты динамического наблюдения показали, что значения индексов гигиены Silness-Loё и кровоточивости Muhlemann у пациентов обеих групп до лечения были практически максимальными, после проведения МПВТ значения обоих индексов резко снижались. Максимальное снижение индекса Silness-Loё отмечали при хроническом течении пародонтита через 1 месяц после МПВТ, при агрессивном – в срок 3 месяца после хирургического лечения, индекса Muhlemann – в срок 3 месяца после хирургического лечения в обоих группах. В последующие сроки (6, 9 и 12 месяцев) значения обоих индексов постепенно возрастали. В срок 6 месяцев отмечали значительное повышение значений индекса гигиены и кровоточивости в обеих группах, в связи с чем в этот срок всем пациентам была проведена профессиональная гигиена. В срок 9 месяцев значения индекса гигиены стали несколько ниже, а значения индекса кровоточивости при хроническом течении несколько снизились, а при агрессивном напротив – несколько возросли. В срок 12 месяцев значения обоих индексов снова возросли и всем пациентам была повторно проведена профессиональная гигиена. Результаты статистического анализа показали, что у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита достоверных различий между значениями индекса гигиены во все сроки, кроме срока «1 неделя после МПВТ» выявлено не было, однако значения индекса кровоточивости достоверно различались уже в срок 1 месяц после завершения МПВТ и в отдаленные сроки – 6, 9 и 12 месяцев после проведения хирургического лечения. В связи с вышеизложенным можно утверждать, что при агрессивном течении пародонтита, несмотря на одинаковый уровень гигиены, значения индекса кровоточивости повышаются в большей степени, чем при хроническом.

Результаты компьютерной капилляроскопии

При интактном пародонте морфологическая картина микрососудистого русла в области маргинальной десны характеризуется равномерным распределением капиллярных петель в виде «дамской шпильки», располагающихся в основном правильными рядами, верхушки капиллярных петель ориентированы к маргинальной десне; в области переходной складки богатая микрососудистая сеть представлена артериолами, прекапиллярами, посткапиллярами и венулами (Рисунок 23).

Параметрические показатели при интактном пародонте: диаметр капилляров в артериальном отделе (АО) равен 6,5 ± 0,2 мкм, в венозном (ВО) – 8,5 ± 1,6 мкм; линейная скорость кровотока – 689,9 ± 6,8 мкм/с и 624,3 ± 6,2 мкм/с; объемная скорость кровотока – 53770,5 ± 67,1 мкм3/с и 56238,3 ± 61,4 мкм3/с соответственно (Таблица 16).

У пациентов с хроническим течением пародонтита морфологическая картина микрососудистого русла характеризуется структурными и реологическими изменениями во всех зонах десны: в области маргинальной десны число функционирующих капилляров снижено по сравнению с интактным пародонтом, сосудистая стенка атонична и деформирована, просвет сосудов расширен, особенно в венулярном отделе, сильно выражена извитость капилляров; в области переходной складки преобладает спазм артериолярного звена микрососудов, посткапилляры и венулы расширены, капилляры резко извиты, просвет их деформирован, кровоток в венулах носит зернистый характер с признаками внутрисосудистой агрегации эритроцитов (Рисунок 24).

Параметрические показатели гемомикроциркуляции при хроническом течении пародонтита были снижены: диаметр капилляров в АО – 5,3 ± 0,1 мкм, в ВО – 5,2 ± 0,1 мкм; линейная скорость кровотока – 367,5 ± 3,4 мкм/с и 287,7 ± 4,6 мкм/с; объемная скорость кровотока – 29341,6 ± 54,6 мкм3/с и 24683,6 ± 50,8 мкм3/с соответственно (Таблица 16).

У пациентов с агрессивным течением пародонтита морфологическая картина микрососудистого русла также характеризуется структурными и реологическими изменениями: в области маргинальной десны число функционирующих капилляров резко снижено по сравнению с интактным пародонтом, наблюдаются зоны локальных их выключений из кровотока, резко выражена их извитость, стенка и просвет сосудов деформированы; в области переходной складки наблюдается повышенная извитость микрососудов, преобладает спазм их артериолярного звена, посткапилляры и венулы расширены. Отмечается изменение формы капиллярных петель и увеличение числа их перекрутов, усиление извитости капилляров, кровоток в капиллярах приобретает зернистый характер и резко ослаблен (Рисунок 25).

Параметрические показатели гемомикроциркуляции пародонта при агрессивном течении пародонтита были значительно снижены: диаметр капилляров в АО – 4,6 ± 0,1 мкм, в ВО – 4,7 ± 0,2 мкм; линейная скорость кровотока – 338,4 ± 3,8 мкм/с и 261,4 ± 4,3 мкм/с; объемная скорость кровотока –26581,4 ± 55,3 мкм3/с и 23989,7 ± 67,8 мкм3/с соответственно (Таблица 16).

После проведения МПВТ у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита морфологическая картина микрососудистого русла значительно улучшается: в области маргинальной десны количество функционирующих капилляров увеличивается, нормализуется их просвет, исчезает извитость капилляров и деформация их стенки; в области переходной складки исчезают спазм артериол и явления венозного застоя, которые отмечали до лечения, исчезает извитость капилляров (Рисунок 26, 27).

Параметрические показатели у пациентов обеих групп возрастают по сравнению с исходными значениями. При хроническом течении пародонтита диаметр капилляров увеличивается в АО на 7,5%, в ВО – на 28,8%; линейная скорость возрастает на 20,2% и 45,1%, объемная скорость – на 28,1% и 57,9% соответственно. При агрессивном течении пародонтита диаметр капилляров увеличивается в АО на 21,7%, в ВО – на 40,4%; линейная скорость возрастает на 26,5% и 52,1%, объемная скорость – на 34,8% и 57,6% соответственно.

Через 1 месяц после проведения хирургического лечения у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита морфологическая картина микрососудистого русла улучшается по сравнению с картиной после МПВТ: в зоне маргинальной десны отмечали дальнейшее увеличение числа функционирующих капилляров, при этом расположение капиллярных петель приобретает равномерный характер; в области переходной складки отмечали дальнейшую нормализацию артериол и венул: явления спазма артериол и венозного застоя уменьшались (Рисунок 28, 29).

Параметрические показатели в этот срок у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита увеличиваются по сравнению с результатами после МПВТ. При хроническом течении пародонтита диаметр капилляров возрастает в АО на 15,1%, в ВО – на 48,5% по сравнению с исходными значениями; линейная скорость капиллярного кровотока – на 39,5% и 70,2%, объемная скорость – на 48,4% и 89,4% соответственно. При агрессивном течении – диаметр капилляров возрастает в АО на 20,1%, в ВО – на 59,6% по сравнению с исходными значениями; линейная скорость капиллярного кровотока – на 44,7% и 79%, объемная скорость – на 48,8% и 90,9% соответственно.

Через 3 месяца после проведения хирургического лечения у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита отмечается дальнейшее улучшение морфологической картины микрососудистого русла: в зоне маргинальной десны число функционирующих капилляров увеличивается, капиллярные петли приобретают вид «дамской шпильки» и располагаются относительно правильными рядами (как при интактном пародонте), в области переходной складки явления спазма артериол и венозного застоя не обнаруживаются (Рисунок 30, 31).

Параметрические показатели в этот срок у пациентов с пародонтитом увеличиваются по сравнению с предыдущим сроком (1 месяц после хирургического лечения). У пациентов с хроническим течением пародонтита диаметр капилляров увеличивается в АО на 18,9%, в ВО – на 65,4% по сравнению с исходными значениями; линейная скорость капиллярного кровотока – на 61,7% и 95,9%; объемная скорость – на 65,8% и 101,1% соответственно. При агрессивном течении пародонтита диаметр капилляров увеличивается в АО – на 28,3%, в ВО – на 63,8% по сравнению с исходными значениями; линейная скорость капиллярного кровотока – на 52% и 90%; объемная скорость – на 59,9% и 104% соответственно.

Через 6 месяцев после проведения хирургического лечения у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита отмечается ухудшение морфологической картины микрососудистого русла: в зоне маргинальной десны отмечается снижение количества функционирующих капилляров (при агрессивном течении – до локальных выключений капилляров из кровотока), деформация их просвета и извитость; в области переходной складки наблюдается спазм приводящих артериол и расширение венул, вновь появляется извитость капилляров с увеличением числа их перекрутов (Рисунок 32, 33).

Параметрические показатели в этот срок у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита снижаются по сравнению с предыдущим сроком (3 месяца после хирургического лечения), но остаются выше своих исходных значений. У пациентов с хроническим течением пародонтита диаметр капилляров остается выше в АО на 3,8%, в ВО - на 9,6%; линейная скорость капиллярного кровотока - на 7,6% и 19%; объемная скорость - на 14,5% и 29,1% соответственно. При агрессивном течении пародонтита диаметр капилляров остается выше в АО на 6,5%, в ВО - на 8,5%; линейная скорость капиллярного кровотока - на 12,9% и 26%; объемная - на 10,5% и 19,1% соответственно.

Через 12 месяцев после проведения хирургического лечения у пациентов с хроническим и агрессивным течением пародонтита морфологическая картина микрососудистого русла остается практически такой же, как и в предыдущий срок: в зоне маргинальной десны количество функционирующих капилляров снижено (при агрессивном течении до локальных их выключений из кровотока), капилляры извиты, просвет их стенки деформирован; в области переходной складки - спазм приводящих артериол и расширение венул (Рисунок 34, 35).