Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Современный взгляд на этиологию и патогенез пародонтита 17
1.2. Патогенетические основы резорбции альвеолярной кости при развитии воспалительных заболеваний пародонта 21
1.3. Современные модели экспериментального пародонтита 33
1.4. Применение препаратов, регулирующих метаболизм костной ткани, в комплексном лечении больных пародонтитом 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Методология экспериментального исследования 44
2.1.1. Моделирование экспериментального пародонтита на крысах 45
2.1.2. Методы определения эффективности ингибитора RANKL при лечении генерализованного пародонтита 47
2.1.3. Методика определение токсичности ингибитора RANKL на крысах (ЛД50) .49
2.2. Методы исследования 51
2.2.1. Оценка состояния тканей пародонта экспериментальных животных 51
2.2.2. Лабораторные методы исследования 52
2.2.3. Гистологические методы исследования 53
2.2.4. Статистические методы исследования 53
2.3. Клиническая характеристика пациентов и методы исследования 55
2.3.1. Клиническая характеристика пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом 56
2.4. Методология клинического исследования 56
2.4.1. Клинические методы исследования 56
2.4.2. Рентгенологические методы оценки состояния костной ткани челюстей и осевого скелета 60
2.4.3. Лабораторные методы оценки состояния минерального и костного обмена 61
2.4.4. Комплексное лечение патологии пародонта .62
Глава 3. Результаты собственных исследований 64
3.1. Оценка результатов экспериментального моделирования пародонтита на крысах 64
3.1.1. Результаты визуальной оценки состояния тканей пародонта при моделировании пародонтита у крыс 64
3.1.2. Результаты морфологической оценки состояния тканей пародонта при моделировании пародонтита у крыс 69
3.2. Определение эффективности ингибитора RANKL при лечении пародонтита у экспериментальных животных 80
3.2.1. Результаты визуальной оценки состояния тканей пародонта животных при лечении ингибитором RANKL 80
3.2.2. Результаты оценки состояния минерального обмена у животных при лечении препаратом ингибитором RANKL 84
3.2.3. Сравнительная морфологическая оценка состояния тканей пародонта при лечении экспериментального пародонтита 86
3.3. Изучение токсичности ингибитора RANKL в эксперименте (ЛД50) 96
3.3.1. Визуальная оценка состояния экспериментальных животных при определении ЛД50 96
3.3.2. Результаты морфологического исследования токсического действия (ЛД50) препарата ингибитора RANKL на крысах 99
3.4. Клиническая оценка состояния твердых тканей зубов и пародонта у пациентов с агрессивным течением пародонтита 101
3.5. Клиническая оценка состояния твердых тканей зубов и пародонта у пациентов с хроническим течением пародонтита .105
3.6. Рентгенологическая оценка состояния костной ткани челюстей у пациентов c агрессивным и хроническим течением пародонтитом 109
3.7. Состояние минерального и костного обмена у пациентов с агрессивным пародонтитом .115
3.8. Состояние минерального и костного обмена у пациентов с хроническим пародонтитом 121
3.9. Медикаментозная коррекция нарушений минерального обмена в комплексном лечении генерализованного пародонтита 127
Обсуждение результатов 131
Выводы 143
Практические рекомендации 145
Список литературы 146
- Современные модели экспериментального пародонтита
- Клинические методы исследования
- Результаты морфологической оценки состояния тканей пародонта при моделировании пародонтита у крыс
- Рентгенологическая оценка состояния костной ткани челюстей у пациентов c агрессивным и хроническим течением пародонтитом
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
По данным ВОЗ патология тканей пародонта занимает 2-е место в структуре стоматологической заболеваемости и является главной причиной преждевременной потери зубов [Л.А. Мозговая, 2011]. Воздействие пародонтопатогенов на ткани пародонтального комплекса запускает ряд иммунных механизмов. В настоящее время установлена важная роль про- и противовоспалительных цитокинов в регуляции воспаления в пародонте. Прогрессирующую деструкцию костной ткани у больных с заболеваниями пародонта связывают именно с комбинацией цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО и ПГЕ2 [M. Duvina, 2012]. Данные цитокины способны активизировать остеокластогенез и резорбцию кости остеокластами. Однако зависимость между клиническими, морфологическими показателями и медиаторами воспалительно-деструктивного процесса в пародонте изучена недостаточно.
Прорывом в понимании процессов костного ремоделирования стало открытие сигнальной системы, состоящей из рецептора активатора ядерного фактора к (RANK), его лиганда (RANKL) и остеопротегерина (OPG) [I. Silva, 2011]. RANKL является трансмембранным белком, растворимым лигандом и играет ключевую роль в остеокластогенезе, дифференцировке, активации и апоптозе остеокластов [A. Leibbrandt, 2008]. В свою очередь OPG, как естественный рецептор-ловушка для RANKL, конкурирует с RANK за связывание с ним, отдавая приоритет костному образованию [И.А. Скрипникова, О.В. Косматова, 2011].
Нарушения равновесия системы RANK/RANKL/OPG были выявлены при различных остеопатиях, а также при пародонтите. Существенное увеличение содержания RANKL в жидкости пародонтального кармана регистрируется уже на ранних стадиях заболевания. При средней и тяжелой степени хронического генерализованного пародонтита в смешанной слюне определяется высокое содержание специфических маркеров ремоделирования костной ткани –
остеокластактивирующего фактора (RANKL) и остеопротегерина (OPG), отсутствующих в слюне у здоровых лиц [Г.С. Пашкова, 2010]. Полученные результаты исследований наглядно демонстрируют роль системы RANK/RANKL/OPG в развитии пародонтита, дисбаланс в которой может играть важную роль в патогенезе этой патологии.
Сведения о решающей роли RANKL в потенцировании процесса резорбции кости привели к созданию новых лекарственных препаратов, механизм действия которых основан на ингибировании RANKL. Одним из них является новый генно-инженерный препарат - полное человеческое антитело, которое имитирует действие OPG на RANKL, что ведет к повышению костной формации и способствует, в свою очередь, увеличению массы кости [M.R. McClung, 2006].
Являясь перспективным в лечении патологических состояний, сопровождающихся повышенной костной резорбцией, ингибитор RANKL вызывает большой интерес в применении его при генерализованном пародонтите.
Цель исследования
Повышение эффективности лечения генерализованного пародонтита путем клинико-экспериментального обоснования применения антирезорбтивных препаратов в его комплексной терапии.
Задачи исследования
1. Разработать экспериментальную модель пародонтита, позволяющую
изучить морфологические аспекты костного ремоделирования челюстных костей
в условиях хронического пародонтита.
2. Оценить регенераторные возможности остеотропной терапии для лечения
генерализованного пародонтита в эксперименте.
3. Изучить наличие токсического действия антирезорбтивной терапии на
костную ткань челюстей.
-
Провести сравнительный анализ особенностей стоматологического статуса у пациентов в зависимости от характера течения генерализованного пародонтита.
-
Изучить особенности костного ремоделирования у пациентов в зависимости от характера течения генерализованного пародонтита.
6. Сформулировать рекомендации по применению остеотропной терапии в
стоматологической практике при резорбции альвеолярной кости, связанной с
воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта.
Научная новизна исследования
Впервые предложена экспериментальная модель пародонтита на крысах, основанная на снижении активности иммуно-воспалительного ответа. Дана развернутая патоморфологическая оценка состояния альвеолярной кости, периодонта, пульпы и цемента корня зуба при развитии экспериментального пародонтита у крыс. Получен патент «Способ экспериментального моделирования пародонтита».
Впервые изучено остеотропное действие нового генно-инженерного препарата ингибитора RANKL на альвеолярную кость в условиях экспериментального пародонтита у крыс. Доказана его эффективность в отношении снижения скорости резорбции альвеолярной кости. Полученные экспериментальные данные о снижении остеокластической резорбции в альвеолярной кости открывают широкие возможности для практического применения этого препарата.
Впервые получены данные о безопасности применения препарата ингибитора RANKL для челюстных костей. Показано, что десятикратное превышение терапевтической дозы не оказывает негативного влияния на костную ткань челюстей у крыс в условиях эксперимента.
В ходе данного исследования впервые был проведен сравнительный анализ состояния твердых тканей зубов и пародонта у пациентов при агрессивном и хроническом течении генерализованного пародонтита.
Дана оценка состояния костного ремоделирования у пациентов с генерализованным пародонтитом в зависимости от характера течения заболевания, позволившая определить показания для проведения остеотропной терапии в комплексном лечении генерализованного пародонтита.
Теоретическая и практическая значимость работы
Предложена новая модель экспериментального пародонтита, позволяющая воспроизвести данную патологию в максимально короткие сроки, основанная на патогенетических факторах, влияющих на развитие пародонтита у человека.
Проведен подробный анализ патоморфологических проявлений патологических процессов в тканях пародонта на разных стадиях развития заболевания в эксперименте.
На основании проведенных гистологических исследований дана оценка регенераторных возможностей нового генно-инженерного препарата ингибитора RANKL в отношении альвеолярной кости челюстей экспериментальных животных.
Полученные экспериментальные данные о регенераторных возможностях генно-инженерного препарата ингибитора RANKL в отношении челюстных костей могут быть использованы при проведении дальнейших клинических испытаний, которые позволят повысить эффективность профилактики и лечения пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом.
Доказано отсутствие токсического действия нового генно-инженерного препарата ингибитора RANKL на челюстные кости крыс.
У пациентов с различным характером течения пародонтита выявлены особенности клинической картины агрессивного и хронического пародонтита, способствующие совершенствованию дифференциальной диагностики этой патологии.
Определены особенности костного ремоделирования у пациентов с генерализованным пародонтитом, что позволило определить показания для включения остеотропных препаратов в комплексное лечение пародонтита.
Методология и методы исследования
Диссертация выполнена в соответствии с принципами и правилами доказательной медицины.
I ЭТАП. На экспериментальном этапе была разработана специальная модель пародонтита на крысах, отвечающая поставленной цели исследования. Для этого было отобрано 25 самцов крыс породы Wistar весом 396±0,2 гр, которые были разделены на 5 групп по способу моделирования пародонтита.
В основу экспериментальной модели было положено снижение иммуновоспалительного ответа путем трехкратного введения Преднизолона в дозе 12 мг/кг из расчета на вес животного с наложением лигатуры и мягким кормом. Экспериментальное и морфологическое исследование проведено на базе ЦИТО им. Приорова г. Москвы. Животные содержались в соответствии с требованиями ГОСТ Р от 02.12.2009 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)». По окончании эксперимента животных выводили с помощью тиопенталового наркоза, в соответствии с положениями о Европейской конвенции по защите прав позвоночных животных (Таблица 1). Таблица 1. Схема разработки модели экспериментального пародонтита.
25 крыс Wistar, 396±0,2 г.
II ЭТАП. На втором этапе проводилось изучение эффективности остеотропного препарата ингибитора RANKL при лечении экспериментального пародонтита. Для этого было отобрано 24 самца крыс Wistar весом 415±0,3г., которые были разделены на три группы. Использованная в эксперименте дозировка препарата рассчитывалась исходя из стандартной дозы на человека в пересчете на вес животного. Результаты оценивали через 3 и 6 месяцев (Таблица 2).
Таблица 2. Схема изучения эффективности препарата ингибитора RANKL при лечении пародонтита.
III ЭТАП. Третий этап исследования был посвящен определению возможной токсичности препарата ингибитора RANKL. Было отобрано 36 самцов крыс породы Wistarвесом 405,2±0,3г. Животные были разделены на 9 групп по 4 крысы в каждой. Препарат вводили подкожно с повышением дозы кратностью в 0,3 мг/кг, что составляет ЕД50 (терапевтическую дозу для крысы) по методу Литчфилда – Уилкоксона. Период наблюдения за животными составлял 6 месяцев. Каждые 2 недели крыс внешне осматривали с целью регистрации изменений состояния шерсти и кожных покровов, аппетита и двигательной активности, а также состояния полости рта. На каждом этапе экспериментального
исследования проводили забор участков тканей, отвечающих задачам эксперимента, и изготавливали гистологические препараты. Образцы тканей помещали в 10 % забуференный формалин, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Срезы последовательно окрашивали азуром II и парарозанилином (Merck, Darmstadt, Germany). Полученные препараты костной ткани исследовали с помощью микроскопа Olimpus BX-62. Морфометрический анализ проводили с помощью программного комплекса analySIS D (Soft Imaging System, Mnster, Germany) и программы Scion Image 4.0.2 (Scion Corporation).
IV ЭТАП. На клиническом этапе исследования для осуществления
поставленной цели и задач нами обследовано 173 человека.
Пациенты были разделены на группы по возрасту, полу и клиническому диагнозу: 1-я группа - 79 пациентов с агрессивным пародонтитом (средний возраст 35,4±0,68 лет); 2-я группа - 46 пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (средний возраст 46,7±0,6 лет). 3-я группа (контрольная) – 23 пациента (средний возраст 33,1±1,29 лет) и 4-я группа (контрольная) - 25 пациентов (средний возраст 45,4 ±1,3 лет), без признаков воспалительных заболеваний пародонта.
Для клинической оценки состояния твердых тканей зубов и пародонта использовались КПУ и пародонтальные индексы (HI, PBI, GI, CAL, подвижность зубов). Для оценки состояния костной ткани использовали рентгенологический индекс (X-ray index). Состояние минерального и костного обмена оценивали с помощью лабораторных исследований показателей Са общего, Са ионизированного, ПТГ, КТ, остеокальцина, -Cross Laps.
V ЭТАП. Для оценки эффективности остеотропного препарата были
отобраны 37 пациентов (женщин, средний возраст 36,72±1,06 лет; мужчин,
средний возраст 38,19±1,12лет) обоего пола из числа обследованных. После
подписания добровольного согласия пациенты были разделены на две группы: 1-
я группа (17 пациентов) получала в составе комплексной терапии пародонтита
остеотропный препарат ингибитор RANKL. Во 2-й группе (20 пациентов)
проводилось лечение по традиционной схеме. Статистическую обработку данных производили в программе STATISTICA. Для оценки полученных данных в ходе эксперимента определяли среднее и стандартное отклонение, а также дисперсионный анализ в программе ANOVA. Различия значений считались значимыми при доверительной вероятности 0,95 и более (р0,05).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Применение моноклонального человеческого антитела (ингибитора RANKL) способствует усилению процессов регенерации альвеолярной кости за счет снижения количества и активности гистиоцитов и остеокластов при лечении экспериментального пародонтита у крыс.
-
Оценка токсичности моноклонального человеческого антитела (ингибитора RANKL) по методу Литчфилда-Уилкоксона с установленной в эксперименте LD 50 для крыс 3,0531 мг/кг не приводит к патологическим изменениям в костной ткани.
-
В основе костного ремоделирования у пациентов с агрессивным течением пародонтита лежит дисбаланс процессов костной формации и остекластической резорбции, что может являться одним из патогенетических механизмов потери альвеолярной кости.
-
Использование остеотропной терапии в комплексном лечении генерализованного пародонтита позволяет быстрее купировать воспаление в тканях десны, что способствовует замедлению резорбции альвеолярной кости на фоне номализации показателей минерального обмена (Са ионизированный, Са общий и паратиреоидный гормон) у пациентов.
Личный вклад автора
Автором лично проведена работа по клиническому обследованию и лечению 173 пациентов, проведена экспериментальная работа с животными. Все лабораторные исследования были проведены автором лично или при ее непосредственном участии. Анализ полученных результатов был проведен
автором лично. Лично автором проводилась подготовка публикаций по выполненной работе, научных работ по теме диссертации.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Основные положения диссертационного исследования были представлены и обсуждены на совместном заседании кафедр пародонтологии, фтизиатрии и пульмонологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова, патологоанатомического отделения ЦИТО им. Н.Н.Приорова, отделения патоморфологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина (протокол № 9/17 от 11.05.2017). Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXXVI итоговой Конференции молодых ученых МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2014); XXII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2015, конкурс научных работ молодых ученых, III место), Международном Конгрессе Европейской Пародонтологической Федерации EuroPerio 8, (London 2015, постерный доклад).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов, в том числе, 4 работы в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 1- в зарубежном издании, получен патент «Способ экспериментального моделирования пародонтита».
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в практику в учебном процессе на кафедре пародонтологии Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова на занятиях со студентами 4 и 5 курсов дневной и 5 курсов вечерней формы обучения стоматологического факультета и на последипломном уровне с клиническими ординаторами и аспирантами кафедры пародонтологии.
Структура и объем работы
Современные модели экспериментального пародонтита
Исследования на животных моделях обладают целым рядом преимуществ: они позволяют in vivo воссоздавать сложное клеточное взаимодействие, происходящее в организме человека, и обладают большей точностью. Животные модели позволяют проверять гипотезы, относящиеся к каждому из этих этапов; оценивать эффективность модели следует скорее по ее способности подтвердить или опровергнуть определенную гипотезу, нежели по пригодности модели для воссоздания всего хода заболевания в целом. Таким образом, рассмотренные ниже модели могут быть адаптированы для проверки отдельных составляющих патологического процесса, имеющего место при заболевании пародонта, но не обязательно – всех его составляющих.
Животные модели обладают характерными особенностями, которые делают их пригодными для изучения молекулярных механизмов, задействованных в патогенезе заболеваний пародонта.
Для моделирования пародонтита среди лабораторных животных наиболее часто используются крысы, кролики, свиньи, собаки и приматы, каждые из которых имеют свои преимущества и недостатки [21, 115, 182]. Не смотря на различные данные, полученные в экспериментальных моделях на животных, достаточно сложно оценить, насколько полученные результаты идентичны к патологическим процессам у человека. Кроме того, развитие пародонтита у человека зависит не только от устойчивости к микроорганизмам, но также от интенсивности иммуновоспалительного ответа [13, 14, 16, 23].
Моделирование пародонтита у крыс путем наложения лигатуры
Наложение лигатур вокруг зубов использовали для индуцирования заболевания пародонта у самых разных животных: от крыс до обезьян. В последние годы наблюдается особый интерес к экспериментам такого рода именно на крысах. Наложение лигатуры ведет к аккумуляции бактериального зубного налета и появлению микроскопических изъязвлений на эпителии зубодесневой борозды, которые, в свою очередь, облегчают проникновение пародонтопатогенных бактерий в соединительную ткань. У крыс утрата периодонтальной связки и резорбция кости альвеолярного гребня предсказуемо возникают в течение 7-мидней [165, 63, 64, 116, 222], хотя некоторые эксперименты продолжались значительно дольше [178, 90, 142]. Также, как и в случае человека, проникновение бактерий в ткани организма-хозяина считается решающим фактором, влияющим на утрату альвеолярной кости крыс. У стерильных крыс лигатура сама по себе не вызывает значительного воспаления десен и утраты кости [90]. Роль бактерий в инициировании разрушения пародонта в контексте данной модели подтверждается тем фактом, что топическое применение антисептических средств уменьшает резорбцию альвеолярной кости, а системное применение антибиотиков ослабляет утрату периодонтальной связки и резорбцию кости [90, 83, 156].
Данная модель полезна в контексте изучения влияния системных заболеваний на развитие пародонтита. Например, влияние диабета можно исследовать на крысах линии Zucker с ожирением и инсулиннезависимым диабетом [104].
Колонизация поверхности зубов экспериментальных животных пародонтопатогенами
Важным аспектом заболевания пародонта является колонизация поверхности зубов бактериями и проникновение последних в соединительную ткань. Проблема использования грызунов для моделирования пародонтита заключается в том, что бактерии, используемые для индукции патологического процесса, колонизируют полость рта животных лишь временно, поскольку грызуны не являются естественными носителями многих свойственных человеку микроорганизмов. Хорошо задокументированное исключение из этого принципа является инфицирование крыс бактериями Aggregatibacter actinomycetemcomitans. К известным естественным хозяевам A. actinomycetemcomitans относятся люди, мартышкообразные обезьяны, коровы и крысы [93]. Тем не менее, к этому исключению следует относиться с некоторой осторожностью, поскольку многие лабораторные штаммы A. actinomycetemcomitans отличаются «гладким» генотипом и заметно сниженной способностью к адгезии, что резко контрастирует с характеристиками свежих клинических изолятов A. actinomycetemcomitans [94]. Ввиду этого вопрос о пригодности лабораторных бактериальных штаммов остается открытым; в равной степени результаты, полученные с помощью иммортализованных клеток млекопитающих, могут нуждаться в подтверждении с использованием культур зародышевых клеток. Этот аспект хорошо иллюстрирует исследование, в рамках которого способность гладкого штамма A. actinomycetemcomitans инфицировать полость рта оказалась ограниченной по сравнению с недавними клиническими изолятами [92]. Так или иначе, поскольку A. аctinomycetemcomitans колонизируют полость рта крыс в естественных условиях, эту модель можно использовать для выявления важных для колонизации факторов вирулентности [128, 198].
Принудительное введение в полость рта животных штаммов бактерий, свойственных человеку, для изучения влияния этих микроорганизмов на ткани пародонта грызунов применяли в разных исследованиях [171, 183]. В рамках этих экспериментов задействовали различные бактериальные штаммы, связанные с пародонтитом у человека, включая Porphyromonas gingivalis [149, 51, 52, 216], A. actinomycetemcomitans [99], Tannerella forsythia [204] и Treponema denticola [145]. Обычно определенное число бактерий вводят в полость рта мышей или крыс в составе вязкой суспензии – 2 % карбоксиметилцеллюлозы. Во многих случаях инфицирование полости рта бактериями, свойственными человеку, носит у грызунов временный характер. Зачастую для выявления бактерий применяют полимеразную цепную реакцию; этот метод имеет тот недостаток, что выявляемые бактерии не обязательно являются живыми. Бактерии T. denticola находили у мышей через 71 день после инокуляции [145], а P. gingivalis присутствовали в полости рта животных до 11 недель 45 % крыс, инокулированных P. gingivalis, и 80 % животных, инокулированных T. denticola или T. forsythia, демонстрировали присутствие этих бактерий через 4– 6 недель [134, 50].
Данная модель позволяет наблюдать миграцию лейкоцитов (мононуклеаров и нейтрофилов) в соединительную ткань десны, пролиферацию соединительного эпителия, усиление васкуляризации и повышение уровня антител (IgG1 и IgG2) в сыворотке крови в ответ на присутствие пародонтопатогенных бактерий [50]. После инокуляции бактерий наблюдается также повышенный уровень воспалительных цитокинов, включая TNF-, IL-12 и IFN- [98], и пониженный уровень противовоспалительных цитокинов, например, IL-10 [145].
Как и в случае других экспериментальных моделей пародонтита, данную модель необходимо изменять в зависимости от целей исследования. Ее в частности, использовали для подтверждения принципа разработки вакцин и изучения относительного влияния различных антигенов на патогенные бактерии. Например, иммунизация против пептидов гингипаина RgpA и Kgp или интактного гингипаина RgpA уменьшает резорбцию кости, вызванную P. gingivalis [179, 101]. Также эту модель применяли в рамках исследований, цель которых заключалась в установлении формальных связей между пародонтитом, вызванным P. gingivalis, и системными заболеваниями. Например, инфицирование полости рта гиперлипидемических мышей P. gingivalis ускоряет формирование атеросклеротических бляшек [144, 102]; имеющиеся данные заставляют предположить, что этот микроорганизм играет определенную роль в развитии аневризмы аорты за счет механизма, подразумевающего гиперплазию гладкомышечных клеток [220]. Тем не менее, данная модель может иметь ограниченное применение при исследовании ряда важных аспектов пародонтита у человека, например, процесса колонизации и взаимодействия бактерий.
Инъекционное введение липополисахарида (LPS) клеточной оболочки пародонтопатогенов
Грамотрицательные бактерии считаются важными пародонтопатогенными микроорганизмами. Липополисахарид (LPS), компонент клеточной оболочки этих бактерий, является существенным воспалительным стимулом, запускающим реакцию врожденного иммунитета. Таким образом, инъекционное введение LPS в десневую ткань позволяет изучить вопрос о том, как реакция врожденного иммунитета на этот бактериальный компонент индуцирует воспаление и стимулирует остеокластогенез и утрату кости. Данная модель дает гистопатологическую картину, сходную с той, что наблюдается в рамках других моделей, а также при тяжелом пародонтите у человека, характеризируемом усиленной инфильтрацией лейкоцитов, более высоким уровнем воспалительных цитокинов, разложением коллагена и резорбцией кости альвеолярного гребня [84, 176]. Инъекции выполняют под общей анестезией, как правило, трижды в неделю на протяжении экспериментального периода. Утрату альвеолярной кости можно наблюдать уже через 7 дней после начала введения LPS различных микроорганизмов, включая Escherichia coli [74], A. actinomycetemcomitans [169] и Salmonellatyphimurium [84]; это заставляет предположить, что источник LPS может не оказывать существенного влияния на этот результат. Продолжительность большинства исследований, как на мышах [199, 170], так и на крысах – составляла 3 – 8 недель [96, 195].
Клинические методы исследования
Для постановки диагноза: «Генерализованный пародонтит» необходимо присутствие совокупности клинических и рентгенологических признаков, таких как наличие пародонтального кармана, воспалительные изменения в тканях пародонта, подвижность зубов и убыль костной ткани альвеолярного отростка по типу вертикальной или горизонтальной резорбции, которые определяются с помощью различных индексов.
Оценка состояния твердых тканей зубов проводилась по индексу КПУ;
Состояние тканей пародонта оценивали по следующим критериям:
- индексу гигиены (Hygiene Index (HI), Lindhe 1983);
- индексу кровоточивости десневых сосочков (Papilla Bleeding Index (PBI), Saxer&Muhlemann 1975);
а также показателей, включенных в протокол оценки тяжести заболеваний пародонта (NIDCR Protocol for Periodontal Disease Assessment):
- гингивальному индексу (GI) Le, Silness, 1967);
- глубине пародонтальных карманов в мм (record pockets) и потере прикрепления (CAL);
- степени подвижности зубов (Lindhe 1973).
Результаты клинического обследования вносили в разработанную нами карту обследования.
Индекс КПУ рассчитывался по предварительно заполненной зубной формуле. КПУ = К (кариес) + П (пломба) + У (удаленные). Интенсивность кариеса оценивается согласно рекомендациям ВОЗ (1981):
- 0 - 1,5 - очень низкая интенсивность;
- 1,6 - 6,2 - низкая;
- 6,3 - 12,7 - средняя;
- 12,8 - 16,2 - высокая;
- более 16,2 - очень высокая.
Индекс гигиены (Hygiene Index (HI), Lindhe, 1983) позволил оценить количество мягкого зубного налета на 4-х поверхностях каждого зуба. После полоскания полости рта индикатором зубного налета в течение минуты проводился осмотр всех зубов. В схеме отмечались окрашенные поверхности. Зубы мудрости не учитывались.
Гингивальный индекс (GI) Lе, Silness, 1967
Воспалительные изменения в тканях пародонта проявляются, прежде всего, изменением цвета десны и возникновением кровоточивости. Для объективной оценки этих показателей используются различные индексы. Степень воспалительных изменений в тканях пародонта в нашем исследовании оценивалась с помощью гингивального индекса.
Оценочные критерии:
0 - нормальная десна;
1 - незначительная гиперемия, характеризующая легкое воспаление десны;
2 - десна гиперемирована, с синюшным оттенком, имеется умеренный отек;
3 - выраженная гиперемия и отек десны, контуры десневого края изменены, тенденция к спонтанной кровоточивости.
Индекс равен среднему арифметическому суммы всех обследуемых зубов. Однако в ряде случаев цвет и отечность десны не вполне отражают выраженность воспалительной реакции в тканях десны. Кровоточивость десны при зондировании также имеет большое диагностическое значение.
Индекс кровоточивости (SBI) Mhlemann, SSon, 1971
Оценка кровоточивости является одним из наиболее эффективных методов оценки воспалителения в тканях пародонта. После зоднирования пародонтального кармана пуговчатым зондом производилась оценка количества выделившейся крови в течение 20-30 секунд после зондирования.
Критерии оценки:
0 - кровоточивость отсутствует;
1 - единичная кровоточащая точка после зондирования через 20-30 секунд;
2 - тонкая кровоточащая линия или несколько кровоточащих точек по краю десны;
3 - межзубной треугольник заполнен кровью;
4 - профузная кровоточивость.
Расчет индексов производится путем сложения полученных баллов, деленных на количество обследованных зубов.
Измерение глубины пародонтального кармана и потери прикрепления.
Важным критерием оценки деструкции тканей пародонта является измерение глубины пародонтального кармана и степени потери прикрепления. Глубину пародонтального кармана оценивали путём зондирования пародонтальным зондом с ценой деления 2 мм. Зонд помещался в пародонтальный карман параллельно поверхности корня и без давления продвигался до его дна. Глубину пародонтального кармана оприделяли как расстояние от десневого края до дна пародонтального кармана. Измерение проводилось в 6-ти точках в области каждого зуба. Фиксировали наибольшее значение каждого параметра в миллиметрах.
Степень потери прикрепления (CAL) измеряли также пародонтальным зодном, измеряя расстояние от цементно-эмаливой границы до дна пародонтального кармана. Измерение проводили в 6-ти точках в области каждого зуба, фиксируя наибольшее значение параметра в миллиметрах.
Оценка степени подвижности зубов.
Такой показатель, как степень подвижности зубов позволяет оценить тяжесть поражения опорно-удерживающего аппарата зуба. Для определения степени подвижности нами использовалась шкала Lindhe, учитывающая подвижность зубов в вестибуло-оральном направлении.
Критерий оценки:
I - подвижность зуба в вестибуло-оральном направлении в пределах 1 мм;
II - подвижность зуба в вестибуло-оральном направлении более 1 мм;
III - вертикальная подвижность зуба.
Результаты морфологической оценки состояния тканей пародонта при моделировании пародонтита у крыс
I группа. Контроль
Десна представлена собственной пластинкой слизистой оболочки, покрытой многослойным плоским ороговевающим эпителием. Собственная пластинка слизистой оболочки состоит из упорядоченно расположенных относительно тонких коллагеновых волокон с лежащими между ними малоактивными фиброцитами. Здесь же определяется относительно немногочисленные сосуды в виде артериол, венул и капилляров.
Периодонтальная щель вокруг зубов не расширена. В ней видна периодонтальная связка с упорядоченно расположенными коллагеновыми волокнами и фибробластами, сосудами различного калибра (рис. 4). В некоторых участках периодонтальной связки среди коллагеновых волокон выявляются отдельные гистиоциты.
Прилежащая к связке альвеолярная кость без явных признаков резорбции, хотя у отдельных животных обнаруживаются малочисленные лакуны резорбции и расширение костных канальцев. Пульпа зуба обычного строения, можно лишь отметить у отдельных животных увеличение числа сосудов, их полнокровие и признаки стаза крови.
Таким образом, признаков пародонтита в данной группе животных не определяется.
II группа. Животным фиксировали лигатуру на моляр верхней челюсти без введения преднизолона
В мягких тканях десны выявляются признаки умеренно выраженного хронического воспалительного процесса (рис. 5). При этом наблюдается нарушение архитектоники коллагеновых волокон собственной пластинки слизистой оболочки, увеличение клеточности за счет инфильтрации гистиоцитами, хотя так же определяются лимфоциты, отдельные плазматические клетки, нейтрофильные лейкоциты и эозинофилы. Значительно увеличено число сосудов, не имеющих определенной ориентации, наблюдается их расширение и полнокровие, повышение сосудистой проницаемости, о чем свидетельствует отек тканей.
По сравнению с первой группой животных наблюдается незначительное расширение периодонтальной щели (рис. 6), в частности, за счет относительно слабо выраженной резорбции прилежащей альвеолярной кости.Следует отметить некоторые нарушения архитектоники коллагеновых волокон периодонтальной связки, их менее плотное расположение относительно друг друга, а также локальное скопление гистиоцитов. Также отмечается увеличение содержания сосудистых элементов в области периодонтальной связки (см. рис. 32).
По сравнению с I группой животных более выраженна рарефикация альвеолярной кости (рис. 7). При этом альвеолярная кость резорбируется не только со стороны периодонтальной связки, но и со стороны внутрикостных канальцев. Резорбированная кость замещается подверженной фиброзированию соединительной тканью.
III группа. Животным трехкратно вводили преднизолон без фиксации лигатуры на зубах
В данной группе животных по сравнению с первой группой можно отметить усиление воспалительной реакции, что особенно проявляется в мягких тканях десны. При этом можно отметить разрушение коллагеновой стромы собственной пластинки слизистой оболочки, увеличение числа сосудов и клеток воспалительной реакции, в том числе гистиоцитов, а также локальных микроочагов лимфоцитов и плазматических клеток (рис. 8).
В отдельных участках собственной пластинки слизистой оболочки наблюдаются дистрофические изменения коллагеновых волокон с микроочагами (фокусами) распада тканей, тогда как в других отмечается усиленное фиброзирование.
В области периодонтальной связки так же можно отметить локальное скопление гистиоцитов и нарушение ориентации пучков коллагеновых волокон.
Эти изменения более выражены в периодонтальной связке, прилежащей к молярам. Здесь же так же определяются отдельные очаги клеточной резорбции альвеолярной кости со стороны периодонтальной связки.
Явных других отличий альвеолярной кости по сравнению с I группой не выявляется.
IV группа. Крысам однократно вводили преднизолон с фиксацией лигатуры между зубами и обеспечивали соблюдение диеты
В данной группе животных в собственной пластинке слизистой оболочки на фоне выраженного хронического воспалительного процесса наблюдаются признаки фиброзирования. При этом под многослойным плоским ороговевающим эпителием определяются коллагеновые волокна, ориентированные преимущественно вдоль поверхности многослойного плоского эпителия. Среди коллагеновых волокон обнаружены относительно многочисленные сосуды, довольно часто имеющие вертикальную ориентацию.
В отдельных участках собственная пластинка слизистой оболочки по своему строению напоминает грануляционную ткань (рис. 9), что свидетельствует о предшествующем выраженном хроническом воспалительном процессе с последующим распадом ткни и замещением ее новообразованной тканью, типа грануляционной.
Определяются локальные участки скопления гистиоцитов. Особенно выражены периваскулярные гистиолимфоцитарные инфильтраты. По сравнению с ранее описанными группами животных в периодонтальной связке более значительновыражены признаки хронического воспалительного процесса. При этом довольно часто в периодонтальной связке определяются микроабсцессы, представленные скоплением многочисленных распадающихся нейтрофильных лейкоцитов и гистиоцитов (рис. 10).Полностью нарушена архитектоника периодонтальной связки, при этом не определяются характерные пучки фибробластов и коллагеновых волокон. Выявляются лишь гомогенные массы неориентированных пучков коллагеновых волокон (рис. 10), преобладающими клеточными элементами являются гистиоциты, несколько реже нейтрофильные лейкоциты, лимфоциты, плазматические клетки.
В связи с выраженной резорбцией прилежащей к периодонтальной связке альвеолярной кости наблюдается расширение периодонтальной щели (рис. 11). По сравнению с ранее описанными группами отмечается выраженная резорбция альвеолярной кости. В резорбции кости участвуют как многочисленные гистиоциты, так и большое число многоядерных остеокластов. Поверхность кости со стороны периодонтальной связки покрыта многочисленными лакунами резорбции. В них располагаются гистиоциты и многоядерные остеокласты. Резорбция альвеолярной кости происходит не только со стороны периодонтальной связки, но и со стороны внутренних канальцев. При этом можно говорить о рарефикациикости и спонгизации в связи с рассасыванием кости с внутренней стороны канальцев. Внутри просвета расширенных канальцев определяется соединительная ткань с многочисленными гистиоцитами.
Следует отметить, что выраженные фокусы воспаления определяются также и внутри резорбируемой альвеолярной кости, что позволяет говорить о формировании внутрикостных микроабсцессов.
В различных участках исследуемого материала определяется частичная резорбция клеточного цемента с формированием лакун резорбции. В этих лакунах определяются гистиоциты. В отдельных участках компактная альвеолярная кость, благодаря резко выраженным признакам рарефикации и спонгизации напоминает строение губчатой кости.
В пульпе зуба также обнаружены признаки воспалительной реакции (рис. 12), о чем свидетельствует увеличение содержания гистиоцитов, фибробластов, нейтрофильных лейкоцитов.
Рентгенологическая оценка состояния костной ткани челюстей у пациентов c агрессивным и хроническим течением пародонтитом
Для оценки степени резорбции альвеолярного отростка верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти в данной работе нами был использован рентгенологический индекс, отражающий соотношение площади резорбированного пародонта к площади интактного пародонта.
Оценивая полученные данные пациентов с АП и контрольной группы было выявлено, что у пациентов с агрессивным пародонтитом значение рентгенологического индекса (РИ) достоверно выше, нежели в контрольной группе (табл. 18). Это свидетельствует о более выраженной степени резорбции костной ткани у пациентов с АП по сравнению с контрольной группой, в среднем 45,3 % площади интактного пародонта.
Полученные результаты сравнительного анализа показателей РИ (табл. 19), свидетельствуют о более выраженном проявлении резорбции костной ткани у женщин с АП в сравнении с мужчинами с АП (по общему РИ (0,52±0,042 и 0,48±0,022 соответственно p 0,05) и по верхней челюсти (0,42±0,021 и 0,51±0,017 соответственно, p=0,05); по нижней челюсти достоверных различий не было выявлено).При оценке состояния альвеолярного отростка верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти у пациентов с ХГП показатели РИ (0,46±0,013) достоверно выше в сравнении с контрольной группой, что свидетельствует о повышеной резорбции костной ткани альвеолярного отростка и составляет 47,4 % от площади интактного пародонта (табл. 20).Так же при оценке состояния альвеолярного отростка верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти в группе пациентов с ХГП отмечались гендреные различия в РИ (табл. 21). Так женщины с ХГП имели большую общую степень резорбции, чем мужчины (0,53±0,001 и 0,41±0,023 соответственно, p=0,05). При этом различия по РИ нижней челюсти были достоверны, в то время как в данных РИ по верхней челюсти они не достоверны.При сравнении показателей РИ пациентов АП и ХГП достоверных различий нами выявлено не было (табл. 22). Однакоучитывая, что пациенты с АП были в среднем на 12,5 лет моложе пациентов с ХГП, можно говорить о значительно более высоких темпах резорбции костной ткани альвеолярного отростка верхней и нижней челюстей.
На основании проведенной сравнительной оценки состояния альвеолярного отростка верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти в группах пациентов с АП и ХГП, можно выделить ряд особенностей течения АП. Так в данной группе пациентов отмечалась резорбция преимущественно в области жевательной группы зубов и в меньшей степени в области фронтальных, с преобладанием вертикального типа атрофии костной ткани.
Пациент К. 32 года, обратился на кафедру пародонтологии МГМСУ с диагнозом: агрессивный пародонтит. Из анамнеза следует, что пациент наблюдалась у врача-терапевта-стоматолога по месту жительства в течение 7 лет. Ранее проведенное лечение заключалось в снятии зубных отложений и курса антибиотикотерапии. При обращении предъявлял жалобы на кровоточивость десен, подвижность, смещение зубов, оголение шеек зубов, боль при приеме пищи и чистке зубов. Со слов пациента, первые признаки заболевания отмечаются с 22 лет. Наличие общесоматических заболеваний отрицает. Из вредных привычек: эпизодическое курение. Диеты не придерживается, по данным проведенного анкетирования с пищей потребляет недостаточное количество кальция (390 мг/сутки). Результаты осмотра полости рта: слизистая оболочка полости рта бледно-розовая, нормально увлажненная. Скученность зубов во фронтальном отделе. Индекс КПУ – К4,П0,У0. Индекс гигиены (HI)– 86,3 %; индекс кровоточивости (PBI) 2,6; гингивальный индекс (GI) 2,27; подвижность зубов 1,7; глубина пародонтального кармана 7,1 мм, СAL 7,7 мм. Описание рентгенограммы: рентгенологический индекс для верхней челюсти – 34,5 % нижней челюсти – 48,7 %. В области зубов верхней челюсти наблюдается рвномерная резорбция по горизонтальному типу, в области зубов нижней челюсти – резорбция по смешанному типу: в области зубов 4.6, 4.5, 4.2, 3.6 выявляются дефекты костной ткани округлой формы с ровными нечеткими контурами, достигающими верхушек корней.
Пациентка М., 23 года, обратилась на кафедру пародонтологии МГМСУ по направлению из поликлиники по месту жительства с диагнозом агрессивный пародонтит. Пациентка неоднократно обращалась к пародонтологу в течение последних 6 лет. Проводилось снятие зубных отложений, антисептическая обработка и противовоспалительная терапия и удаление подвижных зубов. Кратковременные периоды ремиссии заболевания чередовались с частыми обострениями. Жалобы при обращении: на кровоточивость десен, подвижность и изменение положения зубов, гноетечение из пародонтальных карманов, неприятный запах изо рта, боль при приеме пищи и чистке зубов. Считает себя больной с 15 лет. Наличие общесоматических заболеваний отрицает. Результаты осмотра полости рта: слизистая оболочка полости рта бледно-розовая, нормально увлажненная. Индекс КПУ – К6, П6, У2. Индекс гигиены (HI) – 46,5 %; индекс кровоточивости (PBI) 2,0; гингивальный индекс (GI) 2,2; подвижность зубов – 0,89; глубина пародонтального кармана – 5,21 мм, CAL – 5,93. При пальпации десневого края отмечается холодное гноетечение в области практически всех зубов. Описание рентгенограммы: рентгенологический индекс для верхней челюсти – 74,62%; рентгенологический индекс для нижней челюсти – 39,06 %. Наблюдается выраженная резорбция костной ткани межзубных перегородок по смешанному типу, в области некоторых зубов достигающая верхушек корней. Клинический пример 3
Пациент С., 51 лет, обратилась на кафедру пародонтологии МГМСУ по направлению из частной клиники с диагнозом: хронический генерализованный пародонтит. Со слов пациента ранее он наблюдался у врача-стоматолога-терапевта в течение 7 лет. Проводилось нерегулярное снятие зубных отложений, антисептичекая обработка. Жалобы при обращении: на кровоточивость десен при чистке, оголение шеек зубов, дискомфорт при приеме пищи. Считает себя больным с 40 лет. Из общесоматических заболеваний отмечает язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки в стадии ремиссии. Тренер. Вредных привычек не имеет. Результаты осмотра полости рта: слизистая оболочка полости рта бледно-розовая, нормально увлажненная. Индекс КПУ – К2, П11, У1. Индекс гигиены (HI) 59,3 %; индекс кровоточивости (PBI) – 1,50; гингивальный индекс (GI) – 1,33; подвижность зубов – 0,3; глубина пародонтального кармана – 3,60 мм. CAL – 3,84. Описание рентгенограммы: рентгенологический индекс для верхней челюсти – 44,64 %; рентгенологический индекс для нижней челюсти – 33,56 %. Резорбция костной ткани межзубных перегородок (преимущественно по горизонтальному типу) в основном не превышающая длинны корней.