Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Этиология и патогенез хронического апикального периодонтита 10
1.2 Особенности эндодонтического лечения пациентов с апикальным периодонтитом 12
1.3 Микроорганизмы, ассоциированные с хроническим апикальным периодонтитом 13
1.4 Методы оценки микробного пейзажа корневых каналов 20
1.5 Стоматологические материалы и препараты, применяемые при эндодонтическом лечении зубов на этапе медикаментозной обработки корневых каналов 22
1.6 Современные методы оценки антимикробной эффективности препаратов для дезинфекции корневых каналов зубов 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1 Анкетирование врачей-стоматологов 43
2.2 Материалы и методы клинического исследования пациентов 43
2.3 Материалы и методы экспериментального исследования 49
2.3.1 Определение чувствительности Enterococcus faecalis к материалам для медикаментозной обработки корневых каналов диско-диффузионным методом 49
2.3.2 Модификация экспериментальной модели 50
2.3.3 Материалы и методы оценки антибактериального эффекта препаратов для временной обтурации корневых каналов на основе 1,5% и 2% хлоргексидина и гидроксида кальция по отношению к Enterococcus faecalis в лабораторных условиях 59
2.4. Статистическая обработка полученных результатов 65
Глава 3. Результаты проведенных исследований 66
3.1 Результаты анкетирования врачей-стоматологов 66
3.2 Результаты клинического исследования 69
3.3 Результаты экспериментального исследования 74
3.3.1 Результаты определения чувствительности Enterococcus faecalis к препаратам и материалам для медикаментозной обработки корневых каналов зубов диско-диффузионным методом 74
3.3.2 Результаты модификации экспериментальной модели 81
3.3.3 Результаты оценки антибактериального эффекта препаратов для временной обтурации корневых каналов на основе 1,5% и 2% хлоргексидина и гидроксида кальция по отношению к Enterococcus faecalis в лабораторных условиях 85
Глава 4. Обсуждение результатов 91
Выводы 106
Практические рекомендации 108
Список сокращений 109
Список литературы 110
- Микроорганизмы, ассоциированные с хроническим апикальным периодонтитом
- Современные методы оценки антимикробной эффективности препаратов для дезинфекции корневых каналов зубов
- Результаты клинического исследования
- Результаты оценки антибактериального эффекта препаратов для временной обтурации корневых каналов на основе 1,5% и 2% хлоргексидина и гидроксида кальция по отношению к Enterococcus faecalis в лабораторных условиях
Микроорганизмы, ассоциированные с хроническим апикальным периодонтитом
В работе J.F. Siqueira с соавт. (2007) была проведена идентификация микроорганизмов системы корневых каналов с помощью секвенирования фрагмента гена 16S-рРНК [161]. Для идентификации микроорганизмов корневых каналов используют анализ ДНК или исследование белковых профилей клеточных экстрактов электрофорезом с полиакриламидным гелем. Такие методы надежны только при доступности подходящих проб ДНК. Молекулярно генетические методы изучения корневых каналов позволяют выявить некультивируемые формы микроорганизмов. Основным методом молекулярно генетической идентификации микроорганизмов является анализ последовательности подгрупп 16S-рРНК гена. С помощью этого гена можно определить тип бактерий, семейство, вид и подвид. Для этого проводят выделение нуклеиновых кислот из образцов без предшествующего культивирования. Проводят амплификацию с использованием универсальных праймеров. Полученные данные сравнивают с рибосомальными генными базами данных. Известно, что вирулентность и патогенность микроорганизмов может изменяться в присутствии других видов бактерий. Несмотря на то, что отдельные виды микробиоты корневых каналов, как правило, слабовирулентные, их выживаемость и патогенные свойства находятся под влиянием совокупности факторов, включающих: взаимодействие с другими микроорганизмами в корневом канале с взаимовыгодным существованием, возможность избегать и вмешиваться в действие защитных сил организма.
Важным моментом является наличие у микроорганизмов факторов патогенности, в результате которых возможно сохранение воспалительного процесса [6, 61, 109, 117].
Существуют различные факторы патогенности у бактерий, каждый из которых отвечает за проявление определенных свойств, например, синтез эндотоксинов, хемотаксис и подвижность бактерий, выделение ферментов, разрушающих субстраты слизи, которая покрывает эпителиальные клетки слизистых оболочек, факторы адгезии и колонизации, факторы инвазии, факторы, подавляющие фагоцитоз [6, 152]. Особенно важно учитывать, что степень выживаемости микроорганизмов в корневых каналах определяется, в том числе, выживаемостью в фазе «голодания» при отсутствии необходимого количества питательных веществ [3, 18, 85, 109, 141].
В результате множественных исследований по определению микробного состава корневых каналов при апикальном периодонтите было показано, что основными представителями микробиоты были факультативные и облигатные анаэробы [2, 15, 76, 94, 130, 138, 140]. По результатам исследования J.C. Baumgartner и соавт. (1991) показано наличие преимущественно анаэробных бактерий в апикальной зоне (5 мм) инфицированных корневых каналов в зубах с апикальным периодонтитом [70].
В исследовании De Paz L.E. Chaves с соавт. (2003) исследовано 276 зубов с апикальным периодонтитом, которые ранее подвергались эндодонтическому лечению. При микробиологическом исследовании содержимого корневых каналов образцов до начала лечения были обнаружены грамположительные кокки и палочки в 87% случаях от общего числа исследованных зубов (183 зуба). Спустя 14 дней проводили забор материала из 78 зубов. Наиболее часто встречающимися были бактерии рода Enterococcus spp. и Lactobacillus. Через 14 дней повторили сбор материала из корневых каналов, и в 11 зубах также обнаружили бактерии рода Enterococcus spp. [76].
Следует отметить, что факультативные анаэробы, входящие в состав микрофлоры тонкого кишечника человека, нередко являются распространенным видом микробиоты инфицированных корневых каналов зубов. Так что одним из самых распространенных микроорганизмов в эндодонтически леченых зубах с наличием периапикальных изменений является Enterococcus faecalis [1, 24, 62, 94]. Частота обнаружения данного микроорганизма в зубах с апикальным периодонтитом варьирует от 24% до 77% [25, 139, 164, 171].
В некоторых исследованиях сравнивалась частота обнаружения Enterococcus faecalis в зубах с «первичным» и «повторным» инфекционным процессом. В нескольких работах было показано, что Enterococcus faecalis чаще выявлялся у пациентов с хроническим апикальным периодонтитом в эндодонтически пролеченных зубах, чем в зубах с необработанными корневыми каналами [1, 31, 60, 64, 71, 86, 111, 140, 148, 165, 181]. По результатам культуральных методов идентификации микроорганизмов Enterococcus faecalis был обнаружен в 2-13% случаев в зубах с необработанными корневыми каналами, в 8-71% – в зубах с проведенным эндодонтическим лечением. Между тем, выявление Enterococcus faecalis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) процент выявления составил 5-82% и 10-76% в зубах с незапломбированными и запломбированными корневыми каналами, соответственно [181].
Однако, в некоторых исследованиях Enterococcus faecalis был выявлен с высокой частотой случаев как при «первичном», так и при «повторном» апикальном периодонтите [139]. В работе S. Bouillaguet с соавт. (2018) Enterococcus faecalis был обнаружен в 17-99,9% при «вторичном» апикальном периодонтите [71].
Enterococcus faecalis – это грамположительный факультативный анаэроб [94]. До 1984 года его относили к роду Streptococci: Enterococcus faecalis был известен как Streptococcus faecalis. Энтерококки входят в состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека [151, 165]. В то же время, они являются представителями группы условно-патогенных бактерий, способных вызывать аутоинфекцию, а при накоплении в окружающей среде способны приводить к экзогенному инфицированию.
Важно отметить, что патогенные свойства энтерококков определяются несколькими основными механизмами и связаны в первую очередь с факторами устойчивости к эффекторам иммунитета и так называемым факторам агрессии. Для энтерококков характерна способность аккумулировать и трансформировать экстрахромосомные элементы, кодирующие вирулентность, дающие преимущество в выживании энтерококков при необычных внешних условиях, в стрессовых и неблагоприятных состояниях. Наиболее изученным фактором вирулентности энтерококков является цитолизин – цитолитический токсин белковой природы, обладающий также свойствами бактериоцида и способностью инициировать гемолиз эритроцитов [24, 61].
Наличие определенных генов обуславливает факторы патогенности Enterococcus faecalis. Например, для обеспечения адгезии и колонизации Enterococcus faecalis имеет гены (cps, asa1, 373esp, agg, efaA, ase), которые отвечают за следующие факторы патогенности: капсула, адгезин Еsp, адгезин Asa, фактор агрегации, адгезин EfaA, рецептор коллагена. Для пенетрации, колонизации и повреждения тканей Enterococcus faecalis имеет факторы патогенности: желатиназу, сериновую протеиназу, Fsr-регулятор, гиалуронидазу, цитолизин [24, 55, 61].
Enterococcus faecalis способен выживать как при высокой, так и при низкой концентрации кислорода в окружающей среде. Диапазон температур для роста данного микроорганизма – от 10 до 450С, оптимальная температура роста – 35-370С [151]. Клетки энтерококков полиморфны, преимущественно имеют овальную форму размером 0,6 - 2,0 0,6 - 2,5 мкм, спор не образуют. Хорошо растут на простых и селективных средах. На жидких средах дают диффузный рост, на плотных – образуют мелкие, округлые, выпуклые блестящие колонии, иногда в виде налета. Энтерококки устойчивы к различным факторам внешней среды и выдерживают нагревание до 600С в течение 30 минут, а также устойчивы к высушиванию, действию света и низкой температуре. Данный микроорганизм способен выживать в фазе голодания, фактически при отсутствии питательной среды. Enterococcus faecalis может существовать 6-12 месяцев и формировать моноинфекции в корневых каналах [140].
Enterococcus faecalis имеет способность при неблагоприятных условиях войти в жизнеспособное, но некультивируемое состояние «viable but nonculturable» (VBNC). С помощью электронной микроскопии изучали изменение структуры клеток Enterococcus faecalis в некультивируемом состоянии с клетками в экспоненциальной фазе роста. Было замечено, что изменилась структура цитоплазматической мембраны, однако повреждения отсутствовали. В частности, клетки Enterococcus faecalis в состоянии «VBNC» не могли разлагать лактозу, хотя способность к метаболизму сахарозы не была утрачена. Важным моментом является сохранение способности клеток Enterococcus faecalis в состоянии «VBNC» к адгезии к коллагену I типа, поскольку данная способность является одной из ключевых факторов вирулентности Enterococcus faecalis [85, 117].
Enterococcus faecalis проявляет устойчивость к подавляющему большинству антимикробных препаратов, к действию физических, химических и биологических факторов [3, 5, 10, 12, 89, 94, 150, 151, 153]. Так, например, Enterococcus faecalis способен выживать в щелочной среде, благодаря строению его наружной мембраны, в составе которой имеется «протонный насос», нагнетающий катионы извне через мембрану внутрь клетки против электрохимического градиента, тем самым поддерживая внутриклеточный баланс pH, необходимый для жизнедеятельности бактериальной клетки [3, 89, 94].
Современные методы оценки антимикробной эффективности препаратов для дезинфекции корневых каналов зубов
Особый интерес в изучении микробного состава инфицированных корневых каналов представляют экспериментальные исследования. Благодаря лабораторным исследованиям имеется возможность не только определять состав микробиоты корневых каналов, но и проводить оценку антибактериальной эффективности эндодонтических препаратов и материалов по отношению к различным видам микроорганизмов [6, 86, 101, 120, 130, 161]. Существует множество методов определения как количественного, так и качественного состава бактерий в исследуемом субстрате. Выбор методики исследования образцов определяется показателями, которые должны быть изучены в эксперименте. Например, метод количественной оценки микроорганизмов в образцах поможет определить: число всех микроорганизмов, содержащихся в образце, наличие активных и жизнеспособных микроорганизмов.
В зависимости от способа получения результата, методы определения количества микроорганизмов подразделяют на прямые (микроскопические) и косвенные. В свою очередь, косвенные методы подразделяют в зависимости от применяемого критерия на методы оптического исследования (метод спектрофотомерии), в которых измеряемый параметр зависит от количества микроорганизмов, и на метод высева – это измерение образовавшихся колоний микроорганизмов.
Однако, чтобы рекомендовать стоматологический материал или препарат для медикаментозной обработки корневых каналов к клиническому использованию, необходимо исследовать его эффективность в лабораторных условиях. При этом важной частью лабораторных исследований является оценка влияния препарата на бактерии, находящиеся внутри ДТ. Важной частью в таких исследованиях является подтверждение качественной инокуляции экспериментальных образцов путем оценки наличия жизнеспособных активных бактерий внутри ДТ.
Существует большое разнообразие экспериментальных исследований по оценке антибактериальной эффективности эндодонтических препаратов с использованием экспериментальной модели [98]. Однако дизайны всех изученных ранее экспериментальных исследований значительно отличаются между собой. И сравнивать результаты не представляется корректным.
Важным моментом является понимание того, что в экспериментальных исследованиях используются образцы – зубы, прошедшие предварительную дезинфекцию и стерилизацию в автоклаве. Таким образом, бактерии лишаются питательных компонентов, являющихся субстратом и способствующих их адгезии на поверхности ДТ.
Так, например, существуют различные способы забора материала дентина для оценки бактериального роста и методики определения проникновения бактерий в ДТ: методы микроскопии с использованием оптических, сканирующих электронных и конфокальных микроскопов [121], ДДМ [93, 94, 113, 122, 128], метод спектрофотомерии [68, 94, 118, 129, 167], подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) из исследуемого материала дентина [65, 75, 83, 87, 103, 106, 112, 116, 168].
Метод подсчета колониеобразующих единиц
В подобных экспериментальных работах использование метода подсчета КОЕ предпочтительнее, поскольку он позволяет определить не только количество живых бактерий, но и определить их жизнеспособность и активность. Метод подсчета КОЕ базируется на посеве определенного количества бактерий в виде суспензии на агар. После этого осуществляют подсчет сформированных колоний, имея в виду, что каждая из них является потомством одной жизнеспособной бактерии. Существует две разновидности способа посева: исследуемый образец вносится на агар и перемешивается, или исследуемый образец высевается на поверхностном слое агара.
В таких исследованиях важно учесть все факторы, способные влиять на результат. Бактерии в фазе «голода», даже в планктонном состоянии, проявляют наибольшую устойчивость к дезинфицирующим агентам в сравнении с бактериями в экспоненциальной или стационарной фазе.
Одним из важных факторов, влияющих на устойчивых бактерий к различным антибактериальным препаратам, является способность образовывать биопленки.
В качестве образцов исследователи использовали удаленные человеческие или бычьи зубы [94, 98, 121].
Существенным моментом в экспериментальных работах по оценки эффективности медикаментозной обработки инфицированного дентина необходимо подтверждение степени и глубины инфицирования образцов тест-микроорганизмами.
В работе M. Haapasalo с соавт. (1987) выявлена сложность обсеменения ДТ корней зубов в экспериментальных условиях. Сложность инфицирования была обусловлена различным диаметром ДТ на разных участках зуба. Глубина инфицирования образцов была различной и варьировала от 150 - 200 до 800 - 1000 мкм в зависимости от участка образца. При инфицировании с наружной поверхности, ДТ более узкие, бактерии смогли проникнуть на глубину 150 - 200 мкм [98].
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) является одним из методов оптической микроскопии, обладающей существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света. Методика КЛСМ широко используется в таких областях, как биология, биофизика, медицина, клеточная и молекулярная биология. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной точки объекта. Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера таким образом, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.
Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С помощью КЛСМ можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.
Благодаря КЛСМ появилась возможность получать трехмерное субмикронное расширение объектов, а также значительно расширилась возможность проведения неразрушающего анализа прозрачных образцов. Благодаря использованию в указанных микроскопах в качестве источников света лазеров, достигается повышение их разрешающей способности (рисунок 7).
Лазерные конфокальные микроскопы обладают высоким разрешением, поэтому позволяют исследовать структуру флуоресцентно меченых клеток и даже отдельных генов. Применение всевозможных технологий специфической многоцветной флуоресцентной окраски для биологически активных молекул, а также использование надмолекулярных комплексов дает возможность изучать сложные механизмы функционирования не только отдельных клеток, но и целых систем. Данная технология широко используется в экспериментальной биологии и медицине.
При этом методе окрашиваются клетки с неповрежденной мембраной. Флуоресцентный краситель «SYTO 9» окрашивает клетки в зеленый цвет, йодид пропидия окрашивает ядра погибших клеток в красный цвет, что позволяет подсчитать процент гибели клеток под воздействием облучения [121].
Методика флуоресцентной гибридизации является перспективным методом визуализации микроорганизмов. Для этого проводят фиксацию образцов с последующим введением маркеров во внутриклеточные рРНК. Флуоресцентную микроскопию в сочетании с витальным окрашиванием образцов можно использовать для идентификации различных типов микроорганизмов по морфологическим свойствам и определения их жизнеспособности. С помощью этого метода возможно определить различные клеточные функции: метаболическую и ферментативную активность, целостность клеточной мембраны, синтез нуклеиновых кислот.
Результаты клинического исследования
Всего было обследовано 60 пациентов с диагнозом хронический апикальный периодонтит (K04.5), из них: 15 мужчин и 45 женщин. 86,67% пациентов – в возрасте 20-40 лет, 5% – в возрасте 40-50 лет и 8,33% - старше 50 лет (таблица 2).
Было проведено исследование на наличие Enterococcus faecalis в корневых каналах 60 зубов с хроническим апикальным периодонтитом (К04.5).
При первичном исследовании содержимого корневых каналов Enterococcus faecalis был выявлен в 83,33% случаях. Из них в 74% имелись нарушения коронкового герметизма, 26% – целостные коронковые конструкции.
В 46% случаях обнаружения Enterococcus faecalis корневые каналы не были запломбированы. В 54% эндодонтическое лечение ранее было проведено.
Из 10 зубов, в которых не было обнаружено Enterococcus faecalis, при первичном исследовании в 40% случаев было выявлено нарушение коронкового герметизма, 60% – с целостными коронковыми конструкциями. В 50% – корневые каналы были запломбированы, в 50% было ранее проведено эндодонтическое лечение (таблица 3).
В первое посещение после ирригации корневых каналов число случаев выявления Enterococcus faecalis снизилось до 21,6%.
Во второе посещение пациентов, которым временная обтурация корневых каналов проводилась с использованием суспензии гидроксида кальция, Enterococcus faecalis был обнаружен в 23,33%. После ирригации данный микроорганизм был выявлен в 3,33%.
Во второе посещение пациентам, которым применялся 1,5% хлоргексидин на основе ксантана, до повторной ирригации в содержимом корневых каналов Enterococcus faecalis встречался в 10% случаев. После ирригации данный микроорганизм был выявлен в 0,00% (таблица 4).
Оценка эндодонтического лечения
Спустя 7 дней после временной обтурации корневых каналов зубов проводили клиническую оценку состояния зуба, оценивали его перкуссию по критериям: перкуссия безболезненная, неприятные ощущения при перкуссии, резко болезненная перкуссия. По результатам проведенной оценки было показано, что в 86,67% случаев перкуссия зуба, в котором было проведено эндодонтическое лечение, была безболезненной, в 13,33% – слабо болезненной. Из этого числа болезненность при перкуссии наблюдалась в 17,24% – в группе с гидроксидом кальция на этапе временной обтурации коревых каналов зубов, и в 9,68% – в группе с 1,5% хлоргексидином на основе ксантана.
Динамическое наблюдение
Проводили динамическое наблюдение спустя 6 и 12 месяцев после завершения эндодонтического лечения с использованием рентгенологического метода исследования (таблица 5).
Результаты оценки антибактериального эффекта препаратов для временной обтурации корневых каналов на основе 1,5% и 2% хлоргексидина и гидроксида кальция по отношению к Enterococcus faecalis в лабораторных условиях
Для количественной оценки степени инфицированности образцов проводили подсчет КОЕ на чашках Петри после получения дентинных опилок с глубины 500 мкм. По результатам статистической обработки во всех группах наблюдался рост Enterococcus faecalis (таблица 18).
С помощью критерия Шапиро-Уилка оценивали нормальность распределения значений КОЕ Enterococcus faecalis в группах с использованием ирригационного протокола и без него (таблица 19).
По результатам проводимого исследования было показано, что использование препаратов на основе 2% хлоргексидина и 1,5% хлоргексидина на основе ксантана приводит к статистически значимому снижению количества Enterococcus faecalis в дентинных трубочках (121,4± 48,94 и 116,2±45,1 КОЕ/мл) по сравнению с препаратами на основе гидроксида кальция (218,8±108,22 КОЕ/мл) и контрольной группой (286±73,73 КОЕ/мл).
Апостериорный тест Тьюки показал наличие статистически достоверных различий между группами 1,5%, 2% хлоргексидина и контрольной группой p=0,01 и p=0.013, соответственно (таблица 20).
Статистически значимой разницы между контрольной группой и группой с гидроксидом кальция не выявлено p = 0,49 (таблица 21).
С помощью апостериорного теста Тьюки было показано отсутствие статистически значимой разницы между группами с ирригацией образцов p 0,05 (таблица 22-23).
При сравнении значений КОЕ в группах с ирригацией и без ирригации с помощью t-критерия Вилкоксона были выявлены статистически значимые различия во всех группах р=0,043 (рисунок 24).
На основании экспериментального исследования показано, что использование материалов для временной обтурации корневых каналов без последующей ирригации корневых каналов не обеспечивает антибактериальный эффект против Enterococcus faecalis.
Использование препаратов для временной обтурации и последующей ирригации с использованием 3% гипохлорита натрия и 17% ЭДТА обеспечивает антибактериальную эффективность по отношению к Enterococcus faecalis.