Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Применение стволовых клеток в стоматологии 14
1.2. Особенности стволовых клеток пульпы 21
1.3. Опыт зарубежных исследователей при лечении острого и хронического пульпита на экспериментальных моделях 24
Глава 2. Материалы и методы 29
2.1. Материал исследования 29
2.2. Экспериментальное исследование 29
2.2.1. Экспериментальная модель травматического пульпита у крыс 29
2.2.2. Экспериментальная модель ампутации пульпы премоляров и моляров у миниатюрных свиней 32
2.2.3. Гистологическая проводка парафиновых срезов 33
2.2.4. Гистологическая проводка недекальцинированных шлифов 34
2.2.5. Окрашивание шлифов 34
2.2.6. Микроскопическое исследование и документирование 34
2.3. Создание тканеинженерной конструкции 34
2.3.1. Получение культуры клеток пульпы зуба миниатюрных свиней 34
2.3.2. Создание аллотканеинженерной конструкции 36
Глава 3. Результаты собственных исследований 38
3.1. Выбор биомодели для трансплантации клеток пульпы зуба 38
3.1.1. Экспериментальная модель травматического пульпита у крыс 38
3.1.1.1. Морфология пульпы крыс (группа контроля) 38
3.1.1.2. Морфология пульпы через 4 суток после моделирования травматического пульпита 39
3.1.1.3. Морфология пульпы через 7 суток после моделирования травматического пульпита 40
3.1.1.4. Морфология пульпы через 14 суток после моделирования травматического пульпита 41
3.1.1.5. Морфология пульпы через 30 суток после моделирования травматического пульпита 43
3.2. Экспериментальная модель ампутации пульпы (группа контроля) 44
3.2.1. Нормальное строение пульпы зуба у миниатюрных свиней 44
3.2.2. Ампутация пульпы зуба миниатюрной свиньи (14 суток после ампутации) 46
3.2.3. Ампутация пульпы зуба миниатюрной свиньи (30 суток после ампутации) 47
3.2.4. Ампутация пульпы зуба миниатюрной свиньи (60 дней после ампутации) 49
3.3. Экспериментальное исследование трансплантации клеточной культуры пульпы зуба миниатюрных свиней (основная группа) 51
3.3.1. 14 дней после трансплантации 51
3.3.2. 30 дней после трансплантации 52
3.3.3. 60 дней после трансплантации 54
Глава 4. Обсуждение результатов собственных исследований и заключение 60
4.1. Клеточный трансплантат для регенерации пульпы зуба 60
4.2. Биомоделирование при изучении регенерации пульпы 63
4.3. Регенерация пульпы зуба у млекопитающих и возможности ее стимуляции 65
4.4. Влияние трансплантации аллогенной клеточной культуры с аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмой на периодонт 67
4.5. Заключение 68
Выводы 69
Практические рекомендации 70
Список литературы 71
- Применение стволовых клеток в стоматологии
- Ампутация пульпы зуба миниатюрной свиньи (60 дней после ампутации)
- 60 дней после трансплантации
- Клеточный трансплантат для регенерации пульпы зуба
Применение стволовых клеток в стоматологии
В современной медицинской литературе идет активное обсуждение возможностей применения СК в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [70, 79, 80]. Известно, что клиническая эффективность терапии СК на современном этапе была показана главным образом при аугментации альвеолярного отростка, проводящейся с целью установки зубных имплантатов [16, 41, 44]. Использование стволовых клеток для восстановления и регенерации костной ткани, дентина и даже тканей периодонта открывает широкие перспективы для полноценного восстановления тканей краниофациальной области [33]. В настоящее время подходы, использующие СК для наращивания костной ткани, включают метод тканевой инженерии [4] и метод chair-side (в присутствии пациента) клеточного графтинга. Тканевая инженерия – это создание трехмерных органов при помощи биодеградирующих матриксов, создание органов из нескольких тканей. Использование стволовых клеток, особенно аутологичных, делает возможным выращивание функционирующих органов и хорошее их приживление. К настоящему времени методами тканевой инженерии удалось вырастить полноценный зуб (на крысах); участок сосуда; многослойный имплант кожи; фалангу пальца из кости и хряща [61] . Представляется перспективным обширных костных дефектов тканеинженерных конструктов, состоящих из матриксов с заданной биодеградацией и внешних каркасов из титановых сетей с покрытием цитокинами - активаторами ангиогенеза и стимуляторами костной регенерации. Кроме того, для усиления эффективности любых видов конструкций в клинической практике возможно совместное применение аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, в качестве источника множества регенераторных сигнальных молекул [49]. В рамах обоих методик чаще всего применяют мезенхимальные СК костного мозга, получаемые из гребня подвздошной кости т.к они являются наиболее хорошо описанными и исследованными СК среди клинически доступных СК и, как было показано в ряде работ, обладают выраженным остеогенным потенциалом [15, 107, 143]. R. Schmelzeisen и R. Schimming (2003) в своем пилотном исследовании, включавшем 2 пациентов, впервые доказали целесообразность использования косного трансплантата, полученного при помощи тканевой инженерии из надкостничных СК/остеопрогениторных клеток для аугментации задней части верхней челюсти перед имплантацией (79, 80, 122). В следующем году та же группа ученых продемонстрировала результаты лечения 27 больных, у которых пластинчатая кость сформировалась в течение 3-х месяцев после трансплантации, обеспечивая надежную основу для введения зубных имплантатов [122]. В недавней работе M. Nagata et al. (2012) при использовании гистоморфометрического анализа и компьютерной томографии КТ, было выявлено, что применение культивированных клеток надкостницы с костными частицами и обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) в качестве аутологичного клеевидного трансплантационного материала индуцировало ремоделирование кости, тем самым повышая остеоинтеграцию и снижая время послеоперационного ожидания после установки имплантата [111]. Авторы высказали предположение о том, что имплантированный клеточный материал может служить в качестве источника СК, остеопрогениторных и ангиогенных клеток, а также факторов роста для ускорения регенерации кости. Y. Yamada et al. (2004) продемонстрировали успешную попытку тканевой инженерии альвеолярной костной ткани с одновременным размещением имплантата, применяя гелеобразную смесь мезенхимальных СК костного мозга и PRP (79, 80, 138). В нашей стране проведено исследование экспериментального обоснования применения клеточных технологий при дентальной имплантации и оценки влияния на процесс остеоинтеграции нанесенных на имплантат аутологичных МСК, выделенных из жировой ткани и дифференцированных в остеогенном направлении [46]. Данный коллектив авторов впоследствии сообщил об успешном применении тканевой инженерии при периодонтальной потере костной массы [137], остеопластике альвеолярной расщелины [83] и подъеме дна верхнечелюстной пазухи [137]. Эффективность мезенхимальных СК костного мозга при регенерации костной ткани орофациальной области и установке имплантата также было продемонстрирована, когда СК использовались в комплексе с частицами гидроксиапатита (HA) [106], двухфазным HA / bCP [123], желатиновой губкой [93] и замороженной аутологичной губчатой костью [102]. В дополнение к мезенхимальным СК костного мозга, мезенхимальные СК из жировой ткани в ряде работ показали хороший регенеративный потенциал при восстановлении костной ткани орофациальной зоны и установке имплантата [107]. Применение тканеинженерных конструкций на основе стромальных клеток из подкожной жировой клетчатки и синтетических остеоиндуктивных материалов (ГАП и Коллапан -Г) свидетельствуют о положительном влиянии на сроки заживления операционной раны [27].
Между тем, C. Zizelmann et al. (2007) в своей работе сравнили скорость резорбции костных трансплантатов, полученных методом тканевой инженерии, и аутологичной губчатой кости в верхнечелюстной пазухе через 3 месяца после операции. Авторы сообщают, что трансплантаты, содержащие остеобласты полученные из надкостницы были менее надежны (уровень резорбции 90%), чем аутогенные трансплантаты кости (уровень резорбции 25%) при аугмнтации синуса [146]. В литературе описан другой подход к регенерации костной ткани, который основан на непосредственном использовании свежего клеточного трансплантата, полученного в присутствии пациента (chair-side) [118, 119, 121] или коммерчески подготовленного аллотрансплантата костной матрицы (трупного происхождения), которая содержит нативные мезенхимальные СК [105]. Стоит отметить, что данная процедура являются относительно удобной для врачей, поскольку она не требует применения лабораторных методов или дополнительного обучения [79, 80]. Одним из интересных направлений в тканевой инженерии, в том числе в челюстно - лицевой хирургии, является использование скаффолдов, которые выполняют функцию механического каркаса для клеток. К таким материалам относят натуральные полимеры (коллаген, целлюлоза, фибронектин, хитозан, альгинат и агароза, фиброин), синтетические полимеры (полилактид, полигликолид, полика - пролактон, поливиниловый спирт) и биокерамику (гидроксиапатит, трикальцийфорсфат и биоактивные стекла). Особое внимание в последнее время уделяется инновационным технологиям быстрого прототипирования — процессам формирования трехмерного объекта по цифровой модели, из которых наиболее удобными в применении для биополимеров являются лазерная стереолитография, селективное лазерное спекание, моделирование методом наплавления и 3Д - печать. В процессе получения биоинженерных конструкций на основе скаффолдов (посадке СК на матрицы перед трансплантацией их вместо дефекта) используют биоактивные вещества, индуцирующие остеогенную дифференцировку и привлекающие новые клетки носителя, а также стимулирующие ангиогенез. Данные вещества в основном представлены различными ростовыми факторами [56].
Получены и охарактеризованы культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (SHED – клеток) пульпы молочного зуба человека. Клетки использовали для заселения трехмерных биодеградируемых скаффолдов на основе полилактогликолида, при этом сохранялся их остеогенный потенциал. Имплантация скаффолдов мышам не вызвала негативных реакций со стороны организма реципиента. Эти результаты свидетельствуют о перспективности использования заселенных SHED – клетками полилактогликолидных скаффолдов при создании имплантов для замещения костных дефектов [11].
К тому же, по мнению ряда авторов, биоактивные вещества в идеале должны не только индуцировать остеогенную дифференцировку, но и привлекать новые стволовые клетки носителя, а также стимулировать ангиогенез. В группу данных веществ входят в основном различные ростовые факторы (TGF - p, в том числе и BMP, IGF, FGF, PDGF, VEGF и др.). Системное введение факторов роста обычно является малоэффективным, а иногда и опасным вследствие их короткого времени жизни (особенно в физиологических средах), неизбирательного биораспределения, потенциальной токсичности и риска канцерогенной активности. Таким образом, включение биоактивных веществ в скаффолд решает несколько основных задач: локализованная доставка оптимальной концентрации ростовых факторов внутрь имплантата, сохранение биологической активности молекул, контролируемое высвобождение веществ в течение необходимого периода времени.
Стоит отметить, что включение биоактивных веществ в материал скаффолдов значительно сужает круг методов обработки полимеров в связи с тем, что влияние растворителей и высоких температур оказывает разрушающее действие на биомолекулы.
Рядом авторов представлены клинические примеры применения тканеинженерной конструкции для восстановления костной ткани в области лунок удаленных зубов. Использование данного метода позволило не только предотвратить резорбцию костной ткани, но и воссоздать ее объем [2]. В последнее время предпочтение отдается отечественным биокомпозиционным материалам поскольку они по своим свойствам не уступают зарубежным [34].
Ампутация пульпы зуба миниатюрной свиньи (60 дней после ампутации)
Через 60 суток после ампутации пульпы выявлено, что полость зуба содержит обрывки волокнистых структур с базофильным прокрашиванием. Волокнистые структуры не содержат клеточных элементов. Коронка зуба в целом сохраняет целостность свое структуры, однако в области пломбы могу встречаться сколы. Эмаль часто с темным прокрашиванием в виде узкой полоски вдоль дефекта. Пломбировочный материал закрывает полость зуба (Рисунок 18).
Пародонтальная щель резко расширена. Собственно, пародонт повышенной клеточностью, соединительная ткань с большим количеством фибробластоподобных клеток среди волокнистого матрикса. В некоторых случаях эпителий слизистой оболочки отстоит от шейки зуба с ее оголением и формированием пространства на подобии кармана.
Кортикальная пластинка лунки зуба уплотнена, переходит в губчатое вещество без различимого перехода. В области пародонтальных карманов кортикальная пластинка имеет пластинчатое строение. Губчатое вещество с резко утолщенными костными балками по типу остеосклероза. На поверхности костного матрикса участки отложения остеоида.
Балки костной ткани тела альвеолярного гребня резко утолщены. Костномозговое пространство в непосредственной близости от зуба заполнено волокнистым коллагеновым матриксом, в более глубоких слоях костный мозг представлен желтым костным мозгом с очагами кроветворения.
Корни зуба и шейка зуба с очаговыми признаками остеокластической резорбции. Межкорневая щель иногда содержит пространство по типу полости или кисты, заполненное экссудативной жидкостью. В это пространство выступают очаги грануляционной ткани, за которой могут быть обнаружены островки ретикуло-фиброзной костной ткани. Шлиф премоляра миниатюрной свиньи через 60 дней после ампутации пульпы. Коронка содержит пломбированный канал до полости зуба.
Пульпа отсутствует. Окраска толуидиновым синим и кислым фуксином.
Микроскопия в отраженном свете. Х5
Таким образом, в результате ампутации пульпы резцов, премоляров, моляров регенерация пульпы не происходит. Полость зуба содержит обрывки коллагеновых волокон. Эмаль и дентин часто имеют сколы через 60 дней после ампутации. Начиная с 30 суток происходит прогрессирующее увеличение пародонтальной щели, вплоть до образования карманов.
60 дней после трансплантации
Микроскопическая картина через 60 суток после ампутации пульпы и трансплантации тканеинженерной конструкции, содержащей аутологичные клетки пульпы зуба, имела несколько гетерогенный характер. В одних случаях полость зуба имела признаки регенерации пульпы с образованием ячеистой ткани, отложением дентина, но с признаками асептического коагуляционного некроза. В других случаях было выявлено, что полость зуба содержит ячеистую ткань с хорошей васкуляризаций, зрелой грануляционной тканью и дентинными мостиками под трансплантатом. Формирование дентинных структур наблюдалось не только в области боковых стенок или по типу мостиков, но и в области дна полости зуба. В этих случаях напластование дентина также имело губчатое или ячеистое строение.
Коронка зуба и в том и другом случаях в целом сохраняет целостность своей структуры, однако в области пломбы могу встречаться сколы. Пломбировочный материал закрывал полость зуба (Рисунок 21,22, 23,24).
Пародонтальная щель и в том и другом случае была несколько расширена. Собственно, пародонт был с умеренной клеточностью, соединительная ткань была лишь местами с большим количеством фибробластоподобных клеток. Во всех случаях эпителий слизистой оболочки отстоит от шейки зуба с формированием щели.
Кортикальная пластинка лунки зуба с уплотнена, переходит в губчатое вещество с различимым переходом и в том и другом случае. Губчатое вещество с несколько утолщенными костными балками. Фолькмановы каналы несколько расширены, количество их не велико, имеются признаки отложения остеоида на их внутренних поверхностях (Рисунок 25,26).
Балки костной ткани тела альвеолярного гребня несколько утолщены. Костномозговое пространство в непосредственной близости к пародонту заполнено волокнистым коллагеновым матриксом – пародонтальная связка, в более глубоких слоях костный мозг представлен желтым костным мозгом с очагами кроветворения.
Корни зуба и шейка зуба с очаговыми признаками остеокластической резорбции только в случаях некротических изменений в пульпе зуба.
Таким образом, трансплантация тканеинженерной конструкции, содержащей клетки пульпы, приводит к каскаду процессов, сопровождающихся регенерацией пульпы зуба. На ранних этапах из корневых артерий формируется грануляционная ткань, которая сливается с клеточным трансплантатом. На 14-е сутки полость зуба заполнена грануляционной тканью смешанной с трансплантатом. К 30 суткам исследование отмечается созревание грануляционной ткани, формирование ретикулярной стромы пульпы. Рисунок 21 - Шлиф премоляра миниатюрной свиньи. В полости зуба признаки регенерации пульпы с образованием дентинных мостиков и признаками коагуляционного некроза. Окраска толуидиновым синим и кислым фуксином.
Микроскопия в отраженном свете. Х5
Шлиф резца миниатюрной свиньи. В полости зуба признаки регенерации пульпы в области дна. Окраска небесный трихром. Микроскопия в отраженном свете. Х5
Шлиф резца миниатюрной свиньи. Отложение массива дентина в области дна полости зуба. Окраска небесный трихром. Микроскопия в отраженном свете. Х50
Шлиф резца миниатюрной свиньи. Реорганизация трансплантата. Проникновение внутрь него грануляционной ткани. Окраска небесный трихром Х100
Шлиф резца миниатюрной свиньи. Зрелая грануляционная ткань. Формирование пульпы зуба. Окраска небесный трихром. Х100
Шлиф резца миниатюрной свиньи. Отложение дентина под трансплантатом по типу дентинного мостика. Окраска небесный трихром. Х100 На боковых стенках полости зуба определяются пролиферирующие одонтобласты и наслоения новообразованного дентина. Начало формирования дентинных мостиков. К 60-тым суткам исследования полость зуба заполнена пульпой зуба с выраженным полнокровием. Пломбировочный материал отделен дентинным мостиком. Новообразованный дентин сузил объем полости зуба. Пародонтальное пространство к 60-тым суткам несколько расширено, однако карманы не образуются.
Клеточный трансплантат для регенерации пульпы зуба
В настоящее время в отечественной и зарубежной научной литературе публикуются результаты экспериментальных, доклинических и клинических исследований применения клеточных технологий в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [2, 57, 96]. Если изучению регенерации костной ткани было уделено значительно большее количество работ на протяжении последних двух десятилетий, то к изучению регенерации пульпы и тканей периодонта интерес исследователей возник относительно недавно. Это обусловлено, прежде всего, более поздним обнаружением мультипотентных стромальных клеток в пульпе зуба, а также значительным временным интервалом необходимым на разработку протоколов выделения клеточных культур из пульпы [100, 143]. В свою очередь исследователи столкнулись с проблемой сочетания в культуре нескольких линий стволовых клеток – стромального и одонтобластического ряда [95, 100]. Осуществлялись попытки их раздельного культивирования и использования. В результате проведенных исследований выявлено, что потенциально пригодные для регенерации пульпы зуба клетки могут быть с успехом получены из молочных и постоянных зубов, а так же они могут быть забанкированны в парах жидкого азота для применения в отсроченной перспективе [135]. Клеточные технологии регенерации пульпы зуба развиваются по классическим канонам тканевой инженерии – использование в составе комбинированного клеточного трансплантата материала-носителя, клеточной культуры пульпы зуба, биоактивных молекул [96].
Поскольку современные представления о процессе регенерации в регенеративной медицине диктуют необходимость использования фиксированной к подложке клеточной культуре, то большинство исследователей использовали различные, преимущественно, синтетические материалы в качестве подложки для клеток. Однако, в том числе и отечественный опыт, изучения влияния биосовместимых материалов на течение регенеративных процессов, подсказывает избегать дополнительного источника хронического воспаления в полости зуба. Поскольку полость зуба имеет регидные стенки, а пульпа склонна к быстрому развитию отека, то использование потенциально склонных к поддержанию воспаления инородных тел в составе тканеинженерных конструкций, неоправданно. В свою очередь в качестве замены синтетическим материалам мы использовали аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму, которая ко всему прочему обладает еще набором факторов роста, содержащихся в тромбоцитах, а тонковолокнистые структуры фибрина являются естественной средой для регенерации любой ткани [103]. Таким образом, обогащенная тромбоцитами плазма может служить универсальной подложкой для клеточной культуры пульпы зуба.
Если использование аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы в составе тканеинженерной конструкции имеет выраженные положительные стороны, то выбор клеточной культуры, которая может послужить и источником и стимулятором регенерации требует обсуждения. В фундаментальных научных публикациях по регенерации пульпы зуба имеются указания на выделение мультипотных стромальных клеток из ретикулярной стромы. По своему иммунофенотипу МСК пульпы зуба не имеют принципиальных отличий от МСК прочих источников или перацитов, но в некоторых работах указываются на ряд маркеров, характерных для этой ниши [95, 100]. Вероятнее всего, выявленные особенности позволяют рассматривать МСК пульпы зуба в качестве культуры выбора при создании клеточных трансплантатов для регенерации пульпы.
В работе в составе тканеинженерной конструкции была использована аллогенная смешанная культура клеток пульпы свиньи в сочетании с аутологичной обогащённой тромбоцитами плазмой, которая продемонстрировала свою эффективность при трансплантации в модели ампутации пульпы.
Сопоставляя полученные результаты, следует отметить, отсутствие принципиальных различий с данными, полученными другими исследователями, использовавшими аутологичный трансплантат, так же с обогащенной тромбоцитами плазмой. Вероятнее всего разработанный в работе новый подход к созданию эффективного клеточного трансплантата для стимуляции регенерации пульпы зуба на основе аллогенных стромальных клеток пульпы может иметь потенциально более выгодные позиции по сравнению с аутологичным трансплантатом. Поскольку при клиническом использовании тканеинженерной конструкции для восстановления пульпы зуба могут быть спрогнозированы технические трудности непреодолимого характера, а именно отсутствие аутологичной культуры в момент обращения пациента за стоматологической помощью, поэтому исследование влияния на регенерацию пульпы аллогенной культуры позволило решить эту проблему.
Таким образом, разработка и создание тканеинженерной конструкции для регенерации пульпы зуба возможно как на основе аутологичной, так и аллогенной клеточной культуры, полученной из пульпы зуба. В состав конструкции может быть включены не сами МСК, а стромально-васкулярная фракция, как потенциально более активная и обладающая прогнозируемой дифференцировкой, что было продемонстрировано в нашей работе.