Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Этиология воспалительных заболеваний пародонта 14
1.2 Патогенез 15
1.3 Коллаген: функции, строение, биосинтез
1.3.1 Внутриклеточный механизм распада коллагена 18
1.3.2 Внеклеточный распад коллагена 19
1.4 Матриксные металлопротеиназы. Общая характеристика
1.4.1 Классификация ММП 20
1.4.2 Коллагеназы 20
1.4.3 Желатиназы 23
1.5 Регуляция активности ММП. Тканевые ингибиторы ММП (ТИМП)
1.6 Интерлейкин-1 27
1.7 Фактор некроза опухоли 28
1.8 Анализ изученной литературы 29
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1 Общая характеристика обследованных в группах лиц
2.2 Клинические методы исследования 35
2.3 Лабораторные методы исследования 36
2.3.1 Порядок сбора нестимулированной ротовой жидкости для анализа биологических маркеров
2.3.2 Биохимические лабораторные методы исследования
2.4 Статистические методы исследования 41
Глава 3. Результаты собственных исследований 42
3.1 Содержание ФНО- в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц с интактным пародонтом .
3.1.1 Содержание ФНО- в ротовой жидкости основной и контрольной групп с учетом их пола и возраста .
3.1.2 Содержание ФНО- в ротовой жидкости основной и контрольной групп с учетом тяжести патологического процесса .
3.1.3 Содержание ФНО- в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом степени кровоточивости десны, индексов SBI и OHI-S, глубины пародонтальных карманов
3.2 Показатель ММП-2 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц с интактным пародонтом .
3.2.1 Содержание ММП-2 в ротовой жидкости основной и контрольной групп с учетом пола и возраста пациентов
3.2.2 Содержание ММП-2 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом степени тяжести патологического процесса
3.2.3 Содержание ММП-2 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом степени кровоточивости десны, индексов SBI и OHI-S, глубины пародонтальных карманов
3.3 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости основной и контрольной групп
3.3.1 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости основной и контрольной групп с учетом пола и возраста пациентов .
3.3.2 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом с учетом тяжести и стадии болезни
3.3.3 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим 77 генерализованным пародонтитом с учетом степени выраженности кровоточивости десны, показателей индексов SBI, OHI-S и глубины пародонтальных карманов
3.4 Содержание ММП-9 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и лиц с интактным пародонтом
3.4.1 Содержание ММП-9 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом и в контроле с учетом пола и возраста пациентов
3.4.2 Содержание ММП-9 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом с учетом степени тяжести и стадии патологического процесса
3.4.3 Содержание ММП-9 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом с учетом степени кровоточивости десны, показателей индексов SBI, OHI-S и глубины пародонтальных карманов
3.5 Содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц с клинически интактным пародонтом .
3.5.1 Содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом и в контроле с учетом их пола и возраста
3.5.2 Содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом тяжести заболевания .
3.5.3 Содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом степени кровоточивости десны, показателей индексов SBI, OHI-S и глубины пародонтальных карманов
3.6. Связи исследованных биохимических показателей в ротовой 103
жидкости основной и контрольной групп
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 104 Выводы 113
Практические рекомендации 115
Список литературы
- Матриксные металлопротеиназы. Общая характеристика
- Лабораторные методы исследования
- Содержание ФНО- в ротовой жидкости основной и контрольной групп с учетом тяжести патологического процесса
- Содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц с клинически интактным пародонтом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Среди важнейших проблем современной стоматологии воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Пародонтит является одной из причин разрушения соединительной ткани, резорбции кости и образования пародонтальных карманов, что приводит к патологической подвижности и потери зубов у взрослого населения.
Данные эпидемиологических исследований свидетельствует о неуклонном росте воспалительных заболеваний пародонта у молодых людей. Так, сравнительный анализ состояния пародонта, проведенный при эпидемиологических исследованиях в трех возрастных группах (20-29, 30-44 и старше 60 лет), показал, что в возрасте от 29 до 44 лет только 4-5% людей имеют клинически здоровый пародонт и поддерживают адекватную гигиену полости рта (Орехова Л.Ю., 2004).
Широкая распространенность данной патологии, прогрессирующее течение и недостаточная эффективность лечебно-профилактических мероприятий выделяют проблему лечения воспалительных заболеваний пародонта в одну из наиболее актуальных и значимых как с медицинской, так и социальной точек зрения.
В связи с вышеуказанным изучение механизмов развития воспалительных заболеваний пародонта, характера их клинического течения и прогноза считают весьма актуальной проблемой. При этом, прогнозирование развития заболеваний пародонта исключительно необходимо для ранней диагностики и возможного предупреждения развития пародонтита. Традиционно диагностика заболеваний пародонта основана на данных клинического (зондирование, измерение глубины пародонтальных карманов, определение степени подвижности зубов) и рентгенологического обследования, которые позволяют определить степень тяжести уже развившегося заболевания. Но не всегда возможно определить, каким будет клиническое течение болезни – длительным хроническим или быстропрогрессирующим. Вместе с тем, возможность прогнозирования течения заболевания позволит определить содержание и объем лечебных мероприятий, а
также предупредить обострения пародонтита. В связи с этим, необходим поиск дополнительных диагностических критериев, которые представят информацию о принадлежности пациента к той или иной группе риска, о характере течения заболевания и об эффективности проводимого лечения.
Помимо факторов риска для оценки индивидуального прогноза необходимо выявление биохимических маркеров, степень информативности которых характеризует воспалительный процесс в пародонте у конкретного больного. Эти маркеры, с одной стороны, должны отражать специфические особенности индивида, а с другой – служить прогностическими признаками развития возможной патологии в будущем. Поиск прогностически значимых показателей клинического течения воспалительных заболеваний пародонта тесно связан с ключевыми провоспалительными биохимическими маркерами, по содержанию которых можно судить об активности воспалительных деструктивных процессов в тканях пародонта (Мухамеджанова Л.Р. и соавт., 2003). В связи с этим, особое внимание заслуживает изучение состава слюны и десневой жидкости у больных хроническими воспалительными заболеваниями пародонта (Слободина Е.В., 2008), при этом, установлена важная роль про- и противовоспалительных цитокинов, факторов роста и протеолитических ферментов в регуляции воспаления в пародонтальном комплексе (Rawlinson, 2000; Kamma, 2004; Tervahartiala, 2001). В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает изучение мультигенного семейства матриксных металлопротеиназ (ММП), состоящего из более 30 цинк-зависимых эндопептидаз, субстратами которых помимо большинства компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) могут быть другие протеазы, хемотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоциированные белки, связывающие факторы роста, цитокины, способные разрушать ВКМ в тканях пародонта, поддерживая хронический воспалительный процесс. Продемонстрировано значительное увеличение содержания ММП-1, ММП-2, ММП-3, ММП-9 и активной формы ММП-9 в ротовой жидкости у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта по сравнению со здоровыми людьми с клинически интактным пародонтом (Sguier S. et al., 2001).
Имеются данные, указывающие на высокую информативность показателей ММП-8, ИЛ-1, содержащихся в слюне и коррелирующих с клиническими проявлениями хронических воспалительных заболеваний пародонта (Craig S. Miller et al., 2006). Сочетанное определение концентрации цитокинов и активности ММП в десневой жидкости позволяют всесторонне оценить, как степень выраженности патологических нарушений при наличии заболевания, так и положительные сдвиги в процессе лечения (Патрушева М.С. и соавт., 2012). Однако, несмотря на проводимые исследования, посвященные этому вопросу, роль ММП, провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1) и факторов воспаления (ФНО-), а также их взаимосвязь с клинико-морфологическими показателями в воспалительной деструкции структур пародонта на сегодняшний день изучены недостаточно. Вопросы взаимосвязи этих маркеров с особенностями клинического течения воспалительного процесса и предрасположенностью к развитию пародонтита требуют дальнейшего изучения в целях разработки новых методов диагностики и поиска мишеней для эффективного лечения этой патологии.
Цель исследования
Выявить корреляцию экспозиции маркеров воспалительных процессов с клинической картиной болезни пародонта.
Задачи исследования
-
Провести сравнительную оценку биохимических показателей у лиц с клинически интактным пародонтом и у лиц с воспалительными заболеваниями пародонта с помощью клинических, рентгенологических и лабораторных методов исследования.
-
Выявить взаимосвязь между возрастом и биохимическими показателями у лиц с клинически интактным пародонтом и у лиц с воспалительными заболеваниями пародонта на основе клинических, рентгенологических и лабораторных методов исследования
3. Изучить экспрессию металлопротеиназы-8, металлопротеиназы-9,
металлопротеиназы-2, интерлейкина-1, фактора некроза опухоли (ФНО-) в
ротовой жидкости у лиц с клинически интактным пародонтом и у больных
пародонтитом.
4. Изучить взаимосвязь между экспрессией металлопротеиназы-8, металлопротеиназы-9, металлопротеиназы-2, интерлейкина-1, фактора некроза опухоли (ФНО-) и тяжестью пародонтита.
Научная новизна исследования
Впервые проведен сравнительный анализ содержания трех ключевых коллагеназ - ММП-2, ММП-8, ММП-9, а также провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО- в ротовой жидкости здоровых людей с клинически интактным пародонтом и больных хроническим генерализованным пародонтитом.
Выявлена тесная взаимосвязь между уровнями исследуемых биохимических маркеров воспаления и основными клиническими симптомами и степенью тяжести хронического генерализованного пародонтита, что является наглядным фактом участия выше указанных протеиназ и цитокинов в патогенетических механизмах воспалительного процесса при пародонтите.
Обнаружена достоверная положительная корреляционная связь уровней ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1 и ФНО- в ротовой жидкости с возрастом больных хроническим генерализованным пародонтитом.
Установлено, что уровни ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО- в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом не имеют гендерных различий.
Теоретическая и практическая значимость
В результате проведенного исследования впервые получены данные, позволяющие охарактеризовать взаимосвязь таких маркеров воспаления, как ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО-, и основными клиническими проявлениями заболеваний пародонта.
Определена взаимосвязь между ММП-2, ММП-8 и ММП-9 и степенью тяжести пародонтита, степенью кровоточивости десны и глубиной пародонтальных карманов.
Клинико-лабораторное обоснование взаимосвязи между ММП-2, ММП-8 и ММП-9 и степенью тяжести пародонтита, степенью кровоточивости десны и глубиной пародонтальных карманов позволит повысить эффективность ранней
диагностики воспалительных заболеваний пародонта путем определения наиболее информативных клинико-лабораторных показателей для своевременной коррекции лечения.
Методология и методы исследования
Выполненная работа является комплексным клинико-лабораторным исследованием, связанным с изучением содержания уровней биохимических маркеров воспалительных процессов в ротовой жидкости у больных хроническим генерализованным пародонтитом и их роли в прогрессировании заболевания. Для решения поставленных задач проведена совокупность клинических и биохимических лабораторных методов исследования: анкетирование, осмотр, измерение глубины пародонтальных карманов, определение степени кровоточивости десневой борозды при помощи индекса SBI, определение уровня гигиены полости рта с помощью упрощенного индекса гигиены полости рта по Грин-Вермиллиону, определение биохимических показателей в образцах нестимулированной ротовой жидкости.
Положения, выносимые на защиту
1. Содержание ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1 в ротовой жидкости не
связано с полом, но связано с возрастом обследованных лиц.
-
Содержание ММП-2, ММП-8, ММП-9 в ротовой жидкости достоверно выше у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом, чем у лиц с клинически интактным пародонтом.
-
Содержание ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО- достоверно связаны со степенью тяжести пародонтита, глубиной пародонтальных карманов и степенью кровоточивости десны.
4. Стадию пародонтита (обострение, ремиссия) не отражает ни один из
исследуемых показателей.
Личный вклад автора в получении научных результатов
Автором сделан аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, лично обследовано и проанализировано 79 пациентов (из них 69 человек больных хроническим генерализованным пародонтитом и 10
практически здоровых людей с клинически интактным пародонтом), самостоятельно проведена статистическая обработка полученных во время исследований биохимических данных, на основании которых сделаны выводы и практические рекомендации, написана и оформлена диссертационная работа, опубликованы статьи по теме диссертации.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую деятельность кафедры пародонтологии ГБОУ ВПО «Московский Государственный медико-стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России и кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФДПО ГБОУ ВПО «Московский Государственный медико-стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России.
Апробация диссертации
Результаты работы доложены на заседании кафедры пародонтологии ГБОУ ВПО «Московский Государственный медико-стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России 24 апреля 2015 года.
Объем и структура диссертации
Матриксные металлопротеиназы. Общая характеристика
В 60-70-е годы на первое место была поставлена проблема зубной бляшки и ее роли в развитии воспалительных изменений в пародонте. В настоящее время клинически и экспериментально установлено, что без зубной бляшки развития пародонтита не происходит. Роль микрофлоры, формирующей зубной налет, в развитии заболевания пародонта переоценивалась большое количество раз на протяжении десятилетий. Длительное время (с начала 60-х до середины 80-х годов XX столетия) воспалительные заболевания пародонта рассматривались как следствие неспецифического инфицирования микроорганизмами зубной бляшки (гипотеза о неспецифическом инфицировании налетом). Исходили из того, что пародонтит развивается из-за увеличения количества бактерий зубной бляшки. Эта концепция, получившая название Гипотеза неспецифического зубного налета, уравнивала возможности микроорганизмов в развитии заболеваний пародонта. Сомнение в ее неспецифичности возникли тогда, когда в эксперименте выяснилось, что не у всех подопытных собак, несмотря на увеличение биомассы зубной бляшки, определялся пародонтит. В 1975-1983 годах на первое место вышла гипотеза специфичной микрофлоры зубной бляшки (т.н. специфическая гипотеза налета). Благодаря исследованиям Slots F. (1979), Loesche W. (1992) и др. в полости рта были обнаружены новые микроорганизмы и признано существование пародонтопатогенных бактерий.
Тот факт, что специфические бактерии имеются в полости рта, позволил ввести в 1985 году теорию оппортунистической инфекции.
Сегодня считают, что при определенных формах пародонтита специфичность бактерий стимулируется тем, что находящиеся в зубном налете микроорганизмы развиваются под экзогенным или эндогенным влиянием и вытесняют другие бактерии. Поэтому воспалительные заболевания пародонта теперь рассматривают как оппортунистическую инфекцию, зависящую не только от присутствия патогенных бактерий, но и от среды способствующей их размножению (локальные изменения РН, анаэробная ниша, изменения резистентности организма и др.)
Данная гипотеза нашла свое подтверждение в большом количестве научных исследований.
Согласно критериям S.S.Socransky, разработанным им для характеристики патогенной микрофлоры, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus должны рассматриваться как обязательный этиологический фактор в развитии пародонтита, а Treponema denticola, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens и Eikenella corrodens - в качестве вероятных патогенов. Данная закономерность была подтверждена J.V.Califano et al., 1996; E.E.Machtei et al., 1997; T.Flemmig et al., 1998; B.R.Dorn et al., 1998; Y.Takeuchi et al., 2001; H.Yumoto et al., 2001; A.Sugiama et al., 2002, в их научных работах [27].
Патогенные микроорганизмы, инициируя воспаление в тканях пародонта, выделяют целый ряд факторов вирулентности, которые и оказывают непосредственное влияние на степень тяжести пародонтита и его прогрессирование [27]. Так, способность P.gingivalis к адгезии к поверхности эпителиальных клеток десны, а также к поверхности бактериальных клеток, определяется наличием таких факторов вирулентности как фимбрии, гемоагглютинационный фактор, полисахаридная капсула (A.Huard-Delcourt et al., 1998, Y.Furuichi et al., 2001). А A. аctinomycetemcomitans, в свою очередь, включается в воспалительный процесс в тканях пародонта благодаря выделению лейкоплакина (V.I.Haraszthy et al., 2000, R.Claesson et al., 2002).
Патогенез любого заболевания заключается в ряде биологических и гистологических изменений, которые происходят в тканях, в процессе перехода от здорового состояния к болезни. Понимание патогенеза заболеваний пародонта позволяет клиницисту принять рациональные решения относительно выбора наиболее эффективных методов, направленных на предотвращение распространения болезни или ее лечение.
Наряду с существующими концепциями патогенеза воспалительных заболеваний пародонта («теория бактериальной бляшки», «теория нарушения трофики тканей», «теория аутоиммунных процессов на ткани зуба») в последнее время некоторыми авторами [17, 55] выдвигается «цитокиновая концепция», по которой цитокины играют ведущую роль в развитии постоянно текущего воспаления в пародонте, индуцируемого микробными агентами [23]. При этом пародонтопатогенная флора выступает в роли триггерного (пускового механизма) в патологической активации макрофагов пародонта. Активированные моноциты и макрофаги продуцируют каскад провоспалительных цитокинов, вызывая дисбаланс между их про- и противовоспалительным пулом, что в свою очередь приводит к повреждению тканей пародонта и резорбции костной ткани [14, 55].
Воспаление, являясь одним из ведущих звеньев патогенеза заболеваний пародонта, сопровождается нарушением метаболизма основных компонентов соединительнотканного матрикса — коллагена, протеогликанов и гликопротеинов[36], что является одной из причин разрушения соединительной ткани, резорбции кости и образования пародонтальных карманов и нередко приводит к патологической подвижности и потере зубов. При этом прогрессирующая деструкция тканей является следствием активной секреции в очаг поражения коллагеназы, эластазы, катепсинов и других компонентов гранул нейтрофилов [10]. Такие представители подкласса коллагеназ, как коллагеназа-1 (ММП-1), нейтрофильная коллагеноза (ММП-8) и коллагеназа-3 (ММП-13) являются основными нейтральными протеиназами, которые способны разрушать коллагеновые фибриллы в межклеточном матриксе, и, тем самым играют ведущую роль в деградации коллагенового матрикса.
Воспаление, лежащее в основе большинства патологических процессов, представляет собой сложную реакцию организма, развивающуюся в ответ на повреждающее действие патогенных факторов. С одной стороны, в ходе воспаления происходит максимально быстрая мобилизация биохимических и иммунологических реакций. С другой – при высокой вирулентности возбудителя, а также наличии факторов риска (генетических, иммунологических, экологических), воспалительный процесс становится одной из основных причин патологических изменений в органах и тканях [Белова Л.А.,1997; Насонов Е.Л., 1999; Литвицкий П.Ф., 2002].
Оценка активности системы протеолиза при воспалительных процессах одно из новых и перспективных диагностических направлений, хотя протеиназы являются известной группой ферментов, их биологические функции, механизм действия и клинико-диагностическое значение практически не изучены. До настоящего времени практически не исследована роль семейства ММП и их ингибиторов при воспалении, не определена их связь с белками острой фазы, не установлены особенности макро- и микроэлементного состава при острых и хронических заболеваниях в кардиологии, пульмонологии, ревматологии и стоматологии.
Лабораторные методы исследования
Содержание исследуемых белков (ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО-) определяли в нестимулированной ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и у практически здоровых людей с клинически интактным пародонтом, полученной в соответствии с правилами, описанными выше. Собранную ротовую жидкость разливали на аликвоты по 200-300 мкл в несколько пластиковых пробирок и хранили при -80С до проведения анализа.
Перед началом анализа аликвоты ротовой жидкости размораживали и центрифугировали в течение 2 мин при 5000 об/мин (центрифуга Universal 320R, Hettich Zentrifugen, Германия). Надосадочную жидкость использовали для биохимических иммуноферментных исследований. Определение маркеров в образцах ротовой жидкости больных и практически здоровых людей с клинически интактным пародонтом проводили с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа (табл. 5) в соответствии с инструкциями фирм производителей.
Все использованные наборы реактивов представляют собой классические тест-системы «сэндвичевого» типа для прямого иммуноферментного определения концентрации ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО-. Этапы иммуноферментного определения содержания ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО- в ротовой жидкости
Перед внесением в лунки микропланшет образцы ротовой жидкости пациентов и практически здоровых людей (группа контроля) разводили буферными растворами, поставляемыми в составе соответствующих наборов реактивов (табл. 6)
На первом этапе реакции происходит связывание определяемого белка в ротовой жидкости со специфическими антителами, адсорбированными на поверхности лунок микропланшет.
Одновременно с исследуемыми пробами ротовой жидкости в плашку добавляли 8 калибровочных стандартов. Диапазон концентраций использованных в наборах калибровочных стандартов представлен в таблице 7. Таблица 7 Диапазон концентраций калибровочных стандартов
После 2-часовой инкубации и многократной отмывки (4-кратной - для ММП-2, ММП-8, ММП-9; 3-кратной - для ИЛ-1; 6-кратной - для ФНО-) лунок моющим раствором добавляли второе специфическое антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, которая в дальнейшем будет осуществлять цветную реакцию, необходимую для детекции конкретного маркера.
После повторной инкубации (2 часа - для ММП-8, ММП-2; 1 час - для ММП-9, ИЛ-1, ФНО-) и отмывки плашек добавляли цветной реагент -стабилизированный тетраметилбензидин с перекисью водорода.
Инкубировали пробы в темноте в течение указанного в инструкции времени (30 мин - для ММП-2, ММП-8, ММП-9; 10 мин - для ИЛ-1, ФНО-) и останавливали реакцию, добавляя стоп-реагент: 2N серную кислоту - для ММП-2, ММП-8, ММП-9; 1М фосфорную кислоту - для ИЛ-1, ФНО-.
Измеряли оптическую плотность при 450 нм с коррекцией при 540 нм (для ММП-2, ММП-8, ММП-9) и при 450 нм с коррекцией при 620 нм (для ИЛ-1 и ФНО-).
Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 (Bioek Instruments, Inc., США). Обработку результатов измерений проводили по формуле: Y = a + bX + cX2, где X - концентрация анализируемого белка (нг/мл – для ММП-2, ММП-8, ММП-9; пг/мл – для ИЛ-1 и ФНО-), а Y - оптическая плотность.
Концентрацию ФНО- и ИЛ-1 в образцах ротовой жидкости выражали в пг/мл, ММП-2, ММП-8, ММП-9 - в нг/мл (табл. 7).
Поскольку в большинстве случаев распределение исследованных показателей отличалось от нормального, в статистическом анализе использовали непараметрические критерии: Манна-Уитни при сравнении двух независимых подгрупп, медианный тест или тест Краскелла-Уоллиса при сравнении нескольких подгрупп (оценка роли признака в целом), тест корреляции рангов Спирмена (R) при анализе взаимосвязей между различными показателями. Также использовали регрессионную многофакторную модель Кокса. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программного пакета «Statistica 7.0» (StatSoft Inc).
Обследовали 79 человек: 69 пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом - основная группа, и 10 практически здоровых людей с клинически интактным пародонтом - группа контроля.
Следует отметить, что преобладали пациенты с хроническим генерализованным пародонтитом с кровоточивостью десны при чистке зубов– 55,1% (таб. 8). При этом отсутствие кровоточивости десны обнаружено только в группе больных с легкой степенью тяжести пародонтита (24,1%) и реже со средней тяжестью (4,0%), и только в ремиссии. Напротив, наибольшая степень кровоточивости характерна для больных с тяжелой степенью хронического генерализованного пародонтита (46,7%), ее выявляли только при обострении (рис. 4).
Содержание ФНО- в ротовой жидкости основной и контрольной групп с учетом тяжести патологического процесса
Нами не выявлено статистических различий в содержании ММП-8 в ротовой жидкости в обеих группах между обследованными мужчинами и женщинами (табл. 34).
В основной группе обнаружена прямая достоверная корреляционная зависимость между показателями ММП-8 в ротовой жидкости и возрастом (rs=0,45; p=0,015). Следовательно, чем старше возраст пациентов, тем чаще выявляли высокие показатели ММП-8 в ротовой жидкости (рис. 24).
Рис. 24. Корреляционная зависимость между содержанием ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и их возрастом. 3.3.2 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом с учетом тяжести и стадии болезни
Нами установлена достоверно большая медиана содержания ММП-8 в ротовой жидкости больных при тяжелой степени хронического пародонтита – 1256 нг/мл, тогда как при средней и легкой степени пародонтита медианы ММП-8 были почти в 3 раза ниже – 367 и 325 нг/мл соответственно (табл. 36). Только группа пациентов с тяжелой степенью хронического генерализованного пародонтита достоверно отличалась от контроля по содержанию ММП-8 в ротовой жидкости (р=0,005) (табл. 36; рис. 25).
В то же время, показатели ММП-8 в ротовой жидкости не отражали такой важный клинический признак, как стадия пародонтита (р=0,9) (табл. 37). Таблица 37 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом стадии процесса
Следует отметить, что наименьшие значения ММП-8 выявлены в ротовой жидкости пациентов с легкой степенью пародонтита в стадии обострения (n=11, медиана 198 нг/мл, квартили 129-1158 нг/мл). При обострении хронического генерализованного пародонтита медиана ММП-8 в ротовой жидкости этих пациентов не зависела от степени тяжести болезни, хотя снижалась в ремиссии, по сравнению с обострением патологического процесса (рис. 25).
В общей группе больных корреляционная зависимость между показателями ММП-8 в ротовой жидкости и степенью кровоточивости десны была достоверной (rs=0,36; p=0,002). Однако у больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения выше указанная зависимость усиливалась до значения (rs=0,61; p=0,0006) и ослабевала в стадии ремиссии (rs=0,36; p=0,02).
Следует отметить, что медиана содержания ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим пародонтитом достигала наибольшего значения при уровне индекса SBI равного 5 – 2206 нг/мл (табл. 39; рис. 26). Таблица 39 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом индекса SBI
Медианы ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом показателей индекса SBI.
Корреляционная связь между концентрацией ММП-8 в ротовой жидкости и индексом SBI у больных хроническим генерализованным пародонтитом отсутствовала как в группе в целом, так и при учете стадии патологического процесса.
Уровень ММП-8 в ротовой жидкости больных пародонтитом был достоверно связан с показателями индекса OHI-S (p=0,045). Отметим повышение как медиан, так и нижней и верхней квартили содержания ММП-8 пропорционально индексу OHI-S (табл.40).
Более выраженными были различия в показателях ММП-8 в ротовой жидкости пациентов с учетом глубины пародонтальных карманов (р=0,005) (табл. 41; рис. 27). Корреляционная связь между уровнями ММП-8 в ротовой жидкости и глубиной пародонтальных карманов была достоверной (rs=0,38; p=0,0009) и усиливалась в стадии обострения хронического пародонтита до значения (rs=0,55; p=0,002). Таблица 41 Содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом глубины пародонтальных карманов
Медианы ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом глубины пародонтальных карманов. Многофакторный анализ показал, что уровни ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом преимущественно связаны с тяжестью процесса (р=0,049) и возрастом обследованных пациентов (р=0,019).
Таким образом, содержание ММП-8 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом отражало основной фактор заболевания - тяжесть патологического процесса, степень кровоточивости десны, глубина пародонтальных карманов, показатели индекса OHI-S и может применяться в практической стоматологии в качестве дополнительного параметра контроля эффективности терапии хронического генерализованного пародонтита.
К недостаткам маркера ММП-8 можно отнести слабую его связь с показателя стадии хронического генерализованного пародонтита и возраста пациентов. Содержание ММП-9 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и лиц с интактным пародонтом
Показатель ММП-9 определен в слюне 69 больных хроническим генерализованным пародонтитом (основная группа). В контрольную группу вошли 10 практически здоровых людей. Распределение ММП-9 достоверно отличалось от распределения Гаусса, в качестве центральной меры применяли медиану, в качестве меры разброса - квартили и пределы. При сопоставлении групп применяли непараметрические критерии.
Содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц с клинически интактным пародонтом
Содержание ММП-2, ММП-8 и ММП-9 в ротовой жидкости группы больных хроническим генерализованным пародонтитом было выше по сравнению с группой здоровых лиц с клинически интактным пародонтом. Медианы ММП-2 составили 4,3 и 0 нг/мл соответственно, р=0,012. Медианы ММП-8 составили 446 и 211 нг/мл соответственно, р=0,14. Медианы ММП-9 составили 693 и 303 нг/мл соответственно, р=0,049. При этом в ротовой жидкости обследованных людей группы контроля преобладали (70%) нулевые ММП-2, тогда как их частота у больных пародонтитом стоставила только 17,4% (р=0,003).
Содержание ни одного из исследуемых показателей не было связано с полом, но обнаружена взаимосвязь между содержанием всех показателей и возрастом обследуемых лиц. В группе контроля обнаружена обратная достоверная корреляционная зависимость между показателями ФНО- в ротовой жидкости и возрастом (р=0,024). У обследованных здоровых лиц с клинически интактным пародонтом более старшему возрасту соответствовали меньшие значения ФНО- в ротовой жидкости, тогда как у больных ХГП такая зависимость отсутствовала. С увеличением возраста больных ХГП содержание ММП-2 в ротовой жидкости достоверно повышалось. Медиана ММП-2 была достоверно выше в группе больных в возрасте старше 40 лет и составляла 7,3 против 2,5 нг/мл у больных ХГП до 40 лет, р=0,003. Частота нулевых значений ММП-2 в ротовой жидкости недостоверно снижалась с 25% у больных в возрасте до 30 лет до 11% у больных старше 50 лет. При учете возраста больных обнаружили, что наименьшие значения ММП-2 выявлены у больных легкой степени тяжести пародонтита моложе 40 лет – медиана 2,7 нг/мл, а наибольшие – у больных тяжелой степени старше 40 лет – медиана 15,8 нг/мл. В группе больных ХГП обнаружена прямая достоверная корреляционная зависимость между показателями ММП-8 и возрастом (rs=0,45; p=0,015). В более старшем возрасте пациентов выявили чаще высокие показатели ММП-8 в ротовой жидкости. Нами обнаружена выраженная тенденция к большему содержанию ММП-9 в ротовой жидкости больных старше 40 лет. В ротовой жидкости обследованных старше 40 лет различия медиан ММП-9 в контроле и больных пародонтитом были выраженнее (272 и 1037 нг/мл). Установлена сильная тенденция к большему содержанию ИЛ-1 в ротовой жидкости больных старше 40 лет (382 пг/мл против 266 пг/мл у больных моложе 40 лет, р=0,07).
Стадию заболевания (обострение, ремиссия) достоверно не отражал ни один из исследуемых показателей. Содержание ИЛ-1 в стадии ремиссии было недостоверно ниже, чем в стадии обострения. Медианы содержания ИЛ-1 в ротовой жидкости составили 309 и 352 пг/мл соответственно, р=0,5). Слабо отражало стадию заболевания и содержание ММП-9 (737 нг/мл в стадии обострения и 693 нг/мл в стадии ремиссии, р 0,05).
Проведенное исследование показало, что содержание в ротовой жидкости всех исследуемых показателей - ММП-2, ММП-8, ММП-9, ИЛ-1, ФНО-, достоверно связано со степенью тяжести пародонтита. Установлена достоверно меньшая медиана содержания ФНО- в ротовой жидкости больных при легкой степени тяжести ХГП – медиана 44,7 пг/мл против 87,7 пг/мл при средней степени и 82,6 пг/мл при тяжелой, р=0,02. Наименьшая медиана маркера была установлена в группе больных ХГП легкой степени тяжести пародонтита в стадии ремиссии – медиана 39,0 пг/мл. Установлена достоверно большая медиана содержания ММП-2 в ротовой жидкости больных ХГП тяжелой степени – 14,4 нг/мл. При этом частота нулевых значений была минимальной и составила 6,7% (р=0,18). Наименьшая медиана содержания ММП-2 в ротовой жидкости установлена в группе больных ХГП легкой степени тяжести в стадии ремиссии – 2,7 нг/мл. Установлена достоверная связь содержания ММП-8 с тяжестью пародонтита. Так, при легкой степени тяжести пародонтита медиана содержания ММП-8 составила 325 нг/мл, при средней – 367 нг/мл и при тяжелой – 1256 нг/мл, р=0,005. Наименьшие уровни показателя выявлены у больных до 40 лет с легкой степенью пародонтита – 225 нг/мл, а наибольшие у больных с тяжелой степенью пародонтита старше 40 лет – 3498 нг/мл, что свидетельствует о взаимосвязи значений ММП-8, тяжестью пародонтита и возрастом. Установлена достоверно меньшая медиана содержания ММП-9 в ротовой жидкости больных ХГП легкой степени тяжести - 539 нг/мл, при тяжелой степени медиана ММП-9 была достоверно выше и составила 1629 нг/мл, р=0,032. Показатель ММП-9, также как и ММП- 2 взаимосвязан и с тяжестью и с возрастом пациентов. Так, наименьшие показатели ММП-9 были выявлены у больных ХГП моложе 40 лет с легкой степенью тяжести пародонтита, а наибольшие - у больных ХГП тяжелой степени в возрасте старше 40 лет (417 нг/мл и 1906 нг/мл соответственно. Получены данные, показывающие, что содержание ИЛ-1 в ротовой жидкости также повышалось при увеличении степени тяжести заболевания - с 290 пг/мл при легкой степени тяжести пародонтита до 313 пг/мл при средней степени и до 397 пг/мл при тяжелой степени (р=0,01). Наименьшая медиана ИЛ-1 установлена в группе больных ХГП легкой степени тяжести в стадии ремиссии - 283 пг/мл.
Дальнейший сравнительный анализ взаимосвязи таких факторов воспаления как ФНО-, ММП-2, ММП-8, ММП-9 и ИЛ-1 с основными клиническими проявлениями заболеваний пародонта, показал следующее: все исследуемые показатели достоверно связаны с глубиной пародонтальных карманов. Их медианы достоверно повышались при увеличении глубины пародонтальных карманов. Так, содержание ФНО- достоверно повышалось пропорционально увеличению глубины пародонтальных карманов с 42,4 нг/мл при глубине менее 3 мм до 82,6 нг/мл при глубине 6 мм и более (р=0,046). Нами также было обнаружено, что показатели ММП-2 в ротовой жидкости и глубина пародонтальных карманов были связаны достоверной корреляционной зависимостью (rs=0,58; p=0,0001). Достоверное повышение ММП-2 выявлено при увеличении глубины пародонтальных карманов с 1,9 нг/мл при глубине менее 3 мм до 13,1 нг/мл при глубине от 6 мм и более (р=0,0003). При этом частота выявления нулевых значений ММП-2 снижалась с 29% до 0%. Следует отметить, что концентрация ММП-8 в ротовой жидкости при пародонтите также достоверно связана с глубиной пародонтальных карманов (медианы равнялись 170 нг/мл – при глубине менее 3 мм, 532 нг/мл – при глубине 4-5 мм, 1256 нг/мл – при глубине 6 мм и более, р=0,005). Отмечено также достоверное повышение ММП-9 в ротовой жидкости при увеличении глубины пародонтальных карманов с 383 нг/мл при глубине менее 3 мм до 1303 нг/мл при глубине от 6 мм и более (р=0,017). Обнаружено, что концентрация ИЛ-1 в ротовой жидкости также была достоверно связана с глубиной пародонтальных карманов. Его медиана составила 202 пг/мл – при глубине менее 3 мм, 311 пг/мл – при глубине 4-5 мм, 395 пг/мл -при глубине 6 мм и более, р=0,0008.