Введение к работе
^pTiUV^i ''
Актуальность исследования. Одной из центральных проблем нейрофизиологии на протяжении последних лет является вопрос о молекуляр-но-клеточном механизме сопряжения мембранных и внутриклеточных процессов, лежащем в основе передачи и преобразования информации в мозге, его интегративной деятельности. Подход к решению этой проблемы наметился благодаря обнаруженному в последнее время факту метаболической внутриклеточной регуляции мембранных ионных каналов. Одним из широко исследуемых является механизм регуляции, в основе ко-. торого лежит зависимое от циклического аденозинмонофосфата СцАШ) фосфорилирование каналообразувщих белков. В настоящее вр^мя установлено, что для функционирования Са-каналов плазматической мембраны нервных клеток необходимо наличие во внутриклеточной среде цАМФ в микромолярных концентрациях. Что же касается потенциалозависимых каналов основных токопереносящих ионов, На- "и К-каналов, то вопрос об их метаболическойчрегуляции пока остается открытым. Актуальность > решения этой проблемы определяется значительной ролью указанных ка- ' налов в генерации электрической активности нервных клеток.
Непосредственное участие цАШ в процессах внутриклеточной per гулянии ионной проводимости, по крайней мере кальциевой или Са-эа-висимой, на сегодняшний день не вызывает сомнений. Вместе с тем, следует отметить отсутствие убедительных данных о роли в этих процессах циклического гуанозинмонофосфата СцГЫ<). В связи с этим представляется актуальным исследование зависимости трансмембранных ионных токов от внутриклеточного цГМЙ.
Согласно современным представлениям, следствием повышения концентрации циклических нуклеотидов, вызванного горчрн-рецептор-ным взаимодействием, является фосфорилирование определенных белков. Причем, спектр направлений специфических действий цАЬЙ весьма широк: от экспрессии целого ряда генов до изменения проводимости отдельных мембранных ионных каналов. Столь многообразные проявления эффекта повышения внутриклеточной концентрации цАМФ не могут не вызвать закономерного предположения о возможности непрямого, ' опосредованного внутриклеточными метаболическими процессами, действия цА1Й. Так, нельзя исключить возможности относительно быстрой Св пределах I - 1,5 часов) цА*-!>-индуциро ванной экспрессии определенных генов, кодирую цих каналоформлруіоцие белки или их регулятор-ные субъединицы, что нашло бы отражение в изменении ионной проводимости. С цель?) разграничения прямых, связанных с непосредственным цАМЇ-завіїспмь'м фосфорилнрованігзм компонентой ионных каналов, и опосредованных внутриядерном процессами эффектов цАМФ целесооо-
разно применение ингибиторного анализа в условиях внутриклеточного введения того или иного блокатора синтеза белка с последующей регистрацией, изменений ионных'токов. Вместе с тем, не менее актуальным является вопрос о специфичности эффектов, вызываемых ингибиторами белкового синтеза.
Цель и задачи исследования. Основная цель исследования состояла в изучении роли циклических нуклеотидов в регуляции потенциало-зааисимых ионных каналов плазматической мембраны нейронов.
Конкретными задачами в соответствии с основной целью являлись:
-
Изучение роли цАМФ в регуляции потенциалозависимых натриевых и калиевых каналов плазматической мембраны нейронов.
-
Определение компонентов интегрального тока, чувствительных к действию цГМФ. Исследование амплитудных, кинетических и фармако--логических свойств цГМФ-чувствительного тока.
-
Исследование влияния блокаторов белкового синтеза на трансмембранные ионные токи изолированных нервных клеток.
Научная новизна работы. Впервые показано, что под действием внутриклеточного цШФ происходит повышение потенциалочувствитель-ности натриевых каналов нейрональной мембраны. Обнаружен цШ-чув-ствительный калиевый ток, обратимо и дозозависимо подавляемый при увеличении внутриклеточной концентрации цАМФ. Установлено, что при наличии во внутриклеточном растворе ионов магния (не менее I мЫ) цГМФ оказывает активирующее действие на Са-каналы. Показано, что пуромицин в.концентрациях 10 + 10 М активирует Са-каналы, тогда как 6-азагуанин в тех же концентрациях вызывает их быстрое и необ-р?' :мое блокирование. Обнаружено, что при действии актиномицина Д
ііуроиицина происходит необратимое ингибирование К*-каналов. Пока
зано, что 8-аэагуанин вызывает увеличение времени релаксации К*-ка-
налов, тогда как амплитуда К*-тока при действии этого антибиотика
остается неизменной. > '
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Внутриклеточный цАМФ повышает возбудимость соматической мембраны нейрона.
-
Внутриклеточный цАМФ ингибирует быстро инактивирущиеся ТЭА-чувствительные К*-каналы.
' S. Внутриклеточный цГМФ в присутствии цАМФ, АТФ и ионов магния активирует потенциалозависимые Са-каналы нейрональной мембраны.
-
Внутриклеточное действие как актиномицина Д, так и пуроми-цина характеризуется необратимым ингибированием каналов медленно инактнвируюцегося К*-тока.
-
Внутриклеточное действие как пуромицина, так и 6-азагуанина
на Са-каналы нейрональной мембраны носит неспецифический характер.
Научно-праіітическая значимость,. Большая часть представление в работе данных и выводов имеет теоретическое значение. Они вносят вклад в понимание роли циклических нуклеотидов в регуляции потенци-алозависимых ионных каналов нервных клеток. Установленный нами факт непосредственного участия цАМ5 и цГМ<5 в механизмах регуляции натриевых, калиевых и кальциевых каналов нейрональной мембраны расширяет существующие представления о возможных функциях циклических нуклеотидов в клетке и открывает новые перспективы для дальнейших исследований в этом направлении.
Некоторые результаты могут иметь практическое значение. К та- . ким результатам можно отнести данные, полученные с использованием ингибиторного анализа, позволяющие вскрыть некоторые неелецифичес-кие эффекты антибиотиков, что может найти применение в фармакологии.
Апробация работы. Материалы диссертации долокены на совместных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН СССР, НИИ нормальной физиологии им.П.К.Анохина АМН СССР и ШЛ мозга ВВДВ АМН СССР (Москва, 1965, 1966, IS6?), ' совместной конференции молодых ученых Института фармакологии АМН СССР, НИИ общей патологии и патофизиологии АМН СССР и НИИ нормальной физиологии им.П.К.Анохина АМН СССР (Москва, март, І9&6), заседании Московского физиологического общества (январь, 1987), на итоговых сессиях НИЛ нормальной физиологии им,П.К.Анохина АМН СССР (январь, 19Ьб; январь, I9L7), на УП Всесоюзном семинаре ''Развитие общей теории функциональных систем" (Москва), 1&Ьб), на ХУ съезде Всесоюзного физиологического общества им.И.Я.Павлова при АН СССР (Кишинев, сентябрь, 19ь7), на X Всесоюзной конференция по биохимии нервной системы (Горький, октябрь, 19Ь7), на международной школе-семинаре молодых ученых "Обучающийся мозг" (Репино, декабрь, 19Ь7), на международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси, ноябрь, 19Ь9). Диссертация апробирована на совместном заседании отдела системных 'Механизмов целенаправленного поведения, лаборатории молекулярной нейрофизиологии и биохимии и кафедры нормальной физиологии 1-го ЬШ. им.И.М.Сеченова 28.декабря 1969г.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста. Диссертация содержит 9 рисунков и состоит иJ введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, который вкл-счает 225 источников, ис них 93 отечественных и 132 зарубежных.