Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема регуляции синаптической передачи на протяжении многих лет привлекает к себе пристальное внимание исследователей. Особый интерес вызывают механизмы регуляции функционального состояния нервной терминали, обеспечивающие высокую надежность нейросекреторного процесса [Матюшкин, 1973, 1975, 1980; Полетаев, 1974; Прозоровский, 1980; Starke, 1981, 1986; Gothert, 1985].
Сегодня совершенно ясно, что без глубокого понимания закономерностей функционирования пресинаптических регуляторних систем невозможно постичь механизмы таких физиологических процессов, как память и обучение, представить патогенез многих заболеваний нервной и мышечной систем, создавать фармакологические препараты, избирательно воздействующие на передачу информации в синапсе CKandel, Spencer, 1968; Castellucci, Kandel, 1974; Прозоровский, Саватеєв, 1976; Глебов, Крыжановский, 1978; Голиков и соавт., 1985].
Одним из механизмов, контролирующих освобождение медиатора, является активация пресинаптических ауторецепторов СПАР) - рецепторов, расположенных на нервных окончаниях, активация которых медиатором ваи его экзогенными аналогами модифицирует нейросекрецию КШе, 1960; Eccles, 1963]. Физиологическая роль ПАР наиболее изучена в синапсах ЦНС [Starke, 1979; Timmermans, 1987; Годухин, 1987] и синапсах, образованных вегетативными волокнами [Brown, Gillespie, 1937; Langer, 1974, 1979],
Значение ПАР двигательных нервных окончаний позвоночных изучено значительно слабее, несмотря на то, что именно благодаря экспериментам на этом объекте и возникла сама идея о способности ацетил-холина САХ), освобожденного в синаптическую щель, модулировать выход последующих его порция IMasland, Wighton, 1940; Feng. Li, 1941 ]. Одной из причин недостаточности сведений о роли ПАР в нервно-мышечной системе является наличие в литературе большого количества противоречащих друт другу данных, полученных при иссяедовании пресинаптических эффектов различных холинергических агентов на процессы спонтанного и вызванного освобождения медиатора. Так, согласно ряду данных [Ciani, Edwards, 1963; Hubbard, Yokota, 1964; Duncan, Publicover, 1979], в присутствии веществ, активирующих хо-линорецепторы СХР), секреция квантов медиатора угнетается, по мнению других исследователей [Galindo, 1971; Miyamoto, Voile, 1974] -
она усиливается, а по наблюдениям некоторых авторов tCastillo, Katz, 1954, 1955; Ito, 1967; Hubbard, Willis, 1963, 1958; Kalsner, 19853 - не изменяется. Даже среди исследователей, описывающих угнетение квантовой секреции под действием АХ и его аналогов, не существует единства мнений о свойствах ХР, опосредующих эти эффекты: если одни [Ciani, Edwards, 1963; Hubbard, Schmidt, Yokota, 1965; Gun-dersen, Tenden, 1980] связывают пресинаптическое действие холиноюі-метиков С ХМ) с активацией никотиновых ХР СНХР), то другие [Duncan, Publicover, 1979; Abbs, Joseph, 1981; Kilbinger, Krueb, 1981J приводят факты, свидетельствующие об участии в этих процессах мускари-новых ХР СМХРЗ. Более того, до настоящего времени широко распространено мнение, что влияние ХМ на освобождение медиатора может быть объяснено и без привлечения представления о ПАР. В частности, L. Fritz и A. R. Gardner-lfedwin С1976) и В. Katz С1977) полагают, что изменение нейросекрецгш при действии ХМ возможно вследствие ионных и метаболических сдвигов в околосинаптической области, сопровождающих активацию постсинглтической мембраны.
Ничего пе известно о возможности модуляции системой ПАР неквантового освобождения медиатора- процесса, посредством которого освобождается основное количество трансмиттера в покое [Katz, Miledi, 1977; Vy^kocil, Illes, 1977), точно не определена роль ПАР в развитии нервно-мышечного блока, наступающего при введении в организм миорелаксантов деполяризующего типа действия, антихолинестеразных препаратов. И, наконец, что представляется особенно важным для оценки физиологического-значения ПАР, экспериментально не доказана способность эндогенного медиатора оказывать влияние на нейросекре-цию и функциональное состояние синапса в целом при интактной аце-тилхолинестеразе САХЭ).
Цель и основные задачи исследования. Цель настоящей работы -изучить роль АХ в процессах ауторегуляции функционального состояния мионеврального синапса и выяснить механизмы реализации этих регуляторних влияний на все формы секреции медиатора.
Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Исследовать возможность модуляции процесса квантового Сспо-нтанного и вызванного) и неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний холоднокровных и теплокровных животных экзогенным АХ и его аналогами через ПАР.
-
Выяснить, не являются ли пресинаптические эффекты АХ л других ХМ результатом действия этих агентов не непосредственно на нервное окончание, а следствием активации постсинаптической мембраны мышечного волокна.
-
Выяснить природу и свойства ПАР, раскрыть механизм Влияния ПАР на интенсивность освобождения медиатора. Оценить возможность воздействия холиношшетиками на двигательное нервное окончание минуя ПАР.
-
Определить скорость удаления из синаптической щели АХ, ос-ьобоадешюго в ходе предшествующей активности, в условиях ннгьбиро-ваиной и интактнои АХЭ. Оценить возможность накопления эндогенного АХ в синаптической щели в концентрации, достаточной для осуществления модуляции освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний.
-
Экспериментально проверить возможность регуляции квантовой секреции медиатора из нервных окончаний эндогзнным АХ.
-
Сформулировать общее представление о роли ПАР в функционирований нервно-мышечного синапса в физиологических условиях и реализации эффектов фармакологических и токсических агентов.
Научная новизна работы. Впервые доказано, что действие АХ и других ХМ на квантовое освобождение медиатора в синапсах холоднокровных и теплокровных не обусловлено ионными и метаболическими сдвигами, сопровождающими активацию ХР концевой пластинки, а являются результатом прямого влияния ХМ на двигательные нервные окончания. Установлено, что пресинаптическое действие АХ на вызванную секрецию медиатора связано с активацией ПАР, приводящей к укорочению длительности потенциалов действия нервных окончаний її уменьшению входящего кальциевого тока. Показано, что сила пресинаптического действия ХМ на квантовую секрецию зависит от исходного функционального состояния терминалей: снижение квантового состава Cm) потенциалов концевой пластинки СПКГО под влиянием ХМ было более выражено в синапсах, характеризующихся высоким исходным уровнем квантового освобождения. Впервые экспериментально доказано, что происходящие под влиянием экзогенных ХМ изменения секреции медиатора являются не фармакологическими феноменами, так как аналогичные изменения освобождения вызывает и эндогенный АХ, выделяющийся при раздражении нерва и угнетающий по принципу отрицательной обратной связи секрецию последующих порций медиатора. Установлено, что ПАР нервных окончаний
относятся к ХМ никотинового типа, отличающихся от аналогичных ХР постсинаптической мембраны тем, что при длительном контакте с ХМ в них не развивается процесс десенситизации. Впервые показано наличие на нервных терминалях теплокровных ХР, возбуждение которых увеличивает проницаемость пресинаптической мембраны для ионов кальция в условиях покоя.
Установлено, что в условиях нормальной ионной среды в синапсах крысы ХМ угнетают спонтанную секрецию квантов АХ. Этот эффект имеет место лишь в узком температурном диапазоне, соответствующем температуре теплового ядра животного. Аналогичное угнетающее действие ХМ на частоту миниатюрных ПКП Cf МПКП) отмечено и у лягушки, где оно регистрируется в широком температурном диапазоне. Показано, что ре-гуляци спонтанной секреции медиатора не связана с активацией ПАР, . управляющих ионными каналами или ферментными системами.
Приоритетными являются данные о том, что процесс неквантового освобождения медиатора также может модулироваться ХМ. Эта модуляция не связана с актисацией ПАР. Доказано, что неквантовое освобождение - активный транспортный процесс, роль переносчика АХ в котором играет, видимо, транспортная система холина, высокого сродства. Установлено, что АХ, выделяющийся неквантовым путем, участвует в контроле вел-тчины мембранного потенциала мышечного волокна в области концевой пластинки.
Сформулирована концепция, согласно которой в многоконтурной системе химической саморегуляции синаптической функции существенная роль принадлежит АХ, реализующему свои влияния на нервные окончания ' через разные механизмы.
Положения, выносимые на защиту.
-
АХ и его аналоги в мионервальцых синапсах холоднокровных и теплокровных путем прямого влияния на двигательные нервные окончания способны модулировать, интенсивность как квантового, так и неквантового освобождения медиатора, используя для реализации этих влияний как систему ПАР, так и нерецепторные механизмы контроля синтеза и секреции медиатора.
-
Пресинаптические ауторецепторы в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных осуществляют угнетение вызванного освобождения медиатора. Они представляют собой ХР никотинового типа, которые управляют ионной проницаемостью пресинаптической мембраны и
характеризуется высокой чувствительностью к ХМ и низкой способностью к развитию десенситизации.
-
Угнетающее влияние АХ и его аналогов на спонтанную секрецию квантов медиатора в синапсах теплокровных и холоднокровных при физиологических температурах не обусловлено ПАР, а связано с непосредственным изменением физико-химических свойств прескнаптической мембраны.
-
Влияние АХ на неквантовое освобождение медиатора в нервно-мышечных синапсах осуществляется без использования пресинаптических ХР. Неквантовое освобождение холинергического медиатора - процесс активного транспорта молекул АХ через пресинаптическую мембрану с участием системы захвата холина. В физиологических условиях АХ "неквантового" происхождения участвует в контроле величины мембранного потенциала мышечного волокна в зоне концевой пластинки, а при инги-бировании ацетилхолинестеразы - вносит вклад в развитие блока проведения возбуждения.
Научно-практическая значимость работы. Проведенное исследована: вносит существенный вклад в разработку проблеет модуляции секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе через систему ПАР. Развиваемая в работе концепция о том, что эндогенный АХ и его экзогенные аналоги оказывают многостороннее воздействие на функциональное состояние нервных окончаний через активацию ПАР и другие пути, позволяет более широко оценить физиологическое значение этого пресинап-тического регуляторного механизма. Важным в теоретическом отношении является положение о том, что наличие у холинергических агентов пресинаптического действия, не всегда является доказательством существования специализированных пресянаптяческих ХР. Фундаментальное значение имеют приоритетные исследования механизма и физиологического значения неквантового освобождения АХ.
Некоторые положения работы представляют практический интерес. Получены данные, свидетельствующие о том, что при анализе механизма действия применяющихся в медицинской практике препаратов синап-тического действия, в частности, миорелаксантов, необходимо учитывать значение пресинаптического компонента, заключающегося в угнетении процесса вызванной квантовой секреции медиатора. Особенно важным является установление факта, что в условиях гипокинезии чувствительность пресинаптических структур к холияомиметикам снижается и это сопровождается необходимостью использовать б льшие дозы миоре-
лаксантов для создания надетого мионеврального блока. Этот факт следует учитывать при подборе доз ыиорелаксантов при оперативных вмешательствах, осуществляемых у лиц, длительное время находившихся в состоянии гипокинезии.
Установление определенного вклада, вносимого АХ неквантового происхождения в развитие мионеврального блока при отравлении ингибиторами ацетилхолинестеразы, делает перспективным поиск антидотов, работающих по принципу избирательного угнетения неквантовой секреции АХ.
Апробация работы. Материалы исследования были доложены на: Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" СМосква, 1975, 1980, 1985, 1990), XII Всесоюзном съезде физио-. логов СТбилиси, 1975), Международном симпозиуме "Структура и функция синапсов" (Киев, 197S), Всесоюзном совещании по проблеме гисто-гематических барьеров (Москва, 1978),. Всесоюзной конференции "Физиология вегетативной нервной системы" (Куйбышев, .1979), Всесоюзном симпозиуме "Неяромедиаторы в норме и патологии" (Казань, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Биофизика мембран" (Паланга, 1979), рабочем совещании Структура и функция холинорецепторов" (Пущино, 1979), ХШ Всесоюзном съезде физиологов (Алма-Ата, 1979), Заседании отдела нейрофизиологии АН ЧСФР (Прага, 1981, 1990), Заседаниях Татарского отделения Всесоюзного физиологического Общества им.И.П.Павлова (Ка-; зань, 1981, 1985, 1988, 1990), Заседании Пермского отделения Всесоюзного физиологического Общества им. И. П. Павлова (Пермь, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Совещании "Механизмы синаптической передачи" (Киев^ 1983), Советско-Западногерманском симпозиуме "Возбудимые мембраны" (Киев, 1983), Совещании "Регистрация одиночных каналов биологических мембран" (Пущино, 1984), Международном симпозиуме "Холинэстеразы" (Блэд, 1984), Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1984), XIV Всесоюзном съезде физиологов (Баку, 1984); Заседании Казанского отделения Всесоюзного Общества фармакологов (Казань, 1984), Ш Сессии научного Совета АН СССР по физиологии висцеральных систем (Ленинград , 1986), VI съезде Европейского нейрохимического общества (Прага, 1986), Рабочем совещании отдела нейробиологии II физиологического института им. М. Планка (Хомбург, 1989).
Реализация результатов исследования. Основные результаты ра-
&
йоты опубликованы & 65 печатных трудах. Данные о способности медиатора модулировать состояние секреторного аппарата двигательных нервов, а такяе материалы о механизме и физиологической роли неквантового освобождения АХ излагается в лекционных курсах нормальной физиологии, физиологии человека и животных, биофизтіки Казанского медицинского института. Ленинградского санитарно-гигиенического института, Ленинградского педиатрического института, Пермского медицинского института. Казанского государственного университета. Материалы исследования о роли неквантового освобождения АХ в развитии ми-оневрального блока при отравлениями Ф00 широко используются в Институте токсикологии МЗ СССР С Ленинград), Институте органической и физической химии АН СССР (Казань). Разработанный метод автоматизации электрофизиологических исследований принят к реализации учреждениями МЗ РСФСР. Получено 1 авторское свидетельство СССР на изобретение, 7 удостоверений на рационализаторские предложения.
Основная часть экспериментов была выполнена на изолированных нервно-мышечных препаратах m,sartorlus, т.cutaneus pectoris и т. submental is лягушек R. temporal-ia и R.ridibunda; и. diaphragma белых мышей; т.soleus, т.extensor digitorum longus и т. diaphragma крыс линии Wisrtar; ш. thyreohyoideus человека.
В работе были использованы следующие методические подходы:
Электрофизиологический - применялись стандартные методы микро-электродного исследования синаптической передачи, позволяющие регистрировать синаптические токи и потенциалы, характеризовать интенсивность процессов квантового и неквантового освобождения АХ, оценивать чувствительность постсинаптической мембраны к медиатору, анализировать амплитудно-временные характеристики токов действия нервных окончаний.
Фармакологический - заключающийся в исследовании влияния на освобождение медиатора ряда соединений, имеющих определенные черты сходства и различия в строении по сравнению с молекулой естественного медиатора, изучении характера взаимодействия агонистов и антагонистов с холинорецепторами..
Морфологический и гистохимический - использовали простую и фа-зово-контрастную микроскопию для визуализации нервных окончаний, морфометрию поперечных срезов мышц, изучение активности в них лак-
тат- и сукцинатдегидрогеназ, выявление ацетилхолинестеразы на поверхности отдельных мышечных волокон.
Биохимический - для определения активности Na , К - АТФазы в гомогенатах нервной ткани.
Радиоэнзиматический - для количественного определения выхода в инкубационную среду КХ. из нервно-мышечного препарата.
Статистический - включающий в себя изучение закона распределения потока миниатюрных потенциалов концевой пластинки, отражающего определенные стороны механизма освобождения медиатора.
Математического моделирования - заключающийся в создании и использовании моделей процессов активации и блокады пре- и постсинап-тических рецепторно-канальных комплексов молекулами агонистов.