Введение к работе
Изучение молекулярно-клеточных основ обучения и памяти является наиболее актуальной проблемой современной нейробиологии. Однако, несмотря на очевидные успехи, достигнутые в последние годы в этой области, механизмы молекулярных событий, происходящих в мозге при обучении, во многом остаются невыясненными. Для настоящего этапа развития исследований в рамках рассматриваемой проблемы характерно существование многочисленных, зачастую противоречивых гипотез. Одними из наиболее плодотворных и перспективных теоретических представлений для изучения молекулярно-клеточных механизмов обучения и памяти явились гипотеза "конвергентного замыкания условного рефлекса" и химическая гипотеза интегративной деятельности нейрона предложенные академиком П.К.Анохиным (1968, 1974). Согласно этим представлениям, для формирования условной связи необходима конвергенция на одной и той же нервной клетке возбуждений различной сенсорной и биологической модальности. Мотивацион-ные, условные и подкрепляющие возбуждения опосредуются гетерохи-мическими синаптическими процессами в нервных клетках. Специфические молекулярные преобразования, вызванные этими возбуждениями, взаимодействуют в мембранных и цитоплазматических компартмен-тах нейрона на основе генетически детерминированных ферментативных процессов, обеспечивая нейрохимическую интеграцию возбуждений.
Ряд положений этих концепций нашли подтверждение в многочисленных исследованиях, в которых представлен обширный экспериментальный материал о специфических нейрохимических механизмах опосредования конвергирующих к нейрону возбуждений и их последующей обработке з субсинаптической области, цитоплазме и ядре (Кругли-ковР.И., 1981; Соколов Е.Н., 1981; Byrne J., 1987; АшмаринИ.П., Титов С.А., 1988; Matties Н., 1988; Шерстнев В.В.. 1990; Анохин К.В., Судаков К.В.. 1993; Hawkins R. et al.. 1993 и др.).
Современные взгляды на клеточные механизмы обучения базируются на представлении о пластических свойствах нервных клеток. Под этим термином понимают "длительные модификации клеточной и синап-гической функций, которые позволяют объяснить простые видоизменения поведенческих реакций" (Кэндел Э., 1980). Имеющиеся к настоя-дему времени данные позволили характеризовать два основных типа їластических изменений, возникающих в нервных клетках при обучении: избирательное или неизбирательное изменение свойств нейронов
чо отношению к конвергирующим или передаваемьш возбуждениям. В основе неизбирательной реактивности нервных клеток может лежать изменение свойств всей или значительной части электрогеьной мембраны, а также одновременное изменение эффективности всех синапти-ческих "входов" или "выходов" нейронов. Таким образом, г.ри обучении у нейронов, обладающих описанными свойствами, информация "кодируется" на уровне целой клетки и она функционирует как один "информационный элемент". Данный тип пластичности нервных клеток называют cell-wide plasticity (Hawkins R. et al.. 1989), whole-cell plasticity (Billy A., Walters E., 1989), нейрональная пластичность (Фролов А.А., Муравьев И.П., 1987). В настоящей работе использован термин "общенейрональная" пластичность. Общеней-рональный тип пластичности описан у большинства изученных нейронов, вовлекаемых в процессы обучения. Однако, наиболее детально его механизмы исследованы для центральных сенсорных нейронов моллюсков аплизии и гермиссенды (Byrne J.. 1987; Hawkins R. et al., 1993), а также некоторых других клеток мозга позвоночных и беспозвоночных животных (Byrne J., 1987).
В основе избирательного изменения свойств нейронов по отношению к конвергирующим возбуждениям может лежать синапс-специфическая пластичность, одной из разновидностью которой является "синапс Хебба". "Информационная емкость" синапс-специфического типа пластичности значительно больше таковой в случае общенейронально-го типа пластичности - нейрон может иметь несколько сотен или ты--:яч избирательно регулируемых синаптических входов. Наиболее глубоко механизмы этого типа пластичности изучены на нейронах мозга млекопитающих и. е частности, клетках гиппокампа при выработке долговременной потенциации.
Процесс формирования пластических перестроек нейронов при обучении может быть подразделен на две стадии: кратковременную и .'^пговременную. Кратковременная стадия связана, по-видимому, с 'ктивацией систем вторичных внутриклеточных посредников и модификацией свойств уже синтезированных белков (Byrne J., 1937; Massi-otte G.. Baudry G., 1991; Hawkins R. etal., 1993). Долговременные пластические перестройки нейронов сопряжены с синтезом белко--их молекул и иРНК (Davis Н., Squire L., 1984; Goeiet P. et al.. 1986). Для понимания принципов долговременных изменений'необходимо изучить основные этапы вовлечения белок-синтезирующего аппара-і в механизмы обучения: передачи конвергирующих на нейрон воз-
буждений от мембраны к геному, его активации и реализации функций синтезируемых белков. Достаточно конструктивная, хотя далеко неполная, схема долговременных пластических эффектов предложена для сенсорных нейронов системы оборонительного поведения аплизии (Go-elet P. et al., 1987). Согласно этой схеме вторичные посредники, такие как ионы кальция или цАМФ. вовлечены в реализацию не только кратковременных, но и долговременных эффектов обучения. В частности, они могут фосфорилировать белки-регуляторы процессов транскрипции, которые затем действуют на энханцерную последовательность структурных генов ДНК. вовлекаемых в долговременные пластические перестройки (Goelet P. et al., 1986; Alberlnl С. et al., 1994). Синтезируемые белки поступают к "эффекторным коыпарт-ментам" клетки, вызывая долговременную модификацию свойств ионных каналов, рецепторов нейромедиаторов, ферментов и др. Схема механизма долговременных изменений, предложенная для сенсорных нейронов аплизии, может быть общей для всех нервных клеток, обладающих общенейрональным типом пластичности.
Принципиально иными должны быть механизмы долговременной синапс-специфической пластичности - необходимо выяснить, каким образом обучение приводит к изменению эффективности лишь определенных из сотен или тысяч синаптических связей нейронов. Развивая и конкретизируя положения предложенной П.К.Анохиным химической гипотезы интегративной деятельности нейрона, Е.Н.Соколов сформули-эовал концепцию (1981), согласно которой существует "проекция" :инаптических входов на определенные генетические локусы нейрона, вежду постсинаптическими структурами устанавливаются прямые и об-)атные связи с определенными генами, что обеспечивает избиратель-іую генетическую регуляцию синаптических входов, в том числе при (бучении. Наиболее подходящими кандидатами на роль специфических маркеров", передающих информацию от синапсов к геному, и регуля-оров синаптической передачи являются молекулы белковой природы. >кспериментальные возможности проверки этих представлений в нас-оящее время весьма ограничены, поэтому имеются лишь единичные, в начительной мере косвенные данные, служащие в их пользу.
Заключая изложенное, необходимо отметить, что несмотря на оче-идный прогресс в исследовании молекулярно-клеточных механизмов бучения большинство наиболее важных вопросов этой проблемы оста-тся нерешенными. Среди них наиболее актуальными являются, по на-ему мнению, следующие: изучение роли систем вторичных посредни-
- 4 -ков в специфическом опосредовании возбуждений различной сенсорной и биологической модальности, конвергирующих к нейрону при обучении; изучение механизмов вовлечения генетического аппарата в процессы консолидации, сохранения и воспроизведения долговременной памяти; исследование особенностей метаболического обеспечения пластических перестроек, возникающих в одних и тех же нервных клетках при выработке различных форм обучения. Все эти вопросы в той или иной мере нашли отражение в настоящем исследовании. Особое внимание в нашей работе уделено наименее исследованному аспекту нейробиологии обучения - изучению механизмов синапс-специфического типа пластичности.
Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение на поведенческом, клеточном и молекулярном уровнях механизмов ассоциативных и неассоциативных форм обучения у виноградных улиток.
Задачи исследования:
-
Изучение особенностей нейрофизиологических и кальций-зависимых метаболических изменений в идентифицированных нейронах при ассоциативном и неассоциативном обучении у виноградной улитки.
-
Исследование участия систем вторичных внутриклеточных посредников в нейрональных механизмах разных форм обучения.
-
Изучение роли белок-синтезирующего аппарата в молекулярном обеспечении механизмов долговременной сенситизации.
-
Изучение роли негистоновых белков хроматина в механизмах хранения и воспроизведения ассоциативного навыка отвергания пищи у виноградной у улитки.
Научная новизна.
В работе впервые выявлены отчетливые нейрофизиологические различия кратковременной и долговременной стадий формирования новых навыков. Кратковременные эффекты сенситизации и обусловливания выражались в изменениях мембранного потенциала, а также возбудимости плазматической мембраны командных нейронов оборонительного поведения виноградных улиток. Долговременные - в облегчении си-наптических компонентов ответов этих нейронов на сенсорные раздражения.
Обнаружено избирательное облегчение эффективности определенных синаптических входов командных нейронов при долговременной сенситизации. Выраженность синаптического облегчения и длительность его сохранения зависят от места нанесения тестирующего стимула пс
отношению к области действия сенситизирующего раздражения (мес-тоспецифическая сенситизация), а также от вида (химическое или тактильное) сенсорного раздражения (иодальноспецифическая сенситизация) .
Впервые найдено, что при ассоциативном обучении отвергают определенного вида пищи в одних и тех же командных нейронах оборонительного поведения возникают нейрофизиологические эффекты, характерные как для обусловливания, так и сенситизации. Через 1 ч после начала обусловливания в командных нейронах возникает характерное для долговременной сенситизации облегчение исходно существующих синаптических ответов на сенсорные раздражения, тогда как ответ на пищевой условный стимул появляется через 1.5 ч после начала обучения за счет активации ранее "молчащих" синаптических входов командных нейронов.
Выявлено, что ассоциативные и неассоциативные виды обучения сопровождаются специфическими изменениями кальций-зависимого метаболизма в командных нейронах. ВыраСотт?. привыкания приводит к снижению содержания Са-с. Кратковременн ш и долговременная стадии сенситизации коррелируют с фазным увеличением уровня Са-с. При эбусловливании в кратковременную стадию отмечено уменьшение 'содержания Се-с, а в долговременную - его увеличение.
Впервые показано избирательное вовлечение в механизмы воспроизведения из долговременной памяти мозгоспецифических негистоно-зых белков хроматина. У виноградных улиток, обученных ассоциатив-гому навыку отвергания пищи, антитела против негистоновых белков ф 3,5, но не Np 3.6 полностью подавляют поведенческие реакции и ответы командных нейронов оборонительного поведения, вызванные шределенным условным стимулом - морковью. Действие антител к Np ї,5 специфично, поскольку они не изменяют нейрональных и поведен-іеских реакций на другой условный стимул - яблоко.
Сформулировано представление о том, что процессы консолидации і воспроизведения долговременной памяти у виноградных улиток свя-!аны с активацией синтеза короткоживущих белковых молекул, специ-мчески регулирующих определенные синаптические входы командных [ейронов оборонительного поведения.
Теоретическая и практическая значимость результатов. 'езультаты выполненной работы имеют значение для понимания нейро-альных и молекулярных механизмов, лежащих в основе процессов бучения и памяти. Выявленные особенности нейрофизиологических и
- 6 -кальций-зависимых метаболических эффектов разных стадий обучения, а также ассоциативных и неассоциативных навыков в командных нейронах оборонительного поведения позволяют использовать эту модель для изучения молекулярно-клеточных механизмов действия различных биологически активных соединений - предполагаемых регуляторов ин-тегративных функций мозга, а также факторов, вызывающих нарушения его функций. Полученные экспериментальные данные об избирательном вовлечении мозгоспецифических негистоновых белков хроматина в процессы обучения и памяти представляются актуальными для медицинской науки в плане изучения ряда нервно-психических заболеваний (шизофрения, эпилепсия, врожденные энцефалопатии, рассеянный склероз, маниакально-депрессивный психоз и др.). патогенез которых связан с нарушением метаболизма белковых соединений мозга, а также процессов запоминания и воспроизведения. Основные положения, выносимые на защиту.
-
Выработка различных видов неассоциативного и ассоциативного навыков у виноградных улиток вызывает в командных нейронах оборонительного поведения характерные для каждого из них нейрофизиологические и кальций-зависимые метаболические изменения.
-
В основе отдельных стадий оборонительных форм обучения у виноградной улитки лежат различные нейрональные и молекулярные механизмы. Кратковременная стадия характеризуется изменением свойств электрогенной мембраны (деполяризация и увеличение возбудимости) командных нейронов оборонительного поведения и зависит от активности систем вторичных внутриклеточных посредников, тогда как долговременная стадия выражается в облегчении синаптической передачи и зависит от активности белок-синтезирующего аппарата клеток. '
-
Избирательное изменение эффективности определенных синапти-ческих входов командных нейронов при обучении сопряжено, по-види-' мому, с метаболизмом специфических белков-регуляторов, продолжительность жизни которых составляет не более 1-3 ч.
-
При ассоциативном обучении отверганию определенного вида пищи в одних и тех же командных нейронах оборонительного поведения возникают нейрофизиологические' и, метаболические .изменения, характерные как для обусловливания.''так.-и.сенситизации. '> '.'
-
В механизмы воспроизведения из долговременной памяти ассоциативных навыков у виноградных улиток избирательно' вовлечены мозгоспецифические негистоновые белки хроматина. Функции этих
- 7 -белков связаны, по-видимому, с генетической регуляцией синапти-ческих входов командных нейронов оборонительного.поведения, опосредующих возбуждение, вызванное условным стимулом.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 15 съезде Всесоюзного физиологического общества, . Кишинев, 1987; I Всесоюзном биофизическом съезде, 1982; , международном симпозиуме "Молекулярные основы действия биологически активных веществ на поведение" (Таллин, 1989); международных конференциях "Простые нервные системы", 1992. 1994; Всесоюзной конференции по нейронау-кам, Киев. 1986; 1990; 28 Всесоюзном совещании по проблемам высш. нервн. деят.. 1989; на Всесоюзном симпозиуме "Медиаторы, в генетической регуляции поведения", Новосибирск, 1986; на заседании Московского физиологического общества. 1984; на итоговых сессиях Института нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН 1988-1995 гг.; на международном симпозиуме "Интегративная деятельность нейрона. Молекулярные основы". Ялта. 1988; на международном симпозиуме "Современные проблемы клинической и экспериментальной психо-нейроиммунологии". Томск, .1992; 19 ann. meet. "Euro, brain and behavior soc.", Jugoslavia. 1987; 6th meet. "Euro. soc. neurqc-hem.". Prague. 1986; XVeme conference en neurobiology de Glf "Synaptogenesls and differentiation of synaptic areas", , Glf Sur Yvette. 1990; In 16th Glf lecture in neurobiology "Calcium and intraneural signalling" Glf, France, 1991; 2-nd Intern. Congress ISNIM, Italy, 1993.
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 31 статье и 23 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 259 страницах машинописного текста, содержит 54 рисунка. Список литературы включает 382 источника.