Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Основные принципы коррекции метаболических нарушений при токсических поражениях печени .12
1.1..Этиопатогенетические особенности влияния токсикантов различной природы на функциональное состояние печени 12
1.2. Печень - центральный орган метаболического обеспечения процессов жизнедеятельности 24
1.3. Методы лечения заболеваний печени. Теоретические и практические принципы восстановительной медицины в отношении неинфекционных заболеваний печени (токсического гепатита) .31
1.4. Механизмы лечебного действия минеральных вод 37
1.5. Теоретические и практическое вопросы модификации состава минеральных вод с целью повышения их биологического потенциала 47
1.6. Наночастицы серебра как новый физический фактор воздействия-биологические свойства, возможности применения в медицине .52
Глава 2 Материалы и методы исследования 62
2.1. Объекты исследования .62
2.2. Методы исследования 64
2.3. Моделирование токсико-химических поражений печени 67
2.4. Методы воздействия 70
2.5. Дизайн исследования .71
2.6. Статистический анализ результатов исследования 73
Глава 3 Формирование пато- и саногенетических рпеакций при моделировании токсических поражений печени различного генеза .74
3.1. Подострые токсико-химические поражения печени 75
3.2. Хронические токсико-химические поражения печени 92
Глава 4. Механизмы влияния минеральных вод (нативных и обогащенных наночастицами серебра) на различные функциональные системы у здоровых животных .105
4.1.1. Однократное воздействие 105
4.1.2.Курсовой прием 115
Глава 5. Профилактические эффекты нативных минеральных вод и их моди-фикаций наночастицами серебра при токсическом поражении печени 128
Глава 6. Механизмы реализации лечебного действия нативных минеральных вод и их модификаций наночастицами серебра при токсическом поражении печени .153
6.1. Подострое токсическое поражение печени 154
6.2. Хроническое токсическое поражение печени .168
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 183
Выводы .193
Список литературы 195
- Методы лечения заболеваний печени. Теоретические и практические принципы восстановительной медицины в отношении неинфекционных заболеваний печени (токсического гепатита)
- Моделирование токсико-химических поражений печени
- Хронические токсико-химические поражения печени
- Хроническое токсическое поражение печени
Методы лечения заболеваний печени. Теоретические и практические принципы восстановительной медицины в отношении неинфекционных заболеваний печени (токсического гепатита)
Токсические вещества, подвергаясь метилированию, аминированию, карбоксилированию, окислению с участием ферментов гепатобилиарной системы, зачастую вызывают токсические поражения, сопровождающиеся различными нарушениями ферментативного равновесия в ней и изменением активности ферментов печеночного происхождения, а также оказывают неблагоприятное влияние на пигменто-, белково-, углеводообразующую функцию печени, что сопровождается определенными гистоморфологическими сдвигами, и проявляется воспалительной реакцией – токсическим гепатитом. (Л.Б. Лазебник, Э.Я. Селезнева, 2004; A.M. Miller, 2011; Л.Ф. Панченко, 2012) . В механизмах действия вредных производственных факторов, так и опосредованных ими экологических, ведущее значение имеют системные, регуляторные и метаболические нарушения – гипоксические состояния, патология суставов, токсические поражения органов-мишеней (В.Т. Ивашкин 2002-2010). Одним из центральных органов токсического воздействия, соединяющим в себе функции пищеварительной железы и своеобразной биохимической лаборатории, является печень, заболевания которой занимают одно из ведущих мест, как среди населения, когда основными инициаторами неинфекционных заболеваний печени являются неправильное питание и злоупотребление алкоголем, так и в формировании профессиональной патологии (А.О. Буеверов, 2002, А.В. Калинин с соавт., 2007, В.С. Моисеев с соавт., 2013). По данным ВОЗ, количество населения с заболеваниями печени в мире составляет более 2 млрд человек, что в сотни раз превышает распространенность ВИЧ-инфекции (С.М. Дроговоз, 2009, N.Greenberger , 2012, J.A. Carrion, 2012). В международной практике, согласно рекомендациям Совета международных научно-медицинских организаций (CIOMS), используется классификация поражений печени, где основополагающим критериями являются тип и длительность воздействия токсикантами (Т.С.Поликарпова, 2010, R. W. Chesney , 2010, Т.Е.Полунина, 2012-2013). По механизмам действия на печень химические вещества можно разделить на гепатотоксические, токсико-аллергические и влияющие на процессы обмена, а по характеру возникающих повреждений органа подразделяют на цитотоксические, холестатические и смешанные (S.J. Stohs,1990, И.Ф. Литвицкий, 2002, Y. Yamori , 2010, I. Manor , 2012). Несмотря на все многообразие химических веществ (на сегодняшний день зарегистрировано более 4 млн. соединений), отмечены общие закономерности их влияния на организм (И.Ф. Литвицкий, 2002, В.Г. Радченко, 2004-2005). В патогенетическом аспекте целесообразно рассматривать токсико-химическое поражение как химическую травму, развивающуюся вследствие внедрения в организм токсической дозы чужеродного химического вещества со специфическим действием, нарушающим определенные функции (Г.П. Кукес В.Г., 2004, Н.Н. Малютина, Л.А. Татаренко, 2014). В зависимости от вида и количества попавшего в организм яда клиническая картина поражений может развиваться очень быстро, в течение нескольких минут (острые, ингаляционные отравления), или медленно, с постепенным появлением отдельных симптомов и формированием характерного для данного поражения симптомокомплекса в течение нескольких часов или дней (пероральные отравления) (J. Wardle, 1995, P. Burra, 2010, D. Bulut, 2013). При воздействии токсических веществ на клетки печени объектами первичного контакта являются рецепторный аппарат цитоплазматических мембран или их компоненты, где в роли рецепторов во многих случаях выступают ферменты, аминокислоты (гистидин, цистеин и др.), нуклеиновые кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, витамины (E.A. Hassoun et.el., 1998, Белоусов Ю.Б.,2011). Кроме того, функции рецепторов зачастую берут на себя различные медиаторы и гормоны (В.К. Фролков, 2016), а также наиболее реакционно способные функциональные группы, играющие жизненно важную роль в метаболизме клетки (сульфгидрильные, гидроксильные, карбоксильные, амино-и фосфорсодержащие группы (Peters U., 2010, Pfaffenbach K.T., 2010). В ответ на нарушение постоянства и динамического равновесия внутренней среды организма печень, являясь саморегулирующейся и самовосстанавливающейся системой, стремиться выровнять наступившие сдвиги, и восстановить нарушенное равновесие на всех изучаемых уровнях (J.Navarro, 2006). Вследствие воздействия токсических агентов наблюдаются нарушения в печеночной клетке, одновременно запускаются сложные биохимические процессы, в результате которых ядро получает импульс для перестройки и обеспечивает пролиферацию клетки. Существенным феноменом среди различных функций печени являются параллельные процессы дегенерации и регенерации этого органа (A.P.Alvares et. el., 1997). Преобладание процессов пролиферации над дегенерацией ведет к восстановлению нарушенных функций гепатоцитов вплоть до полного выздоровления, а усиление дегенеративных изменений в печени приводит к прогрессированию изменений в печеночных клетках, с образованием некротических изменений и последующим развитием цирроза печени (G. Hubner, 1981; A.M.Jlzeguee, 1982, Guidelines in the Recognition and Prevention of Hepatotoxicity in Clinical Practic, 2001).
При действии малых доз ксенобиотиков на печень за процессом дегенерации печеночных клеток наступают, а в большом числе случаев и преобладают, процессы функциональной и морфологической регенерации, что отличает профессиональные гепатиты от тяжелых токсико-химических поражений печени (V.E. Kagan, 1989, В.Г.Кукес, 2004, U.Warskulat , 2007).
Моделирование токсико-химических поражений печени
Проведение экспериментальных исследований были построены из разных этапов: на первом и втором этапах проводились подготовительные работы, включающие определение цели и задач исследований, разработки схем построения экспериментальных исследований на здоровых животных; построение схем моделирования патологий печени токсическими веществами различной продолжительности, профилактики и коррекции возникающих нарушений наблюдаемых метаболических сдвигов изучаемыми факторами. Формирование групп животных осуществлялось на третьем этапе, и зависело от поражающего фактора, длительности их применения. На четвертом этапе проводились экспериментальные работы по запланированным схемам, с последующей группировкой полученных данных, составление табличного материала, расчеты статистических показателей. Проведение пятого этапа включает обобщение результатов исследований, их анализ и обсуждение. Заключительный, шестой этап, включает формирование выводов и практические рекомендации. Оценку динамики функционального состояния организма со сниженными компенсаторными возможностями проводили на животных (крысы) после моделирования подострого и хронического токсического поражения (токсико-химическое поражение 40% и 10% раствором формальдегида, и сочетания 40%раствора формальдегида с 40% этанолом, воздействие четыреххлористым углеродом (ХЧ)). Подострые токсические поражения у трехмесячных крыс - самцов линии Вистар с исходной массой тела 180-200 грамм моделировали в условно - токсических дозах: 1.Формальдегидом (СН2О)- per os, по 0,1 мл 40% формальдегида на 100 г массы животного, через день, в течение 14 дней; 2. Четыреххлористым углеродом (ССl4) ( ХЧ) -per os по 0,1 мл на 100 г массы животного, через день, в течение 21 дня. 3.Сочетанная модель (СН2О+С2Н5ОН)- введением 40 % раствора формальдегида per os из расчета по 0,2 мл на 100 г массы животного, через день и одновременным ежедневным свободным поением животных 10% раствором этилового спирта, в течение 21 дня. 4.Сочетанная модель (совтол+С2Н5ОН) - введением зондом в желудок 50% раствора совтола-1 на оливковом масле (в соотношении 1:2) из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела животного, два раза в неделю, в течение месяца. Одновременно в течение всего эксперимента животным давали вместо воды для питья 10%-ный раствор этанола. Декапитацию интактных крыс, и животных из группы с подострым поражением 40% раствором формальдегида проводили на 15 день; на 22 день-интактных крыс, и группы с моделями подострого поражения четыреххлористым углеродом (ХЧ), и сочетания - 40% раствора формальдегида с 40% раствором этилового спирта; на 30 день - интактных крыс, и группы с сочетанной моделью 50% совтола-1, с 10% раствором этилового спирта; на 37 день- с курсовым лечебным или профилактическим поением нативными и модифицированными минеральными водами при моделировании подострого поражения 40% раствором формальдегида. После декапитации крыс сыворотку крови животных анализировали по запланированным лабораторным тестам, и проводили патоморфологическое исследование печени.
Хронические токсические поражения у трехмесячных крыс - самцов линии Вистар с исходной массой тела 180-200 грамм моделировали в условно - токсических дозах:
Формальдегидом (СН2О) - per os, введением 10% раствора формальдегида в дозе 0,2 мл на 100 г массы животного, через день, в течение 50 дней.
Сочетанная модель (СН2О+С2Н5ОН)- введением 10 % раствора формальдегида per os из расчета по 0,2 мл на 100 г массы животного, через день и одновременным ежедневным свободным поением животных 10% раствором этилового спирта, в течение 50 дней.
Этиловым спиртом (С2Н5ОН) - per os, введением 40% этиловый спирта в дозе 14 мл/кг, ежедневно, 1 раз в сутки, в течение 60 дней. Животных декапитировали на 51 и 61 день после моделирования патологий, на 71, день с курсовым лечебным или профилактическим поением, с последующим проведением лабораторных тестов и патоморфологическим исследованием печени. Изучение однократных эффектов НЧ серебра в водопроводной воде, минеральных вод «Ессеентуки № 17», «Красноармейский», относительно контроля-водопроводной воды, проводили на здоровых крысах. Животных выводили из опытов путем декапитации, на 5, 15, 60 минуте эксперимента, с последующим сравнением полученной картины саногенетических изменений, с акцентом на анализ ферметативной реакции печеночных ферментов, метаболизм углеводов, липидов, и гормональной регуляции обмена веществ, по показателям в сыворотке крови: инсулина, кортизола, адренокортикотропного гормона (АКТГ), аспартатаминотрансферазы (АсТ) и аланинаминотрансферазы (АлТ), каталазы, холестерина, триглицеридов, глюкозы, малонового диальдегида. Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных [European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for exsperimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe, 1986], «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1987 г.) и проектом Федерального закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 1999 г.
При изучении однократных эффектов контроля водопроводной воды, минеральных вод «Ессентуки № 17» и «Красноармейский» и водного раствора наночастиц серебра, изучаемые факторы крысам вводили внутрижелудочно, зондом, из расчета 1,5 мл фактора на 100г массы животного.
Курсовой прием НЧ серебра в водопроводной воде, минеральных вод «Ессентуки №17», «Красноармейский» и их модификаций НЧ серебра осуществляли ежедневно в течение 21 дня. Разведение НЧ в водопроводной воде, и в МВ готовили экстемпорально, из расчета 0,001мкг/100 г животного. Минеральные воды, и НЧ серебра в водопроводной воде вводили при помощи шприцевого зонда в объеме 1,5 мл на 100 грамм массы тела в утренние часы.
Профилактическое (21 день) и лечебное (21 день) введение природных и модифицированных НЧ серебра минеральных вод «Ессентуки №17», «Красноармейский», НЧ серебра в водопроводной воде осуществляли 1 раз в сутки, до или после моделирования подострого и хронического токсического поражения печени.
Хронические токсико-химические поражения печени
Полученные данные подострого поражения токсическими веществами свидетельствуют только о стимуляции процессов выработки лимфоцитов иммунокомпетентными органами, с последующим выбросом субпопуляций Т- лимфоцитов в кровь, повышая их процентное содержание.
Нами установлено, что токсическое поражение печени после перораль-ного введения четыреххлористого углерода, 40% раствора формальдегида, и сочетания 40% раствора формальдегида с этиловым спиртом носит зеркальный характер, и приводит к значительным нарушениям в деятельности различных функциональных систем организма, формированию постинтоксикационного состояния, о чем свидетельствуют нарушения в Т-лимфоцитарном звене иммунного ответа, изменению в лейкоцитарной формуле с преобладанием воспалительного компонента, напряжению стресс-лимитирущей гормональной системы.
Предположительно, поражение всеми химическими веществами сводится к первоначальной стимуляции пролиферативной функции иммунокомпетент-ных клеток, лейкоцитозу, усилению рецепторной функции лимфоцитарного звена (Т-лимфоцитов), изменению соотношений форменных элементов крови. Наблюдаемое повышение популяций и субпопуляций Т-лимфоцитов возможно носит компенсаторный характер.
Для верификации поражения печени на разных патологических моделях нами дополнительно проведены патоморфологические и гистологические исследования.
Группа 1. Макропрепараты: При морфологическом исследовании печени здоровых крыс отмечены её красно коричневый цвет; печень нормальных размеров 2,6±0,52 см на 2,6±0,20 см; средней массой 6,9±0,45 г. Капсула печени плотная, гладкая, блестящая; консистенция плотная. У всех крыс печень при разрезе красно-коричневого цвета, без патологических очагов. При микроскопическом анализе тканей печени интактных животных балочное строение не нарушено. Гепатоциты содержат овальные ядра с хорошо просматриваемыми ядрышками. В единичных гепатоцитах выявлено наличие жировой дистрофии.
Группа 2. Макропрепараты: При патоморфологическом исследовании печень некоторых крыс отравленных четыреххлористым углеродом имела охряно-красный цвет, светло-коричневая с множественными кровоизлияниями. Орган гипертрофирован, в большинстве случаев рыхлый, в отдельных местах с уплотненными участками; размеры 4,3±0,4 см на 6,6±0,5 см; средняя масса 10,2±0,74 г. У большинства крыс печень на разрезе сухая, кровь не выступает, в ряде случаев кровь на разрезе выступает умеренно. Микропрепараты: При гистологическом исследовании печени 20 отравленных крыс четыреххлористым углеродом отмечается нарушение структуры печеночной паренхимы, дольчатое строение паренхимы не сохранено, наблюдается четко выраженная дискомплексация печеночных балок. Среди клеток большое количество лейкоцитов, макрофагов. При окраске суданом III в 80% случаев в вакуолях гепатоцитов появляются липиды. Отдельные клетки очень крупные и представляют собой сплошную вакуоль. Гепатоциты набухшие, цитоплазма их мутная, границы клеток не четкие, ядра также набухшие. В 70% случаев обнаружены множественные очаги некрозов разных размеров, в которых структурные элементы клеток не визуализируются, а ткань печени представляет собой гомогенную бесструктурную массу. В 30% случаев наблюдаются обширные некрозы. Кровеносные сосуды (центральные вены, капилляры) в печени этих животных расширены (гиперемия кровеносных сосудов), проницаемость стенок для клеток крови повышена, отмечаются очаговые кровоизлияния. В целом, у подавляющего большинства крыс отмечена картина острого токсического гепатита с достаточно высокой интенсивностью повреждения тканей (альтернативный гепатит). У части животных определяется гепатоз с выраженным некротическим компонентом. Обнаруженные изменения свидетельствуют о развитии у животных типичной токсической дистрофии печени.
Таким образом, получена модель подострого поражения, вызванная пероральным введением четыреххлористого углерода, выражающаяся в усилении дегенеративных процессов в печени, биохимически и гистологически подтверждающаяся в выраженных дегенеративных повреждениях практически всех участков печени, т.е. предлагаемый способ моделирования является достаточно информативным, и позволяет использовать его в эксперименте.
Группа 3. При патоморфологическом исследовании органов после подострого введения 40% раствора формальдегида на фоне приема 10% этилового спирта печень некоторых крыс имела охряно - красный цвет, светло - коричневая с множественными кровоизлияниями. Орган гипертрофирован, в большинстве случаев рыхлый, в отдельных местах с уплотненными участками; размеры 5,0±0,1 на 5,9±0,5; средняя масса 11,4±0,5. У большинства крыс печень на разрезе сухая, кровь не выступает, в ряде случаев кровь на разрезе выступает умеренно. Подострое поражение подтверждается и увеличением в размере печени на 4,5г (11,4г против 6,9г) или на 35 %. Гепатотоксическое действие 40% раствора формальдегида на фоне приема 10% этилового спирта на печень крыс подтвердилось с достоверной вероятностью (р 0,001).
Хроническое токсическое поражение печени
Как было нами ранее установлено (см. главу 3), токсическое поражение печени 40% раствором формальдегида позволяет получить достаточно выраженные патологические изменения в различных функциональных системах организма экспериментальных животных, что создает хорошие предпосылки для оценки эффективности применения питьевых минеральных вод. При этом отметим, что задача изучения лечебных и профилактических эффектов требует выбора наиболее адекватной патологической модели, учитывающей алгоритм питьевого воздействия и темпы развития ответных реакций организма животных на действие гепатотропных ядов. Поэтому для исследования профилактического потенциала внутреннего приема как нативных минеральных вод, так и их модификаций наночастицами серебра была выбрана модель подострого поражения печени раствором формалина.
Дизайн исследования с учетом требований доказательной медицины предполагал несколько вариантов сравнительного анализа. Во-первых, оценивалось влияние трех вариантов профилактического питьевого воздействия: питьевая вода (контроль) и дре различные по своему составу минеральных воды («Красноармейский» и «Ессентуки № 17»). Во-вторых, те же факторы модифицировались наночастицами серебра и применялись в профилактических курсах. Поэтому можно было получить ответы на следующие вопросы: Обладают ли природные минеральные воды профилактическим потенциалом при токсическом поражении печени? В какой степени профилактическое действие минеральной воды определяется ее физико-химическим составом? Могут ли проявить наночастицы серебра какой-либо биологический эффект серебра в условиях развивающегося токсического поражения печени? Как изменится профилактический эффект минеральной воды при ее ассоциации с наночастицами серебра и имеет ли в этом плане значение физико-химические особенности воды?
Эти вопросы не случайны и вытекают из фундаментальных исследований, проведенных Н.Д.Полушиной с соавт. (1997), в которых показана принципиальная возможность модификации минеральных вод различными витаминными препаратами. Плодотворность этой идеи в дальнейшем подтвердили исследования Михайленко Л.В. (2011) у пациентов с метаболическим синдромом. Однако наши предварительные исследования (см. главу 4) показали неоднозначность оценки биологического потенциала наночастиц серебра, которые в одних условиях могла оказывать неблагоприятное воздействие (по-видимому, прямо влияя на целостность клеточных мембран гепатоцитов), но, с другой стороны, эти же наночастицы могли усиливать потенциал маломинерализованных минеральных вод.
Мы отдаем себе отчет, что физиологические эксперименты, проводимые на здоровых животных, не могут дать четкого ответа о перспективах лечебно-профилактического потенциала наночастиц серебра и модифицированных этим фактором питьевых минеральных вод. Приблизиться к решению этой проблемы мы попытались в настоящем фрагменте исследования. Напомним, что курсовой прием наночастиц серебра самостоятельно, и вместе с минеральными водами, был не безразличен для организма здоровых экспериментальных животных, что априорно предполагает изменение чувствительности организма к патогенному воздействию и результаты наших исследований подтвердили это. Установлено, что профилактический курс питьевой воды с наночастицами серебра достоверно изменил реакцию животных на токсическое воздействие 40% раствором формальдегида, что проявилось в ряде различий динамики параметров, характеризующих состояние печени, по сравнению с контролем (предварительный курсовой прием питьевой воды (табл. 19).
Так, воспроизведение токсико-химического поражения печени у животных, получавших курс наночастиц серебра в питьевой воде, сопровождалось меньшим увеличением концентрации в крови трансаминаз АлТ и АсТ соответственно на 12,1% и 16,4%, а также щелочной фосфатазы на 7,4%. Впрочем, отметим, что активность другого фермента – гамма-глута-милтранспептидазы, которая под влиянием токсического агента превышала нормальные значения в 4 раза, после предварительного (т.е. профилактического) курсового приема питьевой воды с наночастицами серебра достоверно увеличивалась еще в большей степени, превышая контрольные значения в среднем на 23,5%. Таким образом, можно констатировать, что в системе печеночных ферментов, а точнее, в их динамике после патогенного воздействия, предварительный прием наночастиц серебра вызвал изменения, которым трудно дать однозначную оценку.
Профилактический курс нативных минеральных вод в той или иной степени оказал благоприятное действие на способность организма экспериментальных животных противостоять токсикационным эффектам формалина. В частности, это проявилось в достоверно меньшем увеличении массы печени при моделировании патологии, падении активности печеночных трансаминаз, а также активности щелочной фосфатазы и гамма-глутамилтранспептидазы (см. табл. 19). При этом, наибольший профилак-тический эффект был выявлен при предварительном курсовом приеме минеральной воды «Ессентуки № 17». Добавление в эти минеральные наночастиц серебра усилило их профилактический потенциал, однако, что очень важно, степень этого «усиления» была различна: в этом случае максимальный положительный эффект, в плане первичной профилактики, был отмечен для воды источника «Красноармейский».