Механизм неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний Воронин, Вячеслав Анатольевич

Введение к работе

Актуальность темы. Одной кз важных задач современной синапто-

эгик.,язляется выяснение молекулярных механизмов освобождения ме-їагорй из нервных окончаний. В настоящее вреыя изхестни три ос-гзныэ 'слрмы секреции ацета.пхолкна С АХ) из двигательных нервны:: <ончаний: вызванная кза;исвая секреция, спонтанная квантовая зкреция и спонтанное кэквантозоэосвобождение (Thesleff, 1986; fskocil et 9.1. , 1989), Установлено, что неквантовое освобождение ієспечивает <33-09Х общего выхода "едиатора вне возбуждения CVys-jcii. Illes, 1Q/0. 1979\ Покапано, что неквантовое ссвобокдекис даатора является процессом, характерным не только для холичер-г^ской системы, но также имеет место и в глутаматном синапсо intonov, Haqaiaiiik, 1CS3; Апточе*» Магаэаик;, 1С39), Таким обра-)м, имеется основания полагать, что значение неквантового осьо->жденая медиатора для системы мекклеточных взаимоотношений досрочно существенно (Таис, 1982; Thesleff. 1936). В частности, ідьзя исключить участие АХ неквантового происхождения в нзйро-юфическом контроле состояния поперечнополосатого мышечного во-жна со стороны мотонейрона (tethers, Thesleff, 1978; Drachman, .anley, 1982). Кроме того, учитывая, что основная ч. зть спонтан- or-чобовдаемого АХ имеет неквантовое происхождение, можно предлагать, что в условиях ингибированной ацетилхолинестерагн 'АХЭ? vivo, например, при отравлениях соответствующими ингибиторами.. новные патогенетические изменения могут развиваться за счет на-пления р. синаптичоской цели медиатора, освобождаемого именно в квантовой форме. Вместе с тем, механизм, осуществляющий некван-вую секрецию медиатора, до сих пор точко не установлен. Экспе-ментальны^а данные позволяют лишь полагать, что процесс некван-вого освобождения значительно сложнее, чем простая ди(фузия по адйенту концентрации (Katz, Miledi, 1981; Dolezal et al. , 3982; skocii el al , 1983). Высказываемые гипотезы требует дополните-ных подтверждений поскольку не соответствуют отдельным экспо-ментальным данным. Гак, гипотеза Визи о триггерной роли натрий-лиевого насоса в неквантовом освобождении СVizi, 1978) протиьо-чнт результатам исследования зависимости неквантового выхода от эклеточной концентрации ионов калия (Vyskocil et al., 1983), а ?длокенное Здвардсон с соавт. (Edwards et al , 1985, 19SS) обї-тение механизма неквантовой секреции функционированием системы

- г -

транспорта АХ в везикулы не согласузтсл с дзннкуи об отсутствии прямой связи между квантовым и неквантовым освобождением медиат< I CKatz, Miledi, 1981; Vyskocil et al. , 1C83). Относительно учг сткя АХ неквантового происхождения t нейротрсфическом контроле, факта в пользу воздействия гидрслкзуемого холиномпметика на кемс ранний потенциал покоя (ШЇЇ1) мыленного волокна имзст лишь косвеї нїЯ характер CBray et al., 1982; Drachnan et al. , 1982). Наряду этим приводятся данные против влияния АХ, освобождаемого в кеква ктовой форке, на МПП мышечного волокна ССурОЕцев и соавт., 1S83) Такий образом, механизм неквантового освобождения АХ и его роль в скстеие кервзо-цушечных взаимоотношений является еде кеде статечно изученным!, поэтому исследования в этой области актуаль ны как в теоретическом отношении, так и в прикладном, токсикологическом, аспекте проблемы.

Цель и задача исследования. Целью работы явилось исследовани механизма неквантового освобождения АХ из двигательных нервны окончаний на объекте "диафрагмальный нерв - полудиафрагма" бело{ мыли, а также выяснение способности АХ неквантового пропехоадени модулировать состояние постсинаптической мембраны. В ссотеєтстви с этим были поставлены следующее конкретные задачи:

1. Поиск оптимальных экспериментальных условий для исследования неквантовой секреции АХ с установлением временного интервала в котором з-.jt способ секреции сохраняется неизменным при инкуба цки нервно-мышечного препарата in vitro.

2. Выяснение температурной зависимости и эффективной энергии актішаціш процессов квантового и неквантового освобождения АХ.

3. Детализация влияния ионов кальция на неквантовое освобовде ние АХ.

4. Сопоставление динамики изменений спонтанной квантовой и не квантовой секреции АХ после нарушения анатомической целостности двигательного нерва и в ходе его регенерации.

5 Установление возможной корреляции между величиной кекванто вой секреции АХ и уровнем НЛП синаптической области мыаечного во локка в процессе дегенерации и регенерации нервных терминален.

6. Іізучеиие роли системы захвата холина высокого сродства в механизме неквантового освобождения АХ.

7. Исследование влияния АХ неквантового происхождения и экзогенного АХ в аналогичной концентрации на постенлаптическую мемб-

;ну в условиях интактной АХЭ.

Haj{4H^_^:c2iiiaja,- Проведено с/стемат;:-.----::1:03 і:со.'.е^г>^г;г-.»;кз '. ,.-ан-:вого ^vBojrr,i;~.:^li-i АХ :: ^гбъэкте - цгг.г-рагьал;.;::;»: ьорь..&-;^".>;;-т< ч;-апарат J-o.o.l 'кг: -:. раоли<<ныл экспор;:'/:о;гга^ь;"тз: p?n:v-.:: ~ .-'ссгав/їеі-;:і- ос споит, иной :-;за;;гоЕол секретке;: А.¹.'. >сганоі-;і>-.-.і -. шіератгряая зависимость некБантового освобождена» Ал. Ыыуаыв ре~--:гііо онзч-т:\-г з-?::т;::шох э. эргаа активац.си процесса яркйа-о?.'":И с-ькре::;;:; АХ. Получены нсвие д-ашшо относительно действия чек га.;:_-..'> на ::?;-сантог.ул зіс-гол А". :сг-я^!И1Я-тг?зап:гс::ггЛ ::c.tnc-нт H^vj-a.'iTCEoro ос:ю:'о"-:.:і'!Я стг.у;стпу одкгко эффект ясчов льцня на неквантовьга выход по сравнении с влиянием на. спонтан-

>. "іат;.|..іі с-йьглпап тім линуется постепенно И эаВИСНТ ОТ ИНТЄН ииг^тс. рпгтуппаиир игшпн х-алЫ*ИХ ЯНуТйЬ НврвНОИ TeOUHHaJia. lliy-

ны изменения квантовой а неквантовой секреции АХ в процессе де-чераіша нервных терминалей-- послэ яередавливания двигательного эва преуле всего прекращается неквантовый выход АХ, в процессе ітнерчці'и нерва восстановление неквантового освобождения АХ даоствует установление полноценной квантовой сек^ции. Обнару-\'< положительная корреляция меаду величиной неквантовой секре-і АХ и степенью гиперполяризации синаптичэской области мышечно-кслокіїз в условиях инта.чт.чеи АХЭ. Вперит- токгпаяо, что блэкн-іяние ci'crevu захвата холина высокого сродства (СЗХВСЗ приводит ірекой^енн» ноквантоЕсп секреции, в то вре'-'.я как активирование '?:0 ";>;::л:'С7луь'г прекращению кекгантоьої' вікова АХ в процессе іт^лі-нсн и л.убаннк нервно-мышечных препаратов в проточном раст-:с. Получе.чы свидетельства в пользу того, что АХ неквантового техеддення участвует в регуляции УДП мышечного волокна.

Пстсженил, 5:;:с;і;:.:ьіе на зашиту. 1. Неквантовое освобождение АХ - особая форма нейросекрэцин, ичная от квантоЕ го освобождения мэдиатора, функционально зэнная с процессом захвата холила б нгркпоо окс-:г":гн8. ?. АХ неквантового пренехо-гдення является -' :н.н. :-. ^акторов держания гиперполяриэации сингптическои ооласти мемораны ыы-ного волокна по отношению к внесинаптнческой.

Научно-практическая ценность. Полученные дакние позволяют близиться к понимании молекулярк.-гх механизмов функционирования гемі: освобождения АХ в неквантовой форме, поскольку дают воз-чость прямо связать этот процесс с высокоаффинным транспортом

холина ъ нервную термикаль.

Установленный факт прекрапения неквантового освобождения АХ поело передавливания двигательного нерва на фоне продолжаюаейся спонтанной квантовой секреции явился основой для разработки моде ли селективной блокады неквантового выхода, что привело к получе нас убедительных доказательств участия АХ неквантового происхождения в регуляции КПП мышечного волокна.

Практическая ценность работы заключается в возможности использования полученных данных для более глубокого понимания взаимоотношений между нервом к мышцей, что необходимо для обоснования патогенеза нейродистрофических заболеваний, постденервационных изменений в опорно-двигательном аппарате и отравлений антихолинес-теразными препаратами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на I Всесоюзном биофизическом съезде СМосква, 19823, IV Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия меди-аторных процессов" (Москва, 1985), III сессии Научного Совета АН СССР по физиологии висцеральных систем (Ленинград, 1986), общеинститутской конференции молодых ученых (Казань, 1987), на научных заседаниях кафедры нормальной физиологии Казанского медицинского института и Татарского отделения Всесоюзного физиологического общества им. И. П.Павлова (Казань, 1988, 1989, 1990).

Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Данные исследования включены в лекционные курсы по нормальной физиологии, а также медицинской и биологической физике для студентов Казанского государственного медицинского института им. С. В. Курашова.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 138 стр., иллюстрирована 15 рисунками и 5 таблицами. Указатель литературы включает 188 работ, из них 155 - иностранных авторов.

Эксперименты проводили на нервно-мышечном препарате из диаф-рагмального нерва и полудиафрагмы беспородных белых мышей обоих полов. Для опытов брали взрослых половозреякх особей весом 18-20

»5 -

v, з йолртсте от 9 до 15 мосладв. Bcrsro било вспояъзовэло 1200 иіботкш:.

Для- приготовления ігерзио-гягпгочтготч?-препарата .тавотно* декапк-тировалн, вскрывал;? грудную клетку, брали на лигатуру левый диаф-рагка.яь:іил нерв на максимальном уваленая от дкар*»гш и.оті.репа-ройкуала до кеста зхохдения з ілкцу, после чгго отделяли переднэ-левый сектор диафрагмальнол мшяш о нервом, длина культм котоэого составлял?, и у менее 5 см. Препарати стмугаит от крови р течение in мпчут в 2-3 сменах растьога Ршігера-Кре-бса і. пснлічг.щ з 1 ;..>-чку, фиксируя мыкцу с помооьо тонких металлические ;»г* на дис:.е к смоли Sylg?td <<ЖА).

В t»"w? эксперимента через ваиаичку с ііі::сдл^:~~~ г ::? п?~ рвко-мшечкым препаратом вепреризно, со скоростьо і ил з кші. , перфузкроваяи раствор Ряигера-Кребса для теплокровных еяедувкего состава Се ммоль/я): Кай - 137,0; КС1 - 5,0; CaClg - 2,0; MgClg 1,0; йаНС0₃ - П.0; ffaHgP0₄ - 1,0; глвкоза - 11,0; рН раствора поддергивали на уровне 7,2-7,25; температура в большинстве экспериментов составляла 20+0,5С. В течекив 40-50 минут до начала а во вр.лш эксперимента раствор аэрировали газовой смесью, состоящей из 95% кислорода и Ъ'А 'углекислого газа.

Ял? необратимого ингибированйя АХЭ использовали сульфат авки-на ('СССР) в концентрации 1-Ю коль/л. Блокирование никотиновых холішорецептсрсЕ СУР) осуществляли d-тубскураринхлоридом CV/ellco-i?.e, Великобритания) в концентрации 1-10 мель/л.

Биопотенциалы регистрировали внутриклеточно, с помощью обычной микроэлектродной техники CLing, Gerard, 1949; Костик, 1960).

Спонтанное неквантовое освобождение АХ оценивали по величине Н-эффекта CVyskocil et al., 1983): в 16-25 мышечных волокнах : i-меряли МПП в синаптической области после необратимого ингкбирова-ния АХЭ армином при ..нкубашга в течение 30 минут, затем с помовіьв б-тубоь^раринхлорида блокировали ХР к через 5 минут вновь измеряли МПП синаптической области в 16-25 мышечных вояоконах; Н-зффек-том считали рааяицу между средними величинами МПП до и после блокады ХР. На каждое измерение МПП в 16-25 мышечных волокнах требовалось 3-5 минут.

При статистической обработке экспериментальных данных исполь-эовяти параметрический t-критерий Стьпдента СУрбая, 1963; Плохин-2кий, 1970; Лакин, 1980).