Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние несколько лет большое внимание уделяется изучению биоэлектрических свойств электроневозбудимых клеток и механизму возникновения осцилляции их мембранного потенциала. Эта достаточно новая область исследований дала неожиданный поворот в изучении сердца и механизмов его функционирования. Известно, что нормальный миокард содержит два типа клеточных компартментов. Первый - те или иные мноциты, представляющие собой электровозбудимые сократительные клетки и второй - сопутствующие немышечные клетки, которые электроневоэбудимы. Этот последний компартмент состоит из различных клеточных типов, где ломішнруют фибробласты, которые формируются в онтогенезе из нервной грубки. Показано, что на ранних этапах онтогенеза тубулярное сердце теплокровных содержит только мноциты и является гомогенной структурой. Дальнейшие этапы морфогенеза коррелируют с первыми сокращениями сердца. После этого морфогенез прогрессирует и появляются немышечные элементы, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, нервные клетки и фагоциты. В работах на сердце холоднокровных животных показано, что фибробласты сердца являются электроневозбуднмымн, но механосенситивными клетками и, как фибробласты других типов, вероятно, имеют ионные потенциалчувствитель-ные каналы, реагирующие на сжатие или растяжение. Их рецепторами являются впервые описанные в 1985 году F.Sachs механорецепторы, связанные с* ионными каналами. В зависимости от того активируются или инактивируются эти каналы при растяжении, они были названы stretch-activated (inactivated) channels. Мембраны подавляющего большинства возбудимых клеток содержат, как обнаружено в последние годы, не только потенциалзависимые и хемо-чувствительные, но и ионные каналы, функционирующие при механическом воздействии.
Физиологический ответ клетки на прямое механическое воздействие возникает как следствие взаимосвязанного функционирования ее структурных элементов и вторичных мессенжероз. Белки клеточной поверхности II экстрацеллюлярный метрике, связанные посредством трансмембранных белков с цитоскелетом, активируют ионные каналы при механической деформации клетки. Преобразование механического сигнала на уровне клетки может.
выражаться как в ее электрофизиологических, так и в биохимических ответах. Изменение концентрации биологически активных лигандов на поверхности клетки также может быть непрямым механизмом преобразования механического сигнала. Для ряда электроневозбудимых клеток показано, что механизм преобразования механического сигнала представляет собой комбинацию между передачей силы растяжения или сжатия через цнтоскелетные элементы на механосенситивные ионные каналы и преобразование силы растяжения їіли сжатия в биохимические сигналы на мехапопреобразующем участке клетки. Большинство авторов рассматривают в качестве принципиальной преобразующей системы F-актин микрофиламентов, поскольку показано, что стимуляция аденилатциклаэы и механосенситивный ответ клетки на деформацию ингибируется специфическим деполпмеризующим актин микрофиламентов агентом. Микрофиламентная сетка поддерживает натяжение в клетке, которое совместно с мнкротубулярной жесткостью определяет клеточігую форму.
Поскольку фибробласты сердца являются механосенситнвными клетками, было предположено, что они являются механоэлектрическим преобразователем в сердце и служат базовыми элементами для реализации механизма обратной связи между возбуждением н сокращением (Kohl et al., 1992), который пытаются найти на уровне кардиомиоцитов (Lab, 1982). Хотя гистологически фибробласты сердца изучены достаточно хорошо, их электрофнзнологнческое исследование проведено только в условиях культуры ткани неонатального сердца крыс (Rook et al., 1989) и на целом сердце холоднокровных животных (Kamkin, 1991; Kohl et al., 1992).
Эти исследования позволяют предположить, что сжатие или растяжение фнбробласта в моменты сокращения или расслабления миокарда через цнтоскелет вызывают изменение функционирования (активацию или инактивацию) stretch-activated channels и, как следствие, возникновение потенциалов, названных mechano-induced potentials (МІР). Можно предположить, что в формировании МІР принимают участие и осцилляции внутриклеточного кальция, что типично для электро'невозбудимых клеток. Проверке этой гипотезы посвящена настоящая работа.
Исходя из этих предпосылок мы сформулировали цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение механосенситивных клеток сердца крысы и исследование опосредованных через цитоскелет механизмов возникновения МІР у этих клеток.
Исследование включало решение следующих задач:
1) Электрофизиолопгческое выявление в сердце крысы механосенситив
ных клеток и картирование области их расположения;
2) Введение в исследуемые клетки флюоресцентного маркера Lucifer
Yellow для их идентификации;
-
Гистологическое исследование региона, содержащего максимальное количество изучаемых клеток;
-
Изучение электрофизиологических характеристик механосенситивных клеток сердца крысы;
-
Изучение роли внеклеточного и внутриклеточного кальция в генерации МІР.
-
Выявление роли stretch-activated channels в возникновении МІР механосенситивных клеток сердца крысы;
-
Изучение роли цитоскелета механосенситивных клеток сердца крысы в возникновении МІР.
Научная новизна работы
В результате выполнения настоящей .работы методами микроэлектродной-техники было показано, что в предсердиях крысы находятся механосенситив-ные клетки, биоэлектрические параметры которых сходны с биоэлектрическими параметрами немышечных клеток предсердий лягушки, описанных в литературе. Показано, что максимальное количество этих клеток расположено в регионе синусного узла сердца. Введение в исследуемые клетки маркера Lucifer Yellow для их предварительной идентификации с помощью флюоресцентной микроскопии подтверждает, что исследуемые клетки являются немышечными клетками сердца. Гистологическое исследование региона синусного узла с помощью электронной микроскопии выявляет там преимущественно кардиомио-Ц1ГГЫ и фибробласты, что соответствует литературным данным и позволяет допустить, что выявленные электрофиэиологическим методом клетки являются фнбробластами сердца. Изучено влияние на возникновение МІР специфического блокатора stretch-activated channels Gadolinium, который ннгибирует МІР как на фоне спонтанных сокращений препарата, так и при искусственном
растяжении ткани предсердий. Полученные данные свидетельствуют, что в возникновении МІР играют роль stretch-activated channels. Изучены эффекты внутриклеточного введения Cytochalasin В и Colchicine, которые ингибируют МІР, что свидетельствует о роли в их возникновении цитоскелета. Используя внутриклеточное введение хелатора кальция ВАРТА и внеклеточное добавление в бескальцпевую среду ЕСТА, было показано, что в генерации МІР принимают участие внеклеточный кальций и осцилляции внутриклеточного кальция.
Теоретическая и практическая значимость результатов и их внедрение
Выявление в предсердиях млекопитающих немышечных клеток - фнбро-бластов, которые могут играть роль механоэлектрического преобразователя в сердце, изучение их биоэлектрических параметров и механизмов генерации биоэлектрических потенциалов имеет большое теоретическое значение для понимания фундаментальных механизмов работы сердца.
Практическое значение работы заключается в том, что с позиций известных представлений о роли фнбробластов в сердце и получении данных о механизмах нх функционирования можно определить новые направления в фармакологической коррекции ряда сердечных заболеваний.
Основные положения, внногииьщ на зашиту
-
В зоне синусного узла сердца крысы выявлены электроневозбудимые, но механосенентивные клетки, которые на основании электрофизиологических данных мы относим к фибробластам сердца.
-
Результаты введения в изучаемые клетки флюоресцентного красителя Lucifer Yellow свидетельствуют о том, что исследуемые механосенентивные клетки являются немышечными клетками, а гистологический. анализ зоны локализации микроэлектрода выявил в этом районе преимущественно кардномиоциты и фибробласты.
-
Совокупность гистологических и электрофизиологических данных позволяют допустить, что исследуемые клетки - фибробласты сердца, МІР которых вызван как спонтанными сокращениями, так и искусственным растяжением ткани и возникает с задержкой относительно потенциала действия близлежащего кардиомиоцита, но практически синхронно с пиком мехапограммы.
-
В основе механизма возникновения МІР лежит, с одной стороны, ирополнмость мембраны для ионов кальция через stretch-activated channels,
контролируемые цитоскелетом, а с другой стороны, внутриклеточные осцилляции ноноз кальция.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на Scientific Meeting of the Physiological Society of United Kingdom (UK, Southampton, 1993), International Symposium Biological Motility (Россия, Путино на Оке, 1994), XV European Section Meeting of International Socie'v for Heart Research (Denmark, Copenhagen, 1994).
Диссертация апробирована на объединенном заседании кафедры нормальной физиологии с курсом физиологии медико-биологического факультета РГМУ и кафедры морфологии медико-биологического факультета РГМУ.
Структура и объем работы