Содержание к диссертации
Введение
1 Анализ подходов к разработке микробиотеста на основе еальванотаксической реакции инфузорий 10
1.1 Особенности биологического контроля в экотоксикологии 10
1.1.1 Этапы развития экотоксикологии 10
1.1.2 Методы экотоксикологии 11
1.1.3 Биоиндикация 12
1.1.4 Биотестирование 13
1.2 Биотехнологические микробиотесты 15
1.2.1 Преимущества 15
1.2.2 Аппаратурные методы 16
1.2.3 Микробиотест как биотехническая система 19
1.3 Аспекты применения тест-реакции гальванотаксиса инфузорий Paramecium Caudatum для разработки аппаратурного микробиотеста 20
1.3.1 Гальванотаксическая реакция инфузорий P.Caudatum 20
1.3.2 Математические модели тест-реакции 22
1.3.3 Биотехническая система для исследования гальванотаксиса 23
1.3.4 Измерительные преобразователи устройства контроля тест-реакции гальванотаксиса 24
1.4 Принципы оценки результатов биотестирования 29
1.4.1 Принципы построения зависимости в токсикологии 29
1.4.2 Явление стресса 31
1.4.3 Индексы токсичности 32
1.5 Выводы по главе 34
2 Математическая модель гальв анотаксической реакции 36
2.1 Моделирование этапов реакции 36
2.1.1 Моделирование первого этапа 37
2.1.2 Второй этап реакции 38
2.2 Моделирования оптических характеристик сигнала 39
2.3 Алгоритм программы моделирования динамики гальванотаксиса 40
2.4 Исследование модели динамики гальванотаксиса 42
2.4.1 Исследование математической модели одиночных гальванотаксических импульсов 43
2.4.2 Исследование параметров модели, влияющих на форму импульса 45
2.4.3 Исследование модели импульсной гальванотаксической последовательности 50
2.5 Выводы по главе 53
3. Спектрофотометрическое исследование гальванотаксиса при однократном переключении полярности 54
3.1 Спектрофотометрическое исследование взвеси клеток 54
3.2 Спектрофотометрические исследования гальванотаксической реакции P.Caudatum 57
3.2.1 Исследования процесса гальванотаксиса в разных зонах кюветы 57
3.3 Исследование статистической значимости математической модели.. 61
3.3.1 Исследование адекватности математической модели с однократным переключением полярности в разных зонах кюветы в чистой среде 61
3.3.2 Исследование адекватности математической модели с однократным переключением полярности в приэлектродных зонах кюветы в токсичной среде 65
3.4 Исследование влияния биологических и технических факторов на гальванотаксический сигнал тест-реакции 68
3.5 Исследование реакции гальванотаксиса при добавлении модельного токсиканта при однократном переключении полярности 74
3.6 Гальванотаксическии сигнал с многократным переключением полярности в протяженной кювете 78
3.7 Исследование случайной составляющей сигнала 82
3.8 Выводы по главе 85
4 Биотехническая система для реализации метода контроля токсичности водных сред по реакции динамики гальванотаксиса 86
4.1 Концепция биотехнической системы 86
4.1.1 Концепция тест-реакции 87
4.1.2 Концепция средств контроля тест-реакции 87
4.1.3 Структура биотехнической системы 88
4.2 Организация подготовительных этапов эксперимента 89
4.2.1 Методология проведения эксперимента 89
4.2.2 Линия подготовки тест-организма 90
4.2.3 Линия подготовки пробы 90
4.2.4 Линия подготовки принадлежностей и материалов 91
4.3 Гальвальванотаксическая ячейка 91
4.3.1 Электроды 91
4.3.2 Кюветный модуль для тест-реакции 92
4.4 Источник электрических стимулов 94
4.4.1 Функции источника электрических стимулов 94
4.4.2 Генератор сигналов специальной формы 94
4.4.3 Специализированный генератор импульсов 96
4.5 Устройство контроля реакции 98
4.5.1 Метрологические характеристики 98
4.5.2 Обоснование условий оптического контроля 99
4.6 Метрологические аспекты измерения тест-реакции 100
4.6.1 Виды погрешностей измерений, их учет и минимизация 100
4.6.2 Идентификация зоны оптического контроля 101
4.6.3 Изменение проходящего потока 102
4.6.4 Влияние размера апертуры 103
4.6.5 Определение величины сигнал-фон 105
4.7 Выводы по главе 108
5 Исследование тест-реакции динамики гальванотаксиса в поле переменной полярности 109
5.1 Исследование адаптации инфузории P.Caudatum к химическим веществам при культивировании 109
5.2 Особенности динамики гальванотаксического сигнала 111
5.2.1 Динамика гальванотаксического сигнала в безвредной среде... 111
5.2.2 Исследование установившейся фазы сигнала 112
5.3 Исследование сигналов при разной концентрации клеток в кювете 114
5.3.1 Сравнение данных эксперимента и результатов математического моделирования 114
5.3.2 Обоснование диапазона рабочей концентрации 115
5.4 Исследование переходной фазы сигнала 117
5.5 Разработка метода контроля токсичности водных сред на основе динамики гальванотаксиса в поле переменной полярности 122
5.6 Выводы по главе 128
Заключение 129
Список литературы 130
- Измерительные преобразователи устройства контроля тест-реакции гальванотаксиса
- Исследование модели импульсной гальванотаксической последовательности
- Исследование адекватности математической модели с однократным переключением полярности в разных зонах кюветы в чистой среде
- Кюветный модуль для тест-реакции
Введение к работе
Актуальность работы. Многообразные загрязняющие вещества, попадая в окружающую среду, могут претерпевать в ней различные изменения, усиливая при этом свое токсическое действие. Это приводит к необходимости разработки комплексных, интегральных методов контроля качества объектов окружающей среды. Эти задачи решает экотоксикология, одним из основных методов которой является биотестирование - технология, при которой лабораторно выращенные организмы, биологические системы или биологические процессы (тест-объекты) используют для измерения эффектов (тест-реакций), вызванных химическим воздействием.
По мере повышения уровня организации живого усложняется идентификация воздействия вредного фактора и увеличивается время проявления вызванного им эффекта. Биотестирование на уровне популяций микроорганизмов позволяет существенно сократить время выявления эффекта и оценить степень вредности для определенных форм живого, и создать предпосылки для разработки аппаратурных методов. В настоящее время большинство подобной аппаратуры ориентировано на использование в качестве тест-объекта штаммов бактерий, тогда как главным требованием международных стандартов в области биотестирования является применение организмов нескольких филогенетических уровней и тест-реакций.
К перспективным популяционным реакциям, которая уже апробирована, как тест-реакция токсичности водных сред, относится гальванотаксис инфузорий P.Caudatum, проявляющийся в перемещении микроорганизмов под действием внешнего управляющего электрического поля. Поле переменной полярности дает новые возможности применения динамики гальванотаксиса для исследования особенностей влияния токсиканта на популяцию.
Целью диссертационной работы является разработка метода и средств контроля токсичности водных сред по тест-реакции динамики гальванотаксиса инфузорий P.Cadatum.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Разработать математическую модель, отражающую пространственно-временную динамику оптических характеристик взвеси инфузорий при протекании гальванотаксиса в чистой и токсичной средах.
Разработать биотехническую систему контроля токсичности водных сред, с применением в качестве тест-реакции динамики гальванотаксиса.
Разработать метод и систему регистрации динамики гальванотаксиче-ской тест-реакции в поле переменной полярности.
Разработать аппаратный метод контроля токсичности водных сред, позволяющий получить функциональную зависимость и количественный критерий, отражающие токсичность среды и особенности воздействия токсиканта на тест-объект.
Объектами исследования являются система биотестирования токсичности водных сред.
Предметом исследования является информационное, методическое, метрологическое и аппаратное обеспечение системы биотестирования.
Методы исследования Исследование базируется на методах математического описания процессов популяционного движения микроорганизмов рекуррентными последовательностями, методах построения биотехнических систем, методах исследования биологических сигналов, методах фотометрии и исследования случайных процессов и сигналов.
Новые научные результаты:
Рекуррентная математическая модель, одновременно учитывающая пространственно-временную динамику распределения клеток по объему кюветы, количество переключений полярности, этологические особенности микроорганизмов и характеристики их светорассеяния, позволяющая прогнозировать и описывать фазы реакции.
Обобщенная структура биотехнической системы, позволяющая проводить контроль токсичности водных сред по реакции динамики гальванотаксиса инфузорий.
Метод и средства регистрации, позволяющие получить новый сигнал динамики гальванотаксиса по показателю кинетики оптической плотности взвеси, образующий импульсную последовательность.
Метод контроля токсичности водных сред с применением тест-реакции динамики гальванотаксиса инфузорий.
Практическая ценность работы:
Обоснована последовательность метода контроля токсичности водных сред на основе оптического контроля тест-реакции в приэлектродной зоне кюветы, обеспечивающего выделение сигнала на фоне помех и его идентификацию.
Разработан макет экспериментального блока формирования новой гальванотаксической тест - реакции на основе мультивибратора и метод ее регистрации в виде импульсной последовательности с помощью стандартного фотометрического прибора.
Обоснованы информативные признаки токсичности на основе анализа огибающей амплитуд импульсов.
Предложенный индекс токсичности позволил выявить различия влияния соединений тяжелых металлов на микроорганизмы при тест-реакции и получить статистически воспроизводимые численные значения, соответствующие их ПДК.
Положения, выносимые на защиту: 1. Метод биотестирования с использованием динамики гальванотаксиса в качестве тест-реакции позволяет, на основе измерения кинетики оптической плотности взвеси клеток, получать показатели токсичности водных сред.
2. Система формирования и регистрации гальванотаксического сигнала, обоснованная с помощью рекуррентной математической модели, позволяет получить импульсную последовательность как процесс перехода к установившемуся состоянию, характеризующему количество жизнеспособных микроорганизмов в популяции.
Достоверность результатов обеспечена использованием при их получении надежных и проверенных теоретических представлений и экспериментальных методов и технологий; численными расчетами, проведенными на основании полученных соотношений; статистическими оценками величин и характера вытекающих из них зависимостей с использованием надежных экспериментальных данных.
Внедрение результатов работы. Результаты работы внедрены в НИР БЭС-100 «Разработка теоретических основ построения биотехнических систем оценки и управления состоянием человека и окружающей среды», 2009-2010 гг.; НИР БЭС-112 «Теоретические и физические исследования измерительных процессов в системах био- и техногенного происхождения», 2009-2010 гг.; МРИ-БЭС-105 «Теоретические основы построения телемедицинских систем профилактики здоровья учащихся региона» 2009-2010 гг.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных конференциях по Мягким вычислениям и измерениям (SCM) - Санкт-Петербург 2005, 2006, 2007 гг., на международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» - 2006 г., на Всероссийских научно-практических конференциях «Проблемы прогнозирования и предотвращения чрезвычайных ситуаций и их последствий» - Санкт-Петербург 2004, 2005, 2006 гг., на Всероссийской конференции «Региональная информатика» - Санкт-Петербург 2008 г., на Всероссийских конференциях «Медицинские информационные системы (МИС)» - Таганрог 2009, 2010 гг., на Научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского государственного электротехнического Университета (ЛЭТИ) 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.
Публикации по работе. Основные теоретические и практические результаты диссертации опубликованы в 18 научных работах, из них - 7 статей, среди которых 5 опубликованы в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК, 11 работ - в материалах международных, всероссийских и межвузовских научно-практических конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, списка литературы, включающего 75 наименований, и двух приложений. Основная часть работы изложена на 140, страницах машинописного текста. Работа содержит 14 таблиц и 76 рисунков.
Измерительные преобразователи устройства контроля тест-реакции гальванотаксиса
Для контроля двигающегося гальванотаксического слоя использовался специализированный фотометр турбидиметрического типа на основе оптопары. Он включал источник излучения и приемник, размещенные на одной оси и контролирующие мутность среды в зазоре между источником и приемником.
Для контроля движения всей перемещающейся полосы организмов использовался фотоприемник, геометрические параметры которого соответствуют параметрам слоя взвеси инфузорий. Для регистрации характеристик сигнала ширина фотоприемника была достаточно малой, чтобы фиксировать слой клеток наибольшей концентрации, вносящий наибольшее ослабление потока.
Светодиод со сформированным потоком создавал освещенность на фотоприемнике с узкой прямоугольной апертурой, что позволяло выделять слои с концентрацией инфузорий. Источник и приемник излучения размещались на некотором отдалении от электродов. В установке применялся фотоприемник с прямоугольной апертурой, соответствующей высоте слоя взвеси, на основе современного позиционного детектора S3931 с размерами фотоэлемента 1x6 мм. В качестве источника излучения использован высокоинтенсивный светодиод EL 1363URC-3 с углом рассеяния 3 и диаметром 10 мм, что обеспечивает равномерное освещение апертуры фотоприемника.
Особенность процесса регистрации гальванотаксиса выбранным способом заключается в том, что он синхронизирован с фазами переключения полярности электродов. На рисунке 1.7 представлена структурная схема макета экспериментальной установки.
Сигнал, обусловленный гальванотаксическим перемещением слоя инфузорий, может быть охарактеризован амплитудными и временными параметрами, что позволяло изучать особенности воздействия токсичных веществ на живое. Время реакции организмов составляет минуты. Гальванотаксиче-ский сигнал представляет собой импульс с двумя наклонными фронтами, при этом передний фронт имеет больший угол наклона, чем задний. Пример сигнала показан на рисунке1.8, где ряд 1- сигнал снимаемый при отсутствии напряжения, ряд 2- гальванотаксический сигнал. Измерительный преобразователь для контроля пространственно-временного распределения оптических характеристик взвеси инфузории. В работе [15] был предложен преобразователь турбидиметрического типа на основе оптопары, где в качестве приемника использовалась ПЗС-линейка. Устройство контроля тест-реакции представляет собой аппаратно-программный комплекс (АПК). Структурная схема аппаратной части представлена на рисунке 1.9. В ней можно выделить следующие элементы: первичный измерительный преобразователь (ПИП), схему двойной коррелированной выборки (ДКВ) для снижения шумов ЛФП, драйвер аналого-цифрового преобразователя (ДРВ) для адаптации электрического сигнала к входным напряжениям АЦП, блок формирования гальванотаксических сигналов (БФГТС), управляющий всеми элементами микроконтроллер (МК), интерфейс с персональным компьютером (ПК) и сам ПК. Все элементы АПК кроме ПИП, являются формирователем накопителем массива данных (ФРГМД). Формирователь-накопитель массива данных (ФНМД) предназначен для преобразования светового сигнала в электрический, снижения кТ/С-шума, повышения контрастности изображения и его оцифровки. ПИП состоит из светодиода СИД, системы формирования параллельного пучка СФПП, диафрагм Д1 и Д2, кюветы с исследуемым объектом ИО, аттенюатора А и ЛФП. Диафрагма Д1 из параллельного потока излучения с круглым сечением (диаметр 55 мм) вырезает поток с прямоугольным сечением (с шириной 2 мм и высотой 50 мм), который, пройдя кювету с тест-объектом и диафрагму Д2, формирует светотеневую картину на поверхности ЛФП. Для считывания сигналов с ЛФП в МК формируются сигналы кадровых импульсов» и тактовых импульсов. Сигнал поступает на схему двойной коррелированной выборки ДКВ, которая снижает шумы ПЗС линейки. На вычитающем устройстве ВУ из сигнала, пришедшего с ДКВ; вычитается постоянная составляющая, сформированная на ЦАП. Сигнал на ЦАП 4 управляется МК. Коэффициент усиления усилителя У определяется сопротивлением цифрового потенциометра ЦП. Усиление определяется цифровым» кодом, посланным МК на ЦП. Усиленный сигнал поступает на АЦП. Из цифрового кода, полученного с АЦП, МК формирует пакеты данных. Эти пакеты передаются через интерфейс в персональный компьютер ПК. С помощью специально разработанного программного обеспечения информация о светотеневой картине представляется на дисплее монитора ПК и записывается файл для дальнейшей обработки. Для формирования гальванотаксических сигналов МК задает значение сопротивления ЦП в БФГТС. ЦП включён по схеме делителя напряжения вместе с буферным усилителем БУ. Значение напряжения с БУ подается на дифференциальный усилитель ДУ. Для установки средней точки необходимо воспользоваться схемой установки нуля СУН. МК записывает среднее значение в ЦП, а СУН позволяет в ручном режиме установить нулевое значение напряжения на выходе ДУ при первой настройке комплекса. Сигнал с ДУ подается через БУ на электроды Э.
Для управления ЦП, ЦАП с помощью ПО ПК формируются команды управления. МК выполняет команды и регулирует параметры системы. На рисунке 1.10 представлен изображение гальванотаксического сигнала при вертикальном расположении электродов, полученного с описанного измерительного преобразователя.
Исследование модели импульсной гальванотаксической последовательности
При уменьшении а и /? амплитуда сигналов падает с 0,22 до 0,03 ед. пт. плотн. в 1 ячейке, с 0,08 до 0,02 во 2 ячейке, с 0,12 до 0,03 в 6 ячейке, с 0,18 до 0,05 в 10 ячейке и с 0,22 до 0,05 в 11 ячейке. Меняется так же и форма сигнала. При больших значениях а и /? импульсы в центральных ячейках получаются более острыми и их фронты накладываются друг на друга, при-электродные импульсы принимают прямоугольную форму, а при малых значениях форма всех импульсов расплывается, стремясь к треугольным импульсам с затянутыми фронтами.
Сравнение результатов эксперимента и данных моделирования, приведенные в главе III, показали, что в чистой среде (среде культивирования инфузорий Лозина-Лозинского) а = /? = 0,2. Эксперименты, проводимые с разными концентрациями модельного токсиканта C11SO4, показали, что его влияние сказывается на значениях доли а, при этом значение /? остается равным 0,2, то есть значение этой доли не определяет характер сигнала. Поэтому а была исследована подробнее.
Прежде всего, сигнал в ячейке №11, как показано на рисунке 2.7, можно разделить на две фазы: фаза роста сигнала и фаза насыщения. Из рисунка 2.7 видно, что чем выше значение а, тем меньше и круче подъем участка линейного роста оптической плотности.
Была исследована зависимость доли а от количества отсчетов к, в течении которых подъем сохраняет линейный характер. Эта зависимость описывается степенным трендом а = 12,3k"1 2 с R2 = 0,993.
Поскольку, согласно определению гальванотаксической реакции, основным параметром, определяющим перемещение клеток, является разность потенциалов, поэтому скорость движения клеток можно найти как производную от уравнения тренда линейного участка. Эта зависимость описывается линейным трендом U = 0,0018а +0,0002 (R2 = 0,97). Согласно экспериментальным данным, приведенным в главе III, увеличение скорости клеток на 0,002 ед. опт. плотн. вызывается увеличением напряжения на электродах на 0,5 v, поэтому зависимость доли а от напряжения выглядит как зависимость с линейным трендом R = 0,99:
Эта зависимость объясняет, почему в экспериментальных данных значение a обычно не превышает 0,3 (см. гл. III). При напряжении на электродах больше, чем 3 v, клетки погибают, следовательно, значение а ограничено порядка 0,35-0,40.
Изменяющееся значение а при постоянном /? = 0,2 моделирует токсичность среды Подробно этот вопрос рассмотрен в сравнении с экспериментальными данными в главе III, а на рисунке 2.8 приведены графики сигналов при /? = 0,2 и разных а, что как предполагается имитирует разную степень токсичности исследуемой пробы.
Амплитуда сигнала в 1 ячейке при снижении а на 0,15 ед. выросла приблизительно на 0,02 ед. опт. плотн., во 2 ячейке остается практически неизменной 0,034±0,002, а в остальных ячейках падает: на 0,014 ед. опт. плотн. в ячейке №6, на 0,042 ед. опт. плотн. в ячейке №10 и на 0,092 ед. опт. плотн. в ячейке №11.
Математическое моделирование одиночных импульсов показало, что изменения таких параметров как концентрация клеток в кювете, доли клеток, способных двигаться против градиента потенциала электрического поля, долей а и Р легче оценить по амплитуде сигнала в приэлектродных ячейках. Токсичность, как показали эксперименты, описанные в главе III, наиболее наглядно выявляется в приэлектродных ячейках, поэтому для исследования динамики гальванотаксической реакции была выбрана электродные ячейки. Для исследования функциональной зависимости динамики гальванотаксической реакции необходимо было промоделировать процесс гальванотаксиса в поле переменной полярности.
Компьютерная модель строилась по алгоритму, приведенному на рисунке 2.2, а параметры модели были такими же, как и в п. 2.4.1. На рисунке 2.9 приведен вид сигнала, полученный в ячейке № 11 в модели с т = 9. Каждый пик импульса на рисунке соответствует нечетному по порядку переключению полярности, а каждое минимальное значение - четному, поэтому для этого сигнала функциональная зависимость динамики реакции будет выглядеть как огибающая импульсов.
Исследование адекватности математической модели с однократным переключением полярности в разных зонах кюветы в чистой среде
В первой главе была поставлена цель исследования возможности создания методов и средств контроля токсичности водных сред на основе реакции доза-ответ и предложено применение тест-реакции гальванотаксиса инфузорий при многократном переключении полярности напряжение для достижения этой цели.
Во второй главе были разработаны математические и компьютерные модели, позволяющие описывать и прогнозировать изменения оптической плотности взвеси инфузорий в разных зонах кюветы при однократном и многократном изменении полярности. Были промоделированы формы сигналов, обусловленные изменением оптической плотности гальванотаксического слоя, не только в центре, но и у электродов, где они имеют большую, чем в центре амплитуду. Был спрогнозирован эффект получения установившегося уровня сигнала при его съеме в электродной зоне при многократном переключении полярности в контроле и опыте.
В третьей главе были подтверждены возможность использования стандартной фотометрической аппаратуры на примере спектрофотометра СФ-56 и параметра оптической плотности для измерения концентрации инфузорий. На основе контроля зон кювет доказана адекватность математических моделей реальным сигналам кинетики оптической плотности взвеси, полученным при гальванотаксисе инфузорий в протяженной кювете. Были экспериментально выявлены большая чем в центре стабильность сигналов от взвеси возле электродов и большая их амплитуда. Проведение гальванотаксиса инфузорий при многократном переключении полярности напряжения позволило экспериментально подтвердить эффект установившихся уровней сигнала в опыте и контроле.
Достоинством метода организации гальванотаксиса в протяженной кювете является возможность контроля сигналов в разных зонах кюветы за длительный период времени (60-150 сек), что позволило исследовать процесс образования единичного гальванотаксического импульса и выявить эффект токсического стресса. К недостаткам этого метода следует отнести большую длительность реакции, особенно при многократном переключении полярности и нестандартность принадлежностей тест-реакции (протяженной горизонтальной кюветы использованных размеров) для фотометрических измерений, что может создать сложности для пользователей.
Конечным результатом биотестового аппаратурного метода является построение функциональной зависимости. Для этого необходимо обеспечить многократное переключение полярности постоянного напряжения для формирования ряда гальванотаксических импульсов. Использование для этой цели протяженной кюветы не рационально, поскольку ее геометрические размеры существенно увеличивают длительность единичного импульса гальванотаксиса (60-120 с). В стандартной вертикальной кювете размером 45x13x13 мм гальванотаксический импульс, как показали экспериметы, формируется всего за 10-15 с, что позволило сократить время протекания реакции с 600 до 400 с и определило использование вертикальной кюветы для разработки блока формирования тест-реакции, компактные размеры которой упрощают разработку конструкции кюветного модуля.
В качестве источника напряжения необходим генератор биполярных импульсов. Для решения исследовательских задач он должен обеспечивать регулируемую амплитуду и длительность, а для пользовательских - фиксированные амплитудно-временные параметры.
На основании результатов экспериментальных исследований (гл. III) был сделан вывод о возможности применения для контроля тест-реакции стандартной фотометрической аппаратуры типа спектрофотометрического комплекса СФ-56 (технические характеристики комплекса приведены в Приложении 1). В качестве исходного параметра измерения оптических свойств была взята оптическая плотность взвеси инфузорий, измеряемая в режиме кинетики в электродной зоне кюветы (см. 4.1.1).
Существенной проблемой для контроля предложенной экспрессной тест - реакции гальванотаксиса является отсутствие в стандартной фотометрической аппаратуре модулей-держателей кювет, позволяющих контролировать процессы возле стенки кюветы. Для решения данной задачи был сделан вывод о необходимости разработки адаптера - кюветного модуля с держателем, позволявшим смещать кювету по оси и вертикали относительно апертуры оптического канала, так чтобы контролировать весь слой взвеси инфузорий возле катода. Разработка адаптера потребовала также исследования погрешностей съема сигнала при разных оптических помехах.
Спектрофотометрический комплекс СФ-56 включает несколько видов программного обеспечения для реализации различных функций: для настройки режимов измерения, для формирования итоговых файлов и для обработки графиков сигналов. К сожалению, все эти виды программного обеспечения не позволяют реализовывать комплексные алгоритмы обработки биотестовой информации, поэтому было необходимо дополнить универсальное программное обеспечение специализированным.
Структура биотехнической системы для исследования гальванотакси-ческой реакции и создания на ее основе экспресс-контроля реакции доза-эффект, связывающая в единый контур биологические и физические элементы, представлена на рисунке 4.1. (В зависимости от задач системы в качестве оператора-исследователя (О-И) выступает научный работник или сотрудник экологического центра контроля водных сред).
Метод биотестового, аппаратурного контроля токсичности, разрабатываемый в диссертационной работе, основан на измерении информативных параметров тест-реакции популяции тест-организмов при воздействии вредных веществ и построении на этой основе кривой «доза-ответ». Основным критерием применимости тест-реакции в качестве токсикологического метода контроля среды является воспроизводимость результатов эксперимента, который реализуется путем формирования БТС, Для ее обеспечения необходимо проанализировать и учесть как биологические, так и технические факторы БТС.
Кюветный модуль для тест-реакции
Чтобы оценить способность популяции клеток к адаптации к загрязняющему веществу, были проведены опыты по исследованию влияния загрязнителей на процесс культивирования. В качестве критерия влияния токсичных веществ было выбрано всплытие клеток или отрицательный геотаксис. Было сделано предположение, что если рассматривать всплытие или отрицательных геотаксис как физиологическую реакцию клеток, то токсичные вещества способны ее подавлять.
Приготавливали среду Лозины-Лозинского (Л-Л) для культивации инфузорий следующего состава на литр: NaCI - 100 г, KCI - 10 г, MgS04 - 10 г, СаСЬ х 2Н20 - 10 г, NaHC03 - 20 г. В три колбы со средой добавляли по одному виду токсичного вещества из расчета 0,02 г/л - C11SO4, N1SO4, ZnS04 соответственно. В каждую колбу вносили пипеткой взвесь 5 мл инфузорий с концентрацией 1000 кл/мл и разбавляли приготовленными растворами до 50 мл. В качестве контроля использовали колбу с безвредной средой. После чего добавляли корм и выращивали 7 дней. Через 7 дней культуру отмывали от продуктов метаболизма и старого корма. При отмывании использовали нормальную физиологическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости. Культуру, очищенную от продуктов метаболизма вновь разбавляли раствором с токсическим веществом и добавляли корма.
Через каждые 7 дней осуществлялся контроль сохранения способности организмов всплывать вверх (оценивался процент микроорганизмов от общей массы). Организмы, сохранившие данную реакцию, культивировались следующие 7 дней.
Самую высокую токсичность в опытах проявило соединение N1SO4. Несмотря на то, что способность к всплытию у парамеций, выращиваемых на NiS04 и CuS04 изчезает на 21-й день, в течении всего эксперимента процент всплывающих в растворе с NiS04 меньше. При наличии в среде Z11SO4 в течении 21 дня процент всплывающих падает и остается на уровне 5 % при продолжении опыта, поэтому ZnS04, по результатам этого эксперимента обладает наименьшей токсичностью.
Таким образом, эксперимент показал, что свойство всплытия в токсичной среде не сохраняется, а исчезает. Добавление токсичных веществ в процессе культивации приводит не к адаптации, а к сенсибилизации, т.е. к увеличению чувствительности микроорганизмов к токсиканту в новых поколениях. Такое свойство наиболее выражено при добавлении солей никеля, чуть меньше - меди и менее остальных при воздействии солей цинка. Поскольку гальванотаксис так же является физиологической реакцией, то и он должен подавляться токсичными веществами.
Оптический сигнал гальванотаксиса, формируемый в поле переменной полярности - это особый вид биотестового сигнала. Он представляет собой последовательность гальванотаксических импульсов с разными амплитудами. В главе III был подробно исследован единичный импульс и показано, что основной характеристикой, которая изменяется при воздействии токсичности, является амплитуда. Особенности нарастания амплитуд в безвредной среде были исследованы.
Исследование проводилось следующим образом: в стандартную фотометрическую вертикальную кювету помещалась взвесь в концентрации 2000 кл/мл и разбавлялась средой культивирования в соотношении 1 мл : 1 мл, чтобы концентрация составляла 1000 кл/мл, затем в кювету погружались электроды. Кювета с электродами помещалась в кюветный модуль, расположенный в спектрофотометре, где электроды подключались к источнику электрических стимулов, описанному в п. 4.4.3. Во время эксперимента полярность менялась 27 раз за 400 сек. На рисунке 5.2 представлена типичная кривая, получаемая в среде культивирования.
Согласно положениям математической модели, описанной в п. 2.4.3, первый импульс меньше остальных на 0,06 отн. ед. опт. плотн. по амплитуде, а остальные имеют одинаковую амплитуду. Такая форма модельного сигнала определяется величиной д, т.е. долей клеток, способных двигаться против градиента потенциала электрического поля. В модели эта величина носила постоянный характер, но эксперименты показали, что она является переменной, что может объясняться эффектом стресса.
Как показано на рисунке 5.2, в первые секунды действия электрического поля, реакция гальванотаксиса проявляется у небольшого количества микроорганизмов, но постепенно все больше клеток проявляют направленное движение и амплитуды импульсов начинают колебаться вблизи значения оптической плотности, соответствующего максимальному количеству инфузорий в кювете.
Таким образом, сигнал разбивается на два равных участка: участок длительность 0... 200 с характеризуется ростом амплитуды импульсов (14 имп.), а участок 201...400 с - стабилизацией сигнала вблизи определенного значения (13 импульсов). У сигнала, представленного на рисунке 5.2, рост амплитуд импульсов имеет линейный тренд у=0,013х+0,022 с коэффициентом аппроксимации R2 = 0,99, а стабильный уровень - среднее значение 0,154±0,004.
Аналогичные изменения наблюдались в других экспериментах безвредной среде гальванотаксические импульсы увеличиваются по амплитуде первые 200 с и достигают уровня, сохраняющего стабильность следующие 200 с.
