Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Знание нейронного строения мозга человека в норме и его изменение при неврологических и психических заболеваниях имеет огромное фундаментальное и практическое значение для современной нейробнологни. Данная область нейронауки оказалась настолько значимой для общества, что последние 10 лет XX века были провозглашены "Декадой изучения мозга человека". Так как большая часть информации (до 95%) со стороны других нейронов приходит на дендриты нейрона, представляется чрезвычайно важным исследовать нейроны вместе с их отростками. Дпя такого нейронного картирования мозга человека (НКМЧ) необходимо морфологическое описание трехмерной структуры отдельных нейронов разных типов с их отростками (дендритами и аксонами) и их точного Местоположения в формациях мозга. Это позволит лучше понять функциональное значение отдельных областей мозга в норме и их изменение в патологии. В литературе существуют немногие работы по нейронному строению неокортекса человека в норме (Cajai, 1909; Lorente de No, 1933; Поляков, 1949-1979; Школьник-Яросс, 1965; Marin-Padilla, 1970-1984; Антонова, 1972-1983; Purpura, 1975; H. Braak, 1976; Scheibel and Scheibel, 1978; E. Braak, 1982; Mrzljak et al., 1988; Kostovic, 1990; Uylinqs and Van Eden, 1990). Была создана классификация нейронов коры, исследован их пре- и постнатальный онтогенез дпя части попей неокортекса. Литературные данные относительно патологических изменений нейронов с их отростками при различных неврологических и психических заболеваниях единичны ( Huttenlocher, 1974; Scheibel et al., 1974; Williams, 197b; Scheibel, 1981; Dondarier et al., 1986; Robain et al., 1089), не систематичны или совсем отсутствуют. В работах по патологии нейронов при различных заболеваниях в основном'- уделялось внимание изменению дендритов пирамидных нейронов и было найдено уменьшение числа дендритных циников. Большинство работ выполнено методом импрегнации нейронов ю Гопьдхн в различных его модификациях. Однако, собственный опыт (2-4) и данные литературы (Е, Braak, 19В2; Mrzljak et al., 1988; D данной работе применена оригинальная стратегия трехмерного нейронного картирования коры мозга человека, включающая внутриклеточное введение . флуоресцентного красителя люциферового желтого (ЛЖ), внутриаксональный транспорт флуоресцентных карбоцианнновых красителей (в основном Dil, DiA, faat Dil) в комбинации с иммунофлуоресцентныы методом выявления биологически активных веществ и конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (КЛСМ). Работа включала два раздела» 1) Изучение нормальной нейронной структуры коры мозга человека без неврологических нарушений; 2) Исследование патологии нейронов коры мозга больных детей с диагнозом лекарственно-резистентной ("геннуинной") эпилепсии (ЛРЭ) и больных с диагнозом синдрома Ретта (СР), при котором эпилептические припадки удается контролировать медикаментозно. Изучение детской ЛРЭ имеет большое социальное и практическое значение. Как показывает клинический опыт, у эти больных эпипептогенные припадки возникают довольно рано (в возрасте 0-7 лет). Применение различных повніших антнэпилептических препаратов в течении последующих 10-15 лет не дает достаточного эффекта и в возрасте 15-20 нет им производится нейрохирургическая операция по поводу удаления эпилентогенного очага. В многочисленных современных клинических работах показано, что данный вид эпилепсии в большом числе случапв полностью излечивается после подобного нейрохирургического вмешательства или значительно снижается число эпилептических припадков (Carlson, 1994; Malmgren and Sullivan, 1994; Uvebrant, 1994). Таким 'образом, получается парадоксальная ситуация, в которую попадает часть больных с ЛРЭ і в 15-20 лет они избавляются от эпилепсии, однако потенциальные способности мозга к обучению и пластичности, присутні детскому возрасту, упущены, так как частые приступы не давали ни возможности нормального занятия з окопе. Действительно, данные (физиологические, психологические, морфологические) по постнатлльному развитию детей показывают, что пластические способности мозга человека наиболее развиты в ранний детский период и претерпевают значительные изменения с возрастом (в сторону их уменьпоння;(см. напр. Никитина, 1971; Kostovic, 1990). На этот период жизни ребенка (6-15 пет) приходится и наиболее продуктивное обучение его в школе. Учитывая вышесказанное, очевидно, хакое важное социальное и практическое значение имеет ранняя диагностика данного вида заболевания для выполнения нейрохирургической операции по удалению эпнлептогеннсго очага. Морфологическое изучение коры мозга человека при эпилепсии ограничены в основном цитоархитектоничесхими данными (Meencke and Janz,U84; Babb and Brown, 1987; Nordborg, 1987; Palmini et al., 1991), методом Гольджи показано только уменьшение числа дендритных шнппков н наличие варикозностей на дендритах (Demoor, 1898; Scheibel et al ., 1974; Scheioel, 1981). Клинические проявления другого, изученного г. данной работе, іболевання раннего детского возраста - синдрома Ретта (двигательные зтоматизмы, аутизм, утрата речи, умственная отсталость, эпипептогенные /дорожные припадки) указывает на раннюю вовлеченность определенных груктур мозга. Литературные данные изучения морфологических изменения эзга больных с синдромом Ретта единичны (Jellinger et al., 1988? nstrong, 1992; Oldfors et al., 1993), а по некоторым отделам мозга эосто отсутствуют, хотя встречаемость этого заболевания в 4 раза чевышает фенипкетонури» (Hagberg, 1989} Engerstrom, 1992). В істояцее время существует единичная работа Amstrong (1992) по іучению нейронов с их отростками методом Гольджи, в которой выявлено «еньиенне числа дендрнтов, более заметное для базальных чем косых шкальних дендрнтов в височной, чем в зрительной коре. С одной гороны, это ограничивает наии знания по этиологии и патогенезу і иного заболевания, а с другой стороны, затрудняет разработку физиологических препаратов, направленных на лечение данного вида ібопевания. Таким образом, актуальность данной работы представляется в )пытке выяснения закономерностей нейронной структуры корковых полей >зга человека в норме и изучения их при двух неврологических іболеваниях раннего детского возраста - лекарственно-резистентной пшепсии и синдроме Ретта. 2. Цела а задача работы Цепь работы - выявить закономерности трехмерной нейронной руктуры отдельных полей разных областей коры мозга человека (поле > фронтальной коры, поле 21 височной коры, поле 17 затылочной коры, іпе 7 теменной коры) в норме а ее изменение в патологии (в шлептогенном очаге при лекарственно-резистентной эпилепсии (ЛРЭ), їй синдроме Ретта (СР)). Для достижения поставленной цели решались следующие задачи> Разработать методы избирательной системной окраски нейронов волокон мозга человека на аутопснйном н биопснйном материале, зволяющне дать оценку трехмерной геометрии нейронов в норме и тологни. Разработать метод одновременного выявления структуры пронов (с их дендритами а аксонами) и иммуногистохимической ентификации биологически активных веществ. Для данных методов вонть и применить метод получения трехмерного изображения нейронов и помоцн конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Изучить трехмерную геометрию нейронов и их пространственное сположение в ряде полей разных областей коры мозга человека в норме оля 10, 21, 17, 7) н выявить морфологические ссобенности, ракгерные для каждого из этих полей (аутопсийкай материал). изучить трехмерную геометрию нейронов кори мозгл человеха в илептогенком р смежных участках горн при лекарственно-резистентной илепсни (поля 21, ?0, 18, 7 і (биопсийныи мггер:'эп чсслс нейрохирургических операций). Изучить трехмерную геометрию нейронов коры мозга людей диагнозом синдром Ретта (поля 10, 21, 4) (аутопсийный материал). На основании проведанного анализа нейронов составить ба: данных, для трехмерного картирования мозга человека в норме и і изменения при лекарственно-резистентной эпилепсии и синдроме Реттч 1.3. Научная новизна результатов 1. Разработана новая стратегия морфологического изучения позі Данная стратегия осуществляется применением комплекс морфологических методов системного выявления нервных элементов МОЗІ человека на аутопсчйном и биопсийном материале: а) Внутрнклеточнс введение на фиксированной мозге флуоресцентного красителя пюцнфєрової желтого (метод ЛЖ), позволяющее окравнвать больное количссті нейронов (100-300) на любом, даже на очень небопьвом участке мозг; Метод ЛЖ хорошо выявляет весь нейроні дендрити с випиками варикозностями и аксоны с коллатералями. б) Аксональный трансго; флуоресцентных карбоцианиновых красителей (прежде всего Oil, fas Dil, DiA), позволяющий прослеживать антеро- и ретроградные ненрональш связи в мозге человека, в) Разработана комбинация метода ЛЖ и мето) карбоцианиновых красителей с иммунофпуоресцентным методом, позволяю^, на одном и том же срезе мозга человека изучать трехмерж распределение биологически активных веществ и трехмерную геометрі дендритов и волокон, г) Р&зработан метод регистрации изображен! нейронов и волокон при помощи конфокального лазерного сканируюцеї микроскопа (КЛСМ), позволяющий сохранять изображение в 6htod< формате, проводить двух и трехмерную реконструкцию глеток. 2. Изучена трехмерная геометрия нейронов и их пространственш в норме и создана база данных конфокальных изображений пирамндні и непирамидных нейронов этих полей, записанная на лазерных оптическі дисках. а) Изучена гетерогенность пирамидных нейронов данных .'оли описаны морфологические особенности как "классических" пнраміцн нейронов, так и их разновидностей і бнапикалышх, "динозавр-подобия: и фузиформных. Выявлено, что в слоях 1І-ІІІ соотношение обычт пирамидных клеток с бнапикапьными составляет 10«1; в слоях V-V соотношение обычных пирамидных клетох с "динозавр-подобными" фузнформнымн составляет 121811. Показано равномерное распределен дендритных шипнков у данных нейронов, л также симметричное распределен KOC4Y апикальных дендритов. б) Выявлены специфические черты геометрии дендрнтов, присущие в) Корфометрическое изучение параметров геометрии дендрнтов косые апикальные дендрити пирамидных нейронов внутри колонки (а-потхи) имеют более вертикальную ориентацию, чем дендрита нейронов :жду колонками (б-клетки). Эти два вида нейронов также различаются э общей площади дендритной территории (S da), площади апикальных 3d ар) и площади базальних (Sd bas) дендрнтов, по общей длине (Ld) длине базальних дендрнтов (Ld Ьаз), общей плотности (Nd) и плотности шкальных дендрнтов (Nd ар). г) Выявлено подразделение пирамидных нейронов III слоя 7 поля д) Для исследованных полей коры мозга взрослых людей показано Составленная библиотека трехмерных конфокальных изображений ;пронов коры мозга человека и пх местоположения в норме использована данном исследовании для сравнения с патологией (ЛРЭ и СР), а также зжет быть использована при изучении коры мозга данных областей при >угих неврологических и психических заболеваниях. Э. Изучена трехмерная геометрия нейронов коры мозга и их юстранственное расположение в эпилептогенном очаге больных дарственно-резистентной эпилепсией (поля 21, 10, 18, 7). Составлена 13а данных трехмерных конфокальных изображений атипичных нейронов, ірактерних для этого заболевания. Выявлено: а) наличие 4-х видов непирамидных нейронов в I слое, которые б) 2-4-х кратное увеличение числа биапикальчых пирамидных в) отсутствие колончатой организации нейронов во 11-ІII слоях г) атипичная ориентация косых и/или базальных дендритов д) региональное отсутствие пипиков ("голые" участки дендритов е) увеличение числа "динозавр-подобных" и фузиформных нейроно ж) наличие многочисленных атипичных пирамидных нейронов в бело Вышеперечисленные морфологические данные по нейронному строен» эпилептогенного очага больных ЛРЭ предполагают нарушение миграцн нейронов коры мозга у данных больных в раннем пренатальном онтогенез и указывают на "критический" период, когда происходит это наруиенн (5 месяцев пренатального онтогенеза) (см. 37). Выявлена положительна корреляция степени нарушения нейронной структуры в эпилептогенио очаге с возрастом появлення эпилептогенных припадков. Составленная библиотека трехмерных конфокальных изображен!! атипичного нейронного строения коры мозга человека при ЛРЭ использован в этом исследовании для прогноза течения данного заболевания конкретных больных. Эти манные тькхе являются клинически значимим при их использовании для профилактики данного вида заболевания здоровых людей "группы риска", а такяе для ранней диагностики ЛР при биопсийном исследовании пациентов. 4. Изучена трехмерная геометрия нейронов коры чозга и и пространственное расположение у людей с диагнозом синдрома Ретт (поля 10, 21, 4), составлена база данных атипичных нзйронов при это заболевании. Выявлено! а) отсутствие различий нейронов, характерное для исследовании б) уменьшение числа и региональное отсутствие шшиков ("голые в) уменьоение числа и ассиметрнческая потеря косых апикальны г) атипичное распределение горизонтальных волокон и признаки и д) отсутствие признаков нарушения коркового строения, т.ь с?) неравномерность поражения различных полей и слоев кори при к срлпненни между собойї во фронтальной коре (поле 10) пмрлмипнь нейроны II-III слоя были более изменены, чем в слоях V-VII, прачем изменения касались в большей степени косых апикальных дендритов, чем базальных; в моторной коре (поле 4) нейроны слоев V-VII были более изменены (кроме больших клеток Бэца), чем нейроны II-III слоев; в височной коре (поле 21) атипичное строение нейронов наблюдалось по всем слоям коры, 5. Морфологические данные по нейронному строению коры мозга больных с синдромом Ретта указывают на ее принципиальное отличие от морфологической картины эпилептогенного очага при лекарственно-резистентной эпилепсии. При синдроме Ретта не найдено признаков нарушения миграции нейронов коры мозга в раннем пренатальном онтогенезе, что характерно для ЛРЭ. Анализ этих морфологических и литературных клинических данных (Hagberg, 1989; Engerstrorar 1992) предполагает нарушение при синдроме Ретта развития и становления связей нейронов коры со специфичными афферентными системами (калозальные связи, связи с подкорковыми структурами) в раннем постнатальном онтогенезе (развитие мозга останавливается на определенном этапе) . Полученные данные являются клинически значимыми при их использовании для профилактики данного вида заболевания у новорожденных детей от здоровых людей "группы риска", а также при выработке стратегии для поиска и разработки новых специфических фармацевтических препаратов при лечении данных больных. 1.4.'Практическая ценность полученных результатов Разработанная новая стратегия для трехмерного нейронного картированию мозга человека является чрезвычайно важной для быстрого получения морфологических данных по нейронному строению различных областей мозга человека в норме и их изменении при любых неврологических и психических заболеваниях. Полученные данные об особенностях трехмерной нейронной организации коры мозга человека в норме и при изученных заболеваниях являются приоритетными и открывают новые перспективы в изучении нормы и патологии. Эти данные использованы для прогноза течения заболевания у конкретных больных и могут быть использованы в диагностических целях при биопсийном исследовании мозга, для лечения и выработки новых фармацевтических препаратов при эпилепсии и синдроме Ретта. Составленная база данных трехмерных конфокальных изображений геометрии нейронов в норме и наличие патологически измененных нейронов в эпилептогенном очаге при лекарственно-резистентной эпилепсии входит в базу данных международного проекта "Нейронное картирование мозга человека в норме и патологии". Эти данные также используются для клинической диагностики и прогнозе течения заболевания при ЛРЭ и СР, а также для постоперационного прогноза при нейрохирургическом лечении ПРЭ. Видеофильм "Использование КЛСМ для трехмерной реконструкции н анализа геометрии нейронов мозга человека в норме и при эпилепсии' и полное описание разработанных методик для нейронного картировать мозга человека в норме и патологии, изданное в виде кампактногс магнитного диска, используется на лекционных курсах преподаваши нейроморфологии для обучения студентов медицинских институтов. 5. Результаты работы могут быть использованы научными і клиническими учреждениями РАМН (НИИ нейрохирургии, НИИ аэрологии, НИИ психиатрии), Институтом ВНД и нейрофизиологии РАН, и другнмі научными учреждениями РФ, проводящими исследование различных структуї мозга человека в норме и патологии. 1.5. Основные полоханая, вынесенные ка защиту 1. Нейронное картирование мозга человека включает новую стратеги* Создана база данных трехмерных конфокальных изображение нейронов коры мозга человека в норме и их изменение при лекарственно-резистентной эпилепсии и синдроме Ретта. Описаны морфологические особенности нейронного строения различных полей мозга человека в норме (поля 10, 21, 17, 7) гетерогенность пирамидных нейронов в пределах огного слоя, морфометрнческие параметры геометрии нейронов зрительной и парнеталыюГ коры. Выявлены количественные соотношения между нормальными пирамидами, биапикальными, "днноэавр-подобнымп" и фузиформнымн. Изменения трехмерной геометрии нейронов в эпнлеитогеннок очаге у пациентов с лекарственно-резистентной эпилепсией указывают на пренатальное нарушение миграции нейронов, вызывающее в дальнейшее постнатальном развитии изменения электрической активности і формирование эпнлептогенного очага с эпилептическими припадками, m способными купироваться современными антнэпилептнческлмн препаратами, 5. Выявленные изменения трехмерной морфологии нейронов у больны) 1.6. Публикации По результатам исследования опубликовано 42 научные работы, и: них Ч в центральных отечественных журналах, 11 в международны: риалах, 2 в главах международных книг. 7. Апробация работы Основные положения диссертации были неоднократно доложены и суждены на отечественных и международных симпозиумах и конгрессах, гом числе: на II и III Всемирных конгрессах ИБРО (Будапешт, Венгрия, 07; Монреаль, Канада, 1991), на I Европейском конгрессе по врологин (Прага, Чехословакия, 1988), на Международном симпозиуме опронапьные сети" (Прага, Чехословакия, 1990), на Международном нгрессе по патофизиологии (Москва, Россия, 1991), на Международном мпозиуме "Энторинально-гиппокампальные взаимоотношения" (Франкфурт--Майне, Германия, 1992), на 1-м, 2-м и 3-м Российско-шведских мпозиумах "Современные исследования в нейробиологин" (Ґетеборг, оцня, 1990; Москва, Россия, 1992; Ґетеборг, Швеция, 1994), на огодном симпозиуме американской ассоциации нейронаук "Картирование зга человека" (Бостон, США, 1993), на II и III Ежегодном симпозиумах ойродегенеративные заболевания" (Охо Рнос, Ямайка, 1993, 1994), 20 Международном конгрессе по эпилепсии (Осло, Норвегия, 1993), 16 Ежегодном европейском конгрессе по нейронаукам (Мадрид, паиия, 1994 ), на 23 Ежегодном американском конгрессе по нейронаукам лшннгтон, США, 1994), на Международной конференции "Конфокальная кроскопия" (Мюнхен, Германия, 1994), на Международной конференции эпилепсии (Упсала, Швеция, 1994), на конференции Скандинавского інопоінческого общества (Ґетеборг, Швеция, 1994) , на I Международном нгрессе по клинической нейрофармакологнн (Фрайбург, Германия, 94), неоднократно на конференциях и симпозиумах, проводимых в НИИ зга РАМН. Э. Благодарности Автор выражает благодарность ."отрудннкам НИИ мозга РАМН за эгочисленную творческую помощь при проведении данного исследования, эбую благодарность автор выражает сотрудникам лаборатории нейронной эуктуры мозга НИИ мозга РАМН профессору Т.А. Леонтовнч, с.н.с. Ю.К. <нной, М.А. Маханову, А.А. Федорову за творческое обсуждение іультатов работы. Автор также искренне благодарит лаборантов моратории нейронной структуры мозга НИИ мозга РАМН О.Б. Сизову, С. Беличенко, Н.А. Михальченко и СВ. Стекольникову за техническую «ощь в получении, обработке и окраске гистологических препаратов їга человека. Автор также искренне благодарит директора Института мозга інкфурта-на-Майне (Германия), профессора. В. Зингера и директора :титута нейробиологин г. Ґетеборга, профессора Л. Далг>стрем за доставленное обосудоза іе для выполнения час л p&6ovbi. 1.9. Список сокращений, используемых в диссертации КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; ЛЖ люциферовый желтый; ЛРЭ - лекарственно-резистентная эпилепсия; ню - нейронное картирование мозга человека; СР - синдром Ретта; ФБ ( ) - порядковый номер цитированной статьи в списке печатных раб< по теме диссертации.
человека, позволяющая проводить нейронное картирование мозга чеповеї
на микроуровня в норме и патологии. Создано новое направление
изучении трехмерного нейронного строения мозга человека с помощі
конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
расположение в коре мозга взрослого человека (поля 10, 21, 1/,
фамидным нейронам определенных полей коры мозга человека. Оценка
мшнтацнн дендрнтов пирамидных нейронов показала, что косые
шкальные н базальные дендрити ІІ-ІІІ слоев поля 10 фронтальной коры
«еют горизонтапьную ориентацию, в меньшей степени это характерно
ія нейронов 7 поля париетальной коры, в то время как нейроны
эптельноЙ коры 17 поля имеют вертикальную ориентацию, а нейроны 21
зля височной коры не имеют предпочтительной ориентации.
«явило наличие 2 типов нейронов слоя III 17 поля (а- и б-клетки),
х колончатое распределение с периодичностью 300-400 мкм. Базапьные
змеиной коры на 2 подслоя, лежащих один над другим, согласно
іраметрам геометрии дендрнтов. Два вида клеток (а и б) различаются
э следующим параметрам і общей площади дендритной территории (S da),
Зщей длины (Ld) и длины базальних дендрнтов (Ldbas), общей плотности
Id) и плотности базальних дендрнтов (Nd bas), числу свободных концов
мідрнтов (Dd), разветвленности клетки (Ас).
іличиє четких границ между І н II слоями, между белым и серым
;цеством, отсутствие многочисленных нейронов в слое I и белом
іцестве.
сутствуют в норме, не найдено клеток Кахала-Ретциуса. характерных
\я раннего пренатального онтогенеза,
ійронов во II-III слоях, при неизменном количестве всех пирамидных
ійронов.
пирамидных нейронов в слоях II-VII, заключающаяся в ориентации коси
апикальных дендритов к базальному полюсу клетки и базальных дендрито
к апикальному полюсу клетки,
на пирамидных нейронах во II-VII слоях,
в слоях V-VII, без увеличения общего числа нейронов в этих слоях
веществе.
полей коры мозга человека в норме (в т.ч. отсутствие горнзонтальног
распределения базальных и косых апикальных дендритов, характерної
для нормы во фронтальной коре); геометрия нейронов одинакова и
фронтальной, височной и теменной коре,
участки дондрнтоз) на пирамидных нейронах во II-VII слоях,
дендритов нейронов во ІІ-ІІІ слоях,
дегенерации по всему поперечнику коры,
отсутствие многочисленных нейронов в I слое и белом вощастве
бнапикальных нейронов во ІІ-ІІІ слоях, атипичной ориентации денлрнтоь
изучения трехмерной геометриинейронов и волокон, заключающуюся I'
использовании комплекса методов системного выявления нервных элементов:
метод внутриклеточного введения флуоресцентного красителя люциферовогс
желтого, метод внутриаконального транспорта флуоресцентных
карбоцианиновых красителей, комбинацию этих методов с
иммунофлуоресцентным методом выявления биологически активных вещестг
с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
с синдромом Ретта указывают на преимущественное постнатальної
нарушение нормального развития коры мозга (его дальнейшее развнтік
остаїм ,іьі.!<лется на определенной стадии постнаталыюго онтогенеза),
вызывающее невозможность развития, недостаток или утрату приобретении:
функций мозга.
фосфатный буфер.