Введение к работе
І. Актуальность проблемы»
Выявление механизмов действия наркотических веществ на танизм, лежащих в основе развития толерантности и зависи--эсти, является необходимым этапом в изучении этих Феноменов
целы-!) их предотвращения и коррекции.
Известно, что развитие толерантности и зависимости от ;і р к о т и -і е с іс и х с р е д с т в с о п р о в о ж да е т ен и :-: и е н е н и е м с о с т о к и ия їдиаторнух систем мозга,, наряду с изменениями в системе зн-:<генных опиомдов и свойств опиатных рецепторов (Зайцев С. Б»
соавт,, 1986, Звартау 3,,3,, 1973ч Паткина Н„ А* с соавт. ?36)„ Таким образом, общий дисбаланс: в состоянии частей 'їмо ид и ой системи и сопряженных с ней нейромедиаторных и ^йроиодуллторных систем приводит к дезорганизации всей ра-:тгы мозга в целом и имеет патогенетическое значение в раз~ 4тми Феноменов привыкания (зависимости) и снижения чувстви--5ЛЫ-ЮСТИ (толерантности) (Воробьева Т„М„ с соавт. 1934,, и н 'і е i-i к: о Л, Ф „, Б р у с о в 0. С. 198'1) „
Мозг состоит из большого числа функциональных компарг-їнтов, каждой из которых обладает своей архитектоникой и їоєй системой связей, поэтому исследование мозга в цело»! ;возионно без детального изучения структур, его составляю-їх. Опиомдная система в значительной степени связана с ио-лаиинергической системой мозга (Еулаев В-п., Раевский К.Си ?82) „ Показано преимущественное участие некоторых структур їрвной системі! в механизмах Формирования влечения к нзрко іческим средствам (Holei.ian Р. с соавт,, 1934 Ssutin v,, ::: jaBT. 199()5 ТгеліЬІау E.G., Charter) G„ 1981).
Склонность к Формировании Физической и психической зави--
сиіюсти, а также скорость развития толерантности являютс какой-то мере генетически предопределенными у людей И ІІІИВ кы>: (Борисова Е.В. с соавт. 1992). Индивидуальную чувст тельность к наркотическим средствам могут' определять раз чин в системах моноаиинов и эндогенных опиоидое у разных ганмзмов (Судаков С.К., с соавт., 1991; Sudakov S.K. с соа 1993),,
Одно из направлений исследования наркотических ереft заключается в выяснении молекулярних механизмов дейст названных веществ., в том числе, влияние их на работу гень ческого аппарата клетки.. Известно, что наркотики могут вы вать мутации кода ДНК, изменять транскрипцию с ДНК, зам лять синтез белка., изменять свойства некоторых Фермент участвующих в биосинтезе макромолекул (Зайцев С.В., Яры К.Н. 1993? Ли H,.h„ с соавт. 1981; Clouet D.H. 1971). С местное применение в эксперименте другого вещества с изве ним механизмом действия может облегчить исследование, при использовании ингибитора протеаз антипаина било вияв но, что некоторые вФФекты морфина осуществляются протеаз путем (Бибаева П.Б. 1990).
Относительно вну гриклеточных механизмов воздейст норФина известно, что [Реализация эффектов данного вещее возможна не только через морфино-рецепторьи но и другими тями., в том числе путем непосредственного взаимодейст опиата с хроматином клеточного ядра (ііещеряков й.Ф., Суда СК« 1991; Eriksson P.S., 1939). В связи с этим самостояіте ныи интерес представляют гепатоцнти, лишенные рецепте міу-тина (Samovilovu \Lbl. с соавт.. 1988),,
Опиоидергическая и моноаммкергическап системы претер
ЇМТ ОПрЄДЙЛЄННЬ!Є Г!ЄрЄС7рОЙКИ & ПрОЦЄССЄ ИН ДИВІ'ІДуаЛЬНОГО
ізвития (Дыгало l-LH«, Шишкина Г» "Г. 1990; Зайцев С. В», Яры-т i'i.,rL 1993s Раевский В.В. 1991; Kir itsy-Roy J.A. с соавт» ?92).. Возрастные изменений затрагивают и работу генетмчес-:>го аппарата клетки СБердышев Г» Д. 1977; Григорьева А»В„, >ыгмн В.Н. 1981),. Таким образом, является актуальный иссле-:>вание механизмов внутриклеточного действия морфина, в їстности на работу аппарата транскрипции., в процессе о к тоже за»
I.L._il/]b ПЗЗШМ.і..
Сравнительное исследование возрастной динамик:!-! реакции і воздействие морфина и антипаина аппарата транскрипції!'! ізннх типов клетоїс нервный и не нервных структур крыс линий 4G/G и Р344п отличающихся чувствительность!') к морфину»
ііі..г.._.аапач|:і..исследозані:ія.и..
1„ Оценить транскрипционную активность нейронов разных
тур и гепатоцмтов крыс в условиях применении морфина и
іГгюитора протеаз ан гипаина.,
2» Исследовать изменение транскрипционной способности Миронов и гепатоцитов крыс на разных этапах индивидуального ізвігїия животных (новорождённый период., инфантильный пери-т.. молодой и зрелый репродуктивный возраст) .,
3. Сравнить транскрипционную активность нейронов и ге-ітоцитов крыс,, отличающихся чувствительностью К МОр'|>ИНУ іині'ій WAu/G и F344)..
II» ІкУ.УШ!іи±ЖШ±ііі Работы,,,
Впервые исследовано влияние иорфина на синтез РН клетках нервной и не нервной природы у крыс с кеодинако наркологической устойчивостью (линий ЫЛь/Ь и F344). Показ различия реакции на норфин аппарата транскрипции клеток кивотных с равной генетической устойчивостью к наркотмчес средствам..
Впервые выявлены индивидуальные различия транскрмнци ной активности нейронов и гепатоцитов крыс на равный эта онтогенеза. Показано, что в основе изменений реакции апна та транскрипции нейронов и гепатоцитов на морфии в ходе тогенеза могут быть раз-личные механизмы, не совпадающие генотипически отличающихся ЖИВОТНЫХ»
Ї^ЕМЕШ;ШЖ^Шїі21к р„або;ш».
Выявление центральных механизмов, лежащих в основе р вития Феноменов толерантности и зависимости к опиатам, о рывает широкие перспективы для создания патогене тиче обоснованных средств и методов лечения наркологических и да иных психических заболеваний, а такие поиска новых под дов к устранению нежелательных побочных эффектов от приме ния наркотических средств- в целях обезболивания по медици ким показаниям»
11« ВїШЇШШЛЖОІкЬ..
Материалы и результаты настоящего диссертационного и ледования представлены на научных семинарах кафедры биоло РГМУ в 1992-1994 годах,, в лаборатории Фармакологии нар к о ков и экспериментальной Фармакотерапии наркомании Научи центра медик:о--бнологических проблем наркологии НЗ России 1993 году, на научных конференциях ''Университеты Росс
V-aO\4\4jj\V::l\) OHEi/U И О 5І З 6 h И1-Э H # J О J. И О З ІЯН0!-,Л:=:И OffiOdOX ndA.O/v:il dmoA'
-:;:т;..-.! :;юі-=ж:>; :; нхмпп^/йеии..];.: уозоннзх иоі-iWo уи'пкмуЛиои хгін^е глох 01/::-1 епиенихне и Ениф.:.!оы эиз.юи.Жж:: нн kxecIcuue o.k:oidoi-,h -яне...і иі'і'гігл'сз...! іп-п\я\-,Ас\-\ ojoH-Rfoi/i/EdEU я.ооижоы^оз os/e^e'; ox " (JOiiid) w і-н <...: ііе„.і ^!'ізі:."іоі-,и.ії--і..і(чі'і"' мянивії! wuMxdes и (jjj) om.u.:
60^A\.!0.i ''(НИЗ) ЕОЛі.іЕІ/Е.І.О!!И..І Od'tiii ООНЧІ/ЕИїІОИО-.:ІХНЗ.:=: h(V|k!0) Уи
-їтп/is/ou хмппі/оч Edcoi BnHdoxowcoHOD ї3/9УМ и і? і,-.::1 иі-п-іиі/ ~4=id
і-іі-;~-ХГЙ-!Г- yoi-mdoH l/iOrOOi-^'ldOiH-ldOU !: ИОЧ^ІІ/ЕЙІНО'П ridA.X^Ad l.J
/у) чнзі-.ви ЯИИ1.Сє:=10:=:cH.fO!і:::-!'! ьфінезотієі-ООИ fx :>i-эт. ;}:. saxDOive:?! g
;х^ініо^іШ'"хг^<пїїеЇ!ізКйЗЯїіїї:;і и
ШнеіоЇЇої/ЬЗй ЕЇ>!5чоо-"идм:!Зйиї'5їнй'нх І"1Щ
"aodoxaE х;=інне
-.І.ООІ-ІИ XOyEd А7Ї и Х'ПННЭЯХ 391-.310 901 ХОНІ/уЕХГЮО iqdrtXEdOXI.-!
жоиіп -hweyihi/qex , и име:>інЛ::ж-::1 9т EHEaodwdxDMm/H Mn'irexdo
-ЭИ?! "XE'nHMEdlD p/. EH !!0 K-l О1/ =: И l/Ei-idOXEW МОІ-ІЗОІ-ХОр, "EX "і ЗІ-ЭХ О -ОНЗИМОИИЫЕМ riTii-iliEdJ^ j.;7T X-.'У!/2 EX З О"' i'UOJEd Ы&ЧйО MI-lltiyQ
"FidtvLEdOXMl/ І.Л/6І.ЕЇЕ:}|Л ЧЮХТ-иЯі/Л:=>"К:І ИИНвИїКЛГі^О ^Ь'ИМЕЗОТІО ~:OW aOXEX^l/ASOd ' ІІИНЕЗОї.і 51/3314 ЗОїїОХОН И SOI/EHdOXFW BriMDM!.J N'-ldAXEdOXHI/ EdOSOO Ч.ИН0Й0Я:3 SH ХИОХЗОЗ 1.:Н4ЇІЕХ-::І 0331-1 ft
"Wof&tf Ed?U'^ofXO "Til
"("J v66T '3!зао::;н) „ии --оі/оф-Лои и сою и и'пи ft on нзо-ліоз єі!!КЯ!(ЕЛі.:>іу„ "("...і i>c,6l ,;Ез:>;::іои
_. г- .„
Исследуемые структуры нервной системы характеризуй высоким содержанием норадреналин--., дофамин- и серотонин-деривщих нейронов, рецепторов к катехоламинан, опиатам опиоидным пептидам (Оленев СИ» 1987)« Показано участке кик структур в механизмах формирования влечения к парко ческин средствам и трансформации пристрастия к наркотика патологическое состояние (Булаев Б»М. ,, Раевский С К. 19 Панченко Л«Ф. 19Б4), В области СИК обнаружены гетерогенну стр'укїурно-Функциональнои отношении группы нервных кле (Максимова Е«Б, 1990). Некоторые из них участвуют в они диетической регуляции. В СМК большое количество нейро зкепресемруіот опиоидные рецепторы, в том числа мю-типа» мембранах нейронов Г'П также обнаружены рецепторы mw-t (Harris G.C. 1991). ГП участвует в проявлении поведенчес реакций синдрома отмены, развитии зависимости и толеран'п--. ти и является удобной моделын для изучения механизмов де твия наркотических средств (Guitar! X. с соавт« 1992; Hoi Р. У. с соавт,. 1995; Jorm СМ. 1995).,
Исследование реакции гелатоцитов на воздействие мор'! представляет особый интерес, так как известно, чго все Фокты препарата на клетки печени производятся без: учас морФино-рецепгоров и, возможно, осуществляется путем І-ІЄГ родственного взаимодеПсі вия опиата с хроматином клеточг ядра Шибаева Л. Б. 1990; Зайцев СВ., Ярыгин К.Н. 1993!; fflovilova N.N:, с соавт. 1988).
В экспериментах использовали инбредных крыс линий F1 her-344 (F344) и Wistar Albino Glaxo (WAb/GSto),, разли'-щихся чувствительностью к морфину. Неодинаковое ВОСПрИІ-подкреплі::іі)щего действия морфина обусловлено генотипическ
ісооєнносїяии к:рыс каждой линии- В настоящее время обнаруже--1Ы отличия характеристик: рецепторного связывания б мембранах :оры головного мозга у крыс этик линий (Борисова .. Б. с со-:вт- 1992). Причем,, различия концентраций и чувствительности ецепторов имеются как для опиатных рецепторов, так и для рецепторов к моноаминам,. Показано, что крысы линии F34-1 ока-ывакг предпочтение потреблении) раствора морфина и менее ус-ойчпвы к формировании) зависимости и толерантности от опма-овн чей крысы линии WAG/G (Sudakov 3-К. с соавт,, 1993)..
До начала эксперимента' крыс содержали в помещении с юстоянной температурой,, в условиях стандартного освещения. :ри свободном доступе к воде и пище.
Исследовали пять возрастных групп животных:: периода Х'сороиденностн (3-х., l-'i-ти дневные)„ инфантильного (І-ИЄ--ячные),, молодого и зрелого репродуктивного возраста (6-ти, 2-і и месячные)- Возраст живот: іьіх определяли по датам ро:::де~ :ия» Всего в работе использовано 136 "іиеі-отньіх,.
Исследуемые вещества
Порфмн является одним из наиболее изученных алкалоидов пия и широко приценяется для исследования механизмов разеи-ия толерантности и зависимости у людей и животных- Имеется емало данных о влиянии морфина на работу генетического апарата клетки, в том числе синтез РНК (Мещеряков^ А-Ф-н Суда-ов С-К- 1991; Clouet Ї).Н„ 1971 г; Eriksson P.. 3.. 1939),,
Олигопептнд антипаии применялся для исследования коми-екса 303--функций и выявления протеазных механизмов в разви-ии 303 ответа у Escherichia call (Pieirzykowska I- с соавт. 933)- Антипаии является ингибитором протеаз широкого спект-
pa действия (fioriinoto Т. с соавт„ 1990;; virgin 1« с: соа І99І). Имеются данные о влиянии препарата на экспрессии нов С Сад пап а fi„, Kennedy A.. R» 1989; Chant;; J.I),, с соа 1985? Hiwasa Т. с соавт. І987),, на синтез РНК у народы земноводных (fliyata S. с: соавг., 1988) „
Применение антипаина наряду с иорФинои в настоящей з перниенте дзет возможность выявления и подтверждения нали протеазных механизмов действия опиата на транскрипцион активность к:лоток. (Вмбаова /LB„ 1990)«
М е т о д и ica и с с л е д о ва н ия.
При проведении исследования использовались данные., л у ' і о і і ни е а в т о ра дно г ра Ф и ч е с к и м н е т о д о и« П р и м е н е и и е мет о д а диоактивной индикации к перешивающим срезам имеет ряд пр иущоствг достаточно высокая чувствительность, простота полнения и меньшие затраты радиоактивного вещества, че методе in vivo (нитюшов М„И. 1986)» животных забивали помощи декзпитации,, выделяли сенсокоторную кору, вентроме альное ядро гипоталамуса,, голубое пятно, верхний шейный с патический ганглии,, печень., Части исследуемых структур (В 100 мг) помещали в среду 199» Перевивающие срезы получ путем измельчения исследуемого материала до равне 1x0«5x0«5 им. Культивирование срезов проводили при темпе туре 37 С в чашках Петри диаметром 40 ми в среде 199 с бавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота, 70 икг та ми на С и 5 мг глюкозы на 1 ил среды,. Время преинкуба составляло 30 минут., порФин и антипаин вносили в инку бац и ную .смесь в концентрациях 8пМ и СОБмК, соответственно, рев 60 минут инкубации с препаратами в смесь вносили Н3-у
імн (0,8 пБіс мл"1 инкубационной среды, удельная активность .SO ГБк л"1) и продолжали инкубировать s течение 30 минут іри температура 37 С. Затем срезы отмывали колодной средой .9? (4'"'С) с избытком немеченого нуклеознда, помещали в счет--іьіе вмалы и обрабатывали 57. раствором ТХУ при 4" С в течение 0 минут. Срез.:! ополаскивали 70 спиртом,, вновь помещали в :чет!1ые виалы и растворяли в ЇМ растворе гиамин-з. о течение :уток при температуре 5б'-'С В в малы добавляли сцинтиллятор :б5'0 мл толуола, 350 мл тритона X і00,, 4 г ПП0, І г П0П0П на л раствора) и на сцинтилляциокном счетчике "Анализатор Бе-а--2" определили радиоактивность кислоторастзоримой (р) и :исло7 0нерас?воримой С:1.) Фракции (Еіродский Б-Я», Нечаева LB. 1938).
Для крыс обеих линий возрастной группы 6-~месяцев до--і о л н и т е ль н о п !' и м е и и л и не т о д а в т о р а д и о г р а ф и ч е с к о г о о і т р е д е л е -іия активности эндогенный РНК-полммерав, предложенный Муром Фкюге G.Pufi., 1978),. Материал для исследования (СИЮ брали іе менее, чей у трех к рис каждой линии.. Гистокриотомі-іьіе сре ы СП!\ толщиной 3-Ю икн помещали на предметные стекла і-, в еченне 5 минут фиксировали в смеси этанола м ацетона СІ ;:!)„ Іосле высушивания на воздухе наносили на них инкубационную :иесь, содержащую в 1 мл:; 100 нкп трис-HCI буфера, 150 місті ;ахарозы„ 80 Midi сульфата аммония, 12 місМ 2--ч--іеркаптозганола, iO 0,6 икп ЛЇФ, ЦЮ, ГІФ, 9 мкИ riqCb, 2 Midi МпСІ- и 0.,02 ікгі ::ч'-І--УЇФ, МорФим и антипамн вносили в инкубационную снесь : концентрациях 0,42 мМ м 4,2 мкп,, соответственно.
После нанесения инкубационном смеси срезы помечали на 0 минут в термостат при -температуре 37С„ Реакции прекращали промывая стекла дистиллированной водой и дофнксмровали в
течение 30 минут в снеси этанола и уксусной кислоты (3: Затеи препараты на 15 кинут погружали в 5%-ный раствор (при 4С) для удаления нєвкліочившихся предшественников, п> ле чего тщательно промывали проточной водой в течение ЗО і нут,.
Авторадиографмческий отпечаток: получали, покрывая стеї эмульсией типа М м проявляя фотографическим способом по< 15-дневной экспозиции- Уровень матричной активности хрома' на оценивали, подсчитывая количество зерен восстановлена серебра над ядрышком и нуклеоплазмой в отдельности. Суі указанных величин служила показателем общего ядерного ме' имя»
Используемый метод оценки транскрипции основан на ші лении активности эндогенных РНК-полимераз в области сай' ДНК, транскрибируемых в момент Фиксации (Григорьева А. і Ярыгин Е:,Н„ 1981; Ярыгин Б. И. с соавт,, 1990). Метод им' свои преимущества, так как позволяет избежать слоыностт связанных с мечением РНК in vivo» Включение метки не зави> ни от транспорта предшественников в клетку, ни от их захв; во внутриклеточные пулы., а вновь синтезированные молыс РИК остается фиксированными на ДНК-матрице.
Статистический анализ,
Результаты выражали в удельной радиоактивности ере: (нмп/мин/мг ткани). Рассчитывали величину общего мечені уридина, ревнуй) сумме радиоактивности двух фракций Р4==р-которая позволяет судить о проницаемости срезов для уридиі Поправку на проницаемость вводили двумя способами. Пері приводил к величинам її (P/Pj.), где Р - средняя величина гі|
іпі.!,аеиост и для каждой исследуемой структуры, а г'і - для юнкретмой группы срезов., Второй способ расчета определял :оліо включения от суммарной радиоактикпости іі/Рі, т.е. зф-активность использования меченого предшественника (Бподекий і.Я., Нечаева Н„ В„ 1988).
Е; методике,, предложенной Муром (Hoars J.. Р„п» Іу/3) h осуществляли подсчет числа зерен расстановленного серебра, не іенее чем в .1.00 клетках для каждого случая*
Для дальнейшей обработки полученных величин и оценки остоверносги результатов с помощью 1--к.ритёрня С ты о дожита ольвовзлпсь пакетом прикладных програми на ЇВ М--PC по стз-тістике: STATGRrtPHICS (V3.0) (Тирин ID-Ми 1994).