Введение к работе
Новым направлением в развитии исследований о фагоцитах является изучение функциональной морфологии и биохимии антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулодитов (Пигаревский В.Е.. 1978,1983,1987; Нокряков В.Н..1988). Антимикробные катионные белки (АКБ) занимают одно из ведущих мест в осуществлении и регуляции неспецифических защитных реакций организма. К ним относятся белки, молекулы которых обладают суммарным положительным зарядом и выраженным антимикробным действием. Кроме того они способны играть роль медиатора воспаления, фактора проницаемости, стимулятора метаболических процессов и служить источником неспецифических опсонинов при фагоцитозе (Ашмарин И.П. и др..1977; Пигаревский В. Е.. 1978.1983; Klebanoff S. J., Clark R.X., 1978; GabayJ.E. .et al. 1989; Lehrer R. I.. GanzT.,1990: Spltznagel J.К. ,1990). Сформировались представления, рассматривающие ряд антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов не только как природные антибиотики широкого спектра действия, но и в качестве эффектор-ных молекул диффузной эндокринной системы, в том числе стресс-ли-митирующей (Корнева Е.А.,Шхинек Э. К. ,1988; Маянский А. Н. .Маянский Д.Н.. 1989; Яковлев Г.М. и др..' 1990; Kokrjakov V.N. et al. 1993). Возможно как прямое, так и косвенное их участие в реакциях подавления активности системы комплемента и фагоцитоза при ревматоидном воспалении (Венглинская Е.А..1994). Далеко не последнее место принадлежит катионным белкам в патогенетических механизмах повреждения тканей организма хозяина нейтрофильными гранулоцитами при ряде заболеваний (Benson P.M., Johnston R.В., 1987;Weiss S.J., 1989; Zeok-Kapp G. et al.,1990).
Нейтрофильные гранулоците (НГ) удивительно быстро обновляющиеся, моментально реагирующие на любые изменения в организме клетки. При различных физиологических и патологических процессах резко меняется количество нейтрофилов, их Функциональные свойства, морфологические и биохимические характеристики. Всегда пер выми появляясь в очаге повреждения, они активно стимулируют
привлечение других клеток (моноцитов, лимфоцитов, эозинофилов. базофилов). Их гранулы содержат большое количество разнообразных биологически активных веществ, которые могут в течение секунд попадать в кровоток. Среди них особое место принадлежит катионным белкам как новому классу эффекторных молекул, активно участвующих в защитных реакциях организма, обеспечении воспаления и клеточной цитотскснчности (Lelirer R.I. et al. 1993).
Уже в начале века была обоснована необходимость оценки состава клеточных элементов крови для клинических целей, сохранившая свое значение до настоящего времени. Микробные токсины, бактере-мия и септицемия, стресс, интоксикации способны нарушить миелопо-эз и привести к выбросу из костного мозга в кровь функционально неполноценных НГ. Введение В.Шиллингом (У.Schilling) в медицинскую практику предложенного Н. В. Усковым (1890) метода лейкограмм привело в свое время к кардинальным изменениям в практической деятельности лабораторий всего мира. Сегодня без метода лейкограмм но обходится ни одно медицинское или биологическое исследование, связанное с изучением клеток креви. Однако диагностическая, и особенно прогностическая значимость клинического анализа крови за последние десятилетия существенно изменилась. Принципиальные открытия в иммунологии показали необходимость оценки не столько числа клеток крови, сколько их Функциональных характеристик (Лебедев К. А.,Шишкина И.Д. .1990). Такой подход оказывается оправданным и перспективным, поэтому предметом настоящего исследования стало изучение фагоцитов на основе морфологического анализа АКБ. становления этой одной из наиболее мобильных систем организма в онтогенезе, особенностей ее Функционирования при различных физиологических и патологических процессах.
Целью настоящей работы стало дальнейшая разработка и практическая реализация концепции о резорбтивной клеточной резистентности, обеспечиваемой нейтрофчльными гранулоцитами и мононуклеар-ными фагоцитами, споссбнами накапливать, изолировать, разрушать и
- 5 -удалять чужеродные вещества при участии антимикробных катионних белков. Были поставлены следующие основные задачи:
1. Испытать разработанные под руководства* В.Е.Пигаревского мор-
. фологические методы анализа антимікробних катіонних белков о качестве лабораторных тестов при различных видах экстремальных воздействий и формах патологии человека.
-
Определить эффективность морфофункциональнсго анализа антимикробных катионных белков в качестве критерия оценки состояния резистентности организма при различных видах патологии.
-
Показать роль антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулоците в развитии первой фазы воспаления.
4. Исследовать особенности становления антимикробной функиии
нейтрофильных гранулоцитов в раннем постнатальном периоде.
На основании комплексного экспериментального и клинико-лабо-раторного исследования, выполненного при использовании морфологических, иммунологических и микробиологических методов, обосновано представление об антимикробных катионных белках нейтрофильных гранулоцитов как одном из универсальных механизмов осуществления защитных реакций организма. Обнаруженный у новорожденных млекопитающих транзиторный дефицит антимикробных белков нейтрофильных гранулоцитов может служить одной из ведущих причин снижения резистентности к инфекции.
Выявленные при ряде инфекционных заболеваний и стрессе закономерности изменения антимикробного потенциала НГ открывают принципиально новые перспективы для контроля за адаптивными возможностями человека. Доказательства стимулирующего действия антимикробных катионных белков нейтрофилов на макрофаги в рамках концепции о резорбтивной клеточной резистентности открывают новые пути при разработке препаратов, способных купировать инфекционные процессы, вызываемые внутриклеточными паразитами.
Обнаружено явление аномального гранулогенеза при радиоактивном поражении организма, которое может служить основой для нового
способа выявления случаев контакта с радиоактивными веществами, особенно при небольших дозах воздействия.
Клиническая апробация и внедрение в медицинскую практику цитохимических методов анализа антимикробных катионных белков представляют собой приоритетные исследования, которые позволили создать комплекс способов (защищенных 4 авторскими свидетельствами) оценки уровня сопротивляемости организма, использование которых во многих случаях дает возможность качественно менять тактику лечебно-профилактических мероприятий.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7 и 8 Всесоюзных съездах патологоанатомов (1983.1989); 4 Всесоюзном съезде патофизиологов (1989); 1 Всесоюзном иммунологическом съезде (1989); 3 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (1992); 9th and 10th Intern. Symp. of the Problems of Listeriosis (1986.1988); 3 и 4 Всесоюзных конференциях по патологии клетки (1982.1987);3 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция лизосом" (198G); заседаниях Лен. научного общества патологоанатомов (1979. 1985, 1986. 1987, 1989. 1990). Лен.общества иммунологов (1991).
Материалы диссертации изложены в 56 публикациях, в том числе: 20 статей в научных журналах и 4 авторских свидетельства.
Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования, отражены научная новизна, теоретическая и практическая значимость полученных результатов. В первых трех главах представлен обзор современных сведений о строении и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, роли катионных белков о осуществлении
- 7 -защитных реакций организма. Последующие разделы посвящены результатам собственных исследований, в процессе обсуждения которых представлен сравнительный анализ полученных результатов и литературных данных, показана роль антимикробных белков в осуществлении фагоцитами защитных реакций, обоснована возможность и необходимость использования разработанного методического подхода в оценке Функциональной активности нейтрофилов. Диссертация изложена на 242 страницах, иллюстрирована 34 таблицами и 25 рисунками, библиография содержит 565 источников.
На зашшпц выносятся след тощие положения:
Концепция о резорбтивной клеточной резистентности, связанная с функциональной активностью нейтрофилыш гранулоцитов, основанная на выработке антимікробних катионных белков и их включении в клеточные реакции.
Максимальной диагностической ценностью облаЭают метоЭы. позволяющие анализировать «обильные клеточные системы, особое внимание при этом необходимо уЗелять антимикробным белкам.
Цитохимические показатели активности антгшикробных катионных белков могут быть оЭния из объективных критериев физиологических нарушений, происходящих в организме при экстремальных состояниях, в условиях инфекционной и неинфекщонной патологии, а такте одним из критериев'оценки эффективности проводимой терапии и выявления "групп риска" к развитию заболевания.
В раннем постнатальном развитии имеется транзиторный дефицит антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов.
В настоящей работе обследовано 515 детей и 249 взрослых, пациентов клиник г.Санкт-Петербурга с различными формами патологии и клинически здоровые люди, ' не болевшие в течение последнего месяца: 105 мужчин и 42 женщины вне беременности, 16 беременных женщин и 20 родильниц, 145 детей обоего пола различного возраста, а также 84 мужчины и женщины, имевшие контакт с радиоактивными веществами.
Забор крови производился всегда в утреннее время до еды.из пальца, у новорожденных детеП из мочки уха. используя одноразовые стерильные скарификаторы, При проведении соответствующих клинических процедур использовали забор крови из вены.
Эксперименты выполнены на самцах, исключение составили опыты, связанные с определением Функциональной активности НТ во время постнаталыюго развития, когда использовались оба пола животных. Всего изучено 76 беспородных белых крыс. 63 крысы линии "Август". 35 крыс линии "Wlstar" весом 120-180 г. 140 морских свинок массой 200-300 г. 25 кроликов породы "Шиншилла" массой 2.5-3.0 кг. Кроме тога использовано потомство 10 беспородных (47 крысят) и 15 линии "Wlstar" (70 крысят) беременных самок крыс. 17 самок кролика пароды "Шиншилла" (135 крольчат), родившихся в нашем виварии. Обследованы также 34 клинически здоровых теленка и 10 коров. Животные были доставлены из питомника РАИН "Рапполово" и использованы в опытах после 1-2 недельного карантина. Уход и все процедуры осуществлялись в соответствии с нормами и правилами обращения с животными.
Фагоциты получали из очага асептического воспаления, после введения внутрибрюшинно 0.3% раствора крахмала в физиологическом растворе. Брюшную полость промывали средой 199 с добавлением гепарина до конечной концентрации 1 МЕ/мл в стерильных условиях. Полученные клетки центрифугировали в течение 15 минут при 200-250 g и использовали в экспериментах.
Для приготовления культуры макрофагов к осадку добавляли равные объемы среды RPMI 1640 с добавлением глутамина и клетки рассевали по чашкам Петри с концентрацией 2x1О6 кл/мл. Помещенные в чашки Петри макрофаги инкубировали 1 час в среде углекислого газа (5%) при 37С. затем три раза промывали культуральной средой для удаления не прикрепившихся клеток. Полученный монослой использовали в эксперименте. Состав среды для культивирования входили: 1 мл среды RPMI 1640. 15 % аутологичная кроличья сыворотка. 20 мкл глутамина. 20 мкл пирувата, 10 мкл, гентамишша. Контролем служили резидентные макрофаги брюа:пой полости интактннх кроликов.
- 9 -выделенные аналогичным образом.
Экспериментальный листериоз. вызывали после в/в введения мик
роорганизмов в дозе 10"/кг веса тела кролика (опыты проведены в
медицинском университете г.Печ [Венгрия] совместно с проф. В.Ralo-
vich). '
ПИЗОСОМАЛЬНО-КАТИОтіЬІЙ ТЕСТ. (Пигаревский В. Е'.. 1979а. б)
Метод цитохимического выявления АКБ разработан В. Е.Пигаревс-ким (1975,1979а. б) и основан на способности этих белков избирательно реагировать с диахромными анионными красителями. Опубликованные В.Е.Пигаревским (1979) методические рекомендации позволили использовать тест в лабораторной и клинической практике, в дальнейшем опыт его применения потребовал внесения ряда уточнений, позволивших более широко и доступно использовать ЛКТ в научных исследованиях и у постели больного (Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А. 1981.1987). Приготовление спиртового раствора прочного зеленого.
Раствор красителя прочного зеленого (color Index 42053) готовят на метаноловом буфере трис-соляная кислота с конечной величиной рН 8.1-8.2. Для этого 0.8 г сухого порошка трис (оксиметил) аминометана производства НПО "Биохимреактйв" растворяют в 50 мл метилового спирта и к полученному раствору добавляют 47.3 мл дис-тшшрованной воды и 2.75 мл 1 Н соляной кислоты, приготовленную из фиксанала. В метаноловом трис-буфере растворяют 0,1 г. сухого красителя прочного зеленого.
ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ ТЕСТ С НИТРОСИИИМ ТЕТРАЗОЛИЕН (НСТ-ТЕСТ).
(Gilford R.H. .Malawlsta S.E. ,1970)
Показатели НСТ-теста определяли в нашей модификации. На тщательно обезжиренное предметное стекло наносят каплю крови и помещали его во влажной камере на 25 минут в термостат. Затем сгусток крови удаляют, к монослою фагоцитов добавляют среду 199. сухую плазму крови или опсоннзированный комплементом зимозан. и 0,02% раствор нитросинего тетразолил, длительность пробы 30 минут при
- 10 -37С (38С у кроликов). Высушенные препараты фиксируют ацетоном и окрашивают сафранином.
(Шафран М. Г. .Пигаревский В. Е.. 1975; Шафран М.Г. и соавт.. 1979)
Активность МПО в нейтрофилах оценивали, используя в качестве окисляемого субстрата орто-дианизидин. 24 мг его растворяют в 5 мл метилового спирта, добавляя 0.4 мл 3 раствора перекиси водорода, общи объем доводят дистиллированной водой до 10 мл. Фиксированные в смеси абсолютный этиловый спирт-40* формалин (19:1) препараты инкубируют с реакционной смесью 3-5 минут при комнатной температуре. Ядра докрашивают азуром.
цнтохнштсш МЕТОД выявления активности эндогенной ПЕРИКИСИ
ВОДОРОДА. (РОГОВИН В.В. И др..1977)
Фиксированные в смеси абсолютный спирт - формалин мазки крови инкубируют с раствором диаминобензидина 60 минут во влажной камере при 25еС. Ядра докрашивают азуром. Рассчитывают цитохимический коэффициент.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ ТЕСТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК (IN VITRO).
Фагоцитарную активность клеток определяли используя в качестве тест-микроба суточную культуру Staphllococcus epldermidls. штамм 9198. Микробную культуру опсонизировали 10 аутологичной сывороткой, отмывали и разводили стерильным физиологическим раствором из расчета 10 микробных клеток на один фагоцит. Нейтрофилы и макрофаги получали из асептического очага воспаления, затем, добавив среду 199. инкубировали во влажной камере вместе с микробом 1 час при 37С (у кроликов 38С). Далее фагоциты отмывали от вкеклеточно расположенных микробных клеток, готовили мазки и окрашивали прочным зеленым - азуром. На препаратах определяли показатели фагоцитарной активности (ФЧ и ФИ) и завершенности фагоцитоза (КБА2).
Для определения клеточного состава мазки крови и препараты отпечатки окрашивали по Май-Грюнвальду или красителем Wlttekind (Wltteklnd D..Kretschmer V..1987). Общее число лейкоцитов определяли в камере Горяева.
ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРО-ФИЛЬНЫХ ГРАНУЛ0Щ1Т0В. (Пигаревский В. Е.. Назинг Ю. А.. 1988)
Для определения показателей секреторной активности НГ и изучения динамики воспалительной реакции использовали модифицированную нами методику "кожного окна" по Ребуку (диагностический очаг воспаления). В стерильных условиях на коже передней поверхности предплечья скальпелем наносят два микроскарификата (с целью удаления рогового слоя кожи). Микроскарификата закрывают фрагментами предметных стекол (25x35 мм) с шлифованными краями. Через 4 и 24 часа стекла снимают, подсушивают на воздухе и окрашивают вместе с мазками крови тех же больных прочным зеленым - азуром (ЛКТ). В препаратах определяют процентное соотношение НГ и макрофагов, а также ЦК содержания АКБ в нейтрофилах.
ОБЛУЧЕНИЕ. Облучение животных производилось от внешнего источника в дозах от 0.2-6.4 Гр и при ингаляции радионуклида в специальной камере в дозе 0,05-0.25Гр. В качестве источника рентгеновского излучения использован аппарат РУМ-17 (напряжение на трубке-200 кВ, сила тока-15 мА. мощность дозы 0.5 Гр/мин).
Облучение крови УФ-лучами с длиной волны 254 нм производили в аппарате "Изольда" стандартной терапевтической дозой, рекомендованной инструкцией для лечения различных заболеваний.
Материал фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида в течение 1,5 часов при 4С. После промывки в О,1М кокадилатном буфере исследуемые образцы помещали в 1% раствор четырехокиси осмия на 1-1,5 часа при комнатной температуре. Фиксаторы готовил; на 0. ?М
-. 12 -
кокадилатном буфере (рН =7.3-7,4). Срезы получали на ультрамикро-тсме LKB (Швеция), контрастировали цитратом свинца и просматривали с помощью микроскопа ЭМВ-1С0Л (СССР).
Кусочки органов фиксировали в нейтральном формалине по Лилли и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематокси-лин-зозинсм, азур-эозином. по Хочкиссу, Лейшману-Романовскому и Граму. Часть материала замораживалась в жидком азоте для приготовления криостатных срезов. Гистологические срезы изготовлены на санном микротоме Relchert (Германия) или замораживающем микротоме Cryocut (США). Анализ препаратов и их Фотодокументация произведены на светооптическом микроскопе Axtomat (Германия) и люминесцентном микроскопе ЛЮМА.Ч И2 (Россия).
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА МАТЕРИАЛА. Результаты исследований
обработаны с использованием параметрической (t-критерий Стыоден-та) и непараметрической (критерий Унлкинсона-Манна-Уитни) статистики. Использованы методы корреляционного и кластерного анализа, расчеты произведены с использованием программ электронных таблиц Guattro и статистического анализа Statgraflcs на ПЭВМ типа IBM-PC. Во всех расчетах за минимальный принимался 95 уровень значимости достоверности различий (Р<0.05).