Морфофункциональная характеристика панкреатических бета-клеток при воздействии на них повреждающих и корригирующих факторов (в условиях in vivo и in vitro) Корчин, Владимир Иванович

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Сахарный диабет - одна из ведущих проблем клинической медицины. Значительная распространенность, хронический характер течения и разнообразие органных поражений определяют медико-социальное значение данной патологии. По современным представлениям, основным условием развития сахарного диабета I типа является абсолютная инсулиновая недостаточность, ведущая к характерным нарушениям обмена веществ (В. Г. Баранов и соавт. , 1983; М. И. Балаболкин, Л. И. Гаврилюк, 1983; А. С. Ефимов, 1989; Н. Keen, 1989).

Для всестороннего изучения патогенеза и патоморфологии данного заболевания эндокринной системы, а также для выяснения механизма антидиабетического действия различных препаратов, наиболее удобной и доступной для многих исследователей является экспериментальная модель аллоксанового диабета. Большинство авторов связьшают цитотоксический эффект аллоксана с генерацией высокоактивных свободных радикалов (М. Я. Николаева, Р. М. Пархимо-вич, А. Б. Зарайский, 1986; К. О. Блох, В. В. Полторак, А. М. Поверенный. 1987; Д. М. Геворкян, 1989; В. Н. Бобырев и соавг. , 1992; R. Е. Heikkila, В. Winston, G.Cohen, 1976; К. Asayama et al. , 1984; M. Nukatsuka, H.Sakurai, J. Kawada, 1989; L. V. Oberley, 1988), которые инициируют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в , клетке. Установлено, что при экспериментальном и клиническом диабете в крови и тканях существенно повышено содержание токсичных продуктов ПОЛ (ILH. Боднар, А. М. Приступи?, 1984; R В. Иванов, И. В. Васенева, Е А. Удинцев, 1984; К. Г. Карагезян, Л.МОвсепян, К. Г. Адонц, 1985, 1990; Л. К Старосельцева и соавг.., 1386; И. Г. Шумейко, 1986; А. С. Ефимов, 1990; Л. К Корязова, А. К. Гулевский,1990; И. И. Дедов и соавт., 1992; Т.С.Балашова и соавт., 1993; I.Nishi-gaki et al., 1981; R. Selvam, С V. Anuradha, 1988; R. Yabe et al. , 1988; I. H. Nomikas, Y.Vang, K. jlLafferty, 1989; V. Prccaccl et al. , 1991), особенно при тяжелом его течении.

Однако в большинстве своем эти авторы лишь констатировали Факт усиления липидной пероксидации, не уделяя достаточного внимания состоянию активности антиоксидантних ферментов и не сопоставляли в эксперименте это явление с морфофункциональнкми тамэнениями островкового аппарата поджелудочной железы. Извест-

но, что общий уровень свободнорадикальных процессов и скорость накопления липопероксидов в клетке зависят от соотношения процессов образования и обезвреживания свободных радикалов. Исходя из этой предпосылки, мы сочли целесообразным использовать комплекс современных методов исследования для получения более целостного представления о патогенетической роли процессов ПОЛ в повреждении бета-клеток при сахарном диабете и выяснения эффективности влияния антиоксидагных препаратов (никотинамид, пробукол) на упорядочение процессов тканевого метаболизма, функциональной активности ферментов антиоксидантной системы защиты, а также на усиление пролиферативной способности клеточных элементов поджелудочной железы у крыс до и после введения диабетогенного фактора. Углубленное исследование в этом направлении важно не только для понимания молекулярно-цитологических основ диабегогенеза, оно позволит расЕиригь представление о механизме действия никотинамида и пробукола и увеличить диапазон их клинического применения.

Цель ' исследования. Настоящая работа была предпринята с целью изучения морфофункциональной характеристики панкреатических бета-клеток при воздействии на них повреждающих и корригирующих факторов в услоьиях in vitro и in vivo.

Задачи исследования. Конкретными задачами нашей работы, которые обусловили выделение ее основных разделов, явились следующие:

1. Выяснить влияние однократного и продолжительного введения Никотинамида и пробукола на динамику изменений углеводного и липидного обмена, уровня продуктов ПОЛ и активность антиоксидантних ферментов в плазме крови и в органах (печень, поджелудочная железа), а также на показатели морфофункционального состояния -панкреатических остроЕков у здоровых крыс.

2. Исследовать возможность превентивного действия никотин-амида и пробукола в отношении развития аллоксановой и других химических моделей диабета.

_ 3. Изучить на культуре изолированных панкреатических островков (in vitro) прямое воздействие никотинамида и пробукола на устойчивость бета-клеток к цитотоксическому действию аллок-сана при различных условиях эксперимента.

4. Оценить состояние углеводного и липидного обмена, процессов ПОЛ и антиоксидантной системы защиты, а также гистострук-туры поджелудочной .телезы у крыс с хроническим аллоксановым диабетом на Фоне введения никогинамида или прсбукола. .

5. Выяснить возможность влияния никогинамида и пробукола на процесс регенерации островковой ткани поджелудочной железы у крыс, больных диабетом в зависимости от продолжительности курса их лечения.

6. Изучить механизм избирательной уязвимости панкреатических бета-клеток к действию диабетогенного фактора у разных млекопитающих.

7. Экспериментально обосновать целесообразность использования антиоксидантних препаратов с лечебно-профилактической целью при сахарном диабете.

Научная новизна. Впервые проведено углубленное исследование влияния никогинамида и пробукола на динамику изменений показателей углеводного и липидного обмена, процессов ПОЛ и системы антиоксидантной защиты, а также на морфофункцио-чальное состояние панкреатических островков в целом организме и in vitro. Доказано, что предварительное введение этих антиоксидантних препаратов предупреждает появление биохимических сдвигов и структурно-функциональных изменений в островковом аппарате поджелудочной железы после инъекции аллоксана и препятствует развитию клинических признаков диабета. Впервые обнаружено, что проявление превентивного эффекта никотинашда и пробукола зависит от выбора химического агента для воспроизведения экспериментальной модели диабета. Установлено, что предварительное введение антиоксидантних средств не предотвращает возникновение диабетического статуса у кроликов после инъекции дитизона В случае использования другого диабетогенного соединения - стреп-тоготоцина было отмечено отчетливое протективное действие лишь у никотинамида.

Впервые на модели изолированных островков методом сканирующей электронной микроскопии выявлены особенности цитотопогра-фии и микрорельефа поверхности инсулоцитов при воздействии никотинамида, пробукола и аллоксана. Получены прямые доказательства, ' что никотинамид и пробукол обеспечивают надежную запиту

- 4 -панкреатических бета-клеток от токсического действия аллоксана в условиях in vitro. Разработан высокочувствительный цитофлуо-риметркческий способ определения функциональной (инсулинобразу-ющей) активности островковых бета-клеток позволяющий оценить степень воздействия на них как повре:эдающих, так и корригирующих факторов.

Впервые показана взаимозависимость и взаимообусловленность между процессами лилидной пероксидации и деятельностью фзрмен-тативного звена антиоксидантной системы в поджелудочной железе -"органе-мишени" при. воздействии на нее диабетогенных агентов. Обнаружено, что введение аллоксана сопровождается нарушением углеводного и связанного с ним липидного обмена, избыточным накоплением продуктов ГОЛ и резким снижением в исследуемых тканях активности энзимов, утилизирующих свободные радикалы кислорода и липопероксиды,что способствовало появлению дисбаланса между ними и развитию деструктивных изменений в панкреатических бегсч-клетках.

Впервые продемонстрирована эффективность применения нико-тинамида и пробукола в упорядочении процессов тканевого метаболизма, функциональной активности ферментов антиоксидантного действия, а также в' стимуляции пролмфератавной активности клеточных элементов поджелудочной железы и образовании островков de novo у крыс с хроническим аллоксановым диабетом. Отмечено, что корригирующее влияние испытуемых антиоксидантних препаратов однотипно по направленности, но отличается по своей выраженности. В отличие от никотинамида, многократное введение пробукола способствовало значительному увеличению активности антиоксидантних ферментов, лимитирующих интенсивность течения процессов пере-окисления липидов.

Впервые представлено сравнительное исследование содержания продуктов ЮЛ и активности ферментов антирадикальной защггы в ткани поджелудочной железы у различных млекопитающих (крысы, морские свинки, кролики) до и после инъекции аллоксана. Показано, что в механизме избирательной уязвимости панкреатических бета-клеток к повреждающему действию аллоксана важное значение имеет исходный уровень активности основных антиоксидантних энзимов, который значимо отличался у разных видов животных.

Ноеиэна работы состоит б комплексном подходе к раскрытию

патогенетической роли липидной пероксидации и ферментативного звена антиоксидантною системы защити в механизме развития метаболических нарушений при сахарной диабете. Полученные данные убедительно свидетельствуют об эффективности влияния никотин-амида и пробукола на показатели углеводного и липидного обмена, интенсивность течения процессов ПОЛ и активность антиоксидантних ферментов, а также морфофункциональное состояние панкреатических островков при различных условиях эксперимента и открывают преспективу для более широкого использования этих препаратов в профилактике и лечении диабета.

Теоретическая и практическая

значимость. Результати экспериментальных исследований, проведенных на молекулярном, клеточном и ультраструктурном уровнях, позволили сформулировать целостное представление о роли липидной пероксидации в генезе повреждений бета-клеток при аллоксановом диабете и рекомендовать использовать антиоксидатные препараты (никотинамид, пробукол) для коррекции нарушений тканевого метаболизма и деструктивных изменений в панкреатических островках. Полученные данные позволили установить особенности структурно-функциональных изменений в тканях печени и поджелудочной железы при интенсификации ПОЛ, а также выявить роль ферментативного звена антиоксидантно*! системы защиты в утилизации, свободных радикалов, что обусловливает различную степень чувствительности бета-клеток к псвреждающему воздействию диабето-генних агентов.

Получены прямые доказательства того, что никотинамид и пробукол обеспечивают надежную зашиту бета-инсулоцитов от цитоток-сического действия аллоксана в условиях in vitro.

Предложенный в работе цитофлуориметрический способ выявления инсулинобразующей активности панкреатических бета-клеток является высокочувствительным'и мояег быть рекомендован для использования в научных исследованиях, проводимых с культурой островков поджелудочной железы с целью сценки степени воздействия на них как повреждающих, так и корригирующих факторов.

Результаты работы открывают перспективы для более широкого использования антиоксидантних препаратов в комплексной терапии сахарного диабета

Реализация результатов исследования. Полученные экспериментальные данные опубликованы в различных изданиях стран СНГ, доложены на съездах, симпозиумах и конференциях. Результаты и выводи диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах гистологии, патологической физиологии, патологической анатомии, биохимии и физиологии, а также при чтении лекционного курса по эндокринологии в ряде медицинских институтов и факультетов усовершенствования врачей в Республике Казахстан и России.

По материалам исследования получено 1 авторское свидетельство на изобретение и 8 удостоверений на рационализаторские предложения.

Основные положения, Б и и о с и и и о и а защиту.

1. Однократное и продолжительное введение никотинамида и пробукола влияет на динамику изменений показателей углеводного и липидного обмена, уровня пиридиновых нуклеотидов, процессов ПОЛ и активности антиоксидантних ферментов, а также на морфо-функциональную характеристику панкреатических островков у здоровых крыс.

2. Предварительное введение крысам исследуемых препаратов с антиоксидантним спектром действия предупреждает появление биохимических сдвигов и структурно-функциональных изменений в ост-ровковом аппарате поджелудочной железы после инъекции аллоксана и препятствует развитию у них клинических признаков диабета. Превентивный эффект никотинамида и пробукола зависит от выбора химического агента для воспроизведения экспериментальной модели диабета

3. Внесение никотинамида или пробукола в питательную среду обеспечивает надежную защиту панкреатических бета-клеток от прямого цитотокелческого действия аллоксана в условиях in vitro.

4. Аллоксановый диабет у крыс сопровождается нарушением углеводного и связанного с ним липидного обмена, избирательным накоплег м продуктов ПОЛ и резким снижением активности антиоксидантних ферментов в тканях печени и поджелудочной железы, а также- деструктивными изменениями в островковых бета-клетках.

5. Продолжительный курс лечения никотинамидом или пробуко-
лом крыс с хроническим аллексановым диабетом приводит к г№к-
тивному упорядочению процессов тканевого метаболизма, функцио
нальной активности энзимов антиоксидантного действия, а также
способствует стимуляции новообразования и митотического деления
панкреатических бета-клеток.

6. Избирательная уязвимость бета-клеток к повреждающему действию аллоксана у разных млекопитающих обусловлена исходным уровнем активности антиоксидантних ферментов в их поджелудочной железе.

7. Использование никотинамида и пробукола при различных условиях эксперимента (in vivo и ia ) свидетельствует об их эффективности в коррекции метаболических расстройств и морфо-функционаяьных изменений в инкреторном аппарате поджелудочной железы и служит теоретическим основанием для более широкого применения этих препаратов в комплексной терапии сахарного диабета.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Ш Всесоюзной съезде патофизиологов (Тбилиси, 1982), межвузовской конференции "Вопросы физиологии эндокринной системы" (Кар ганда, 1985), П Всесоюзном совещании по хемилюминес-ценцил (Уфа, 1935), IY съезде эндокринологов УССР (Львов, 1937), IY Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 198?), У Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси, 1988), симпозиуме "Траксплантологические методы лечения сахарного диабета" (Юрмала, 1988), IY конференции морфологов республик Средней Азии и Казахстана (Караганда, 1988), Республиканской научно-практической конференции эндокринологов Таджикской ССР (Душанбе, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Ыикрозлементозы человека" .Москва, 1989), IY Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), Ш Всесоюзном съезде эндокринологов (Ташкент, 1989), Ш Всесоюзной конференции "Ейоангйоксиданг" (Москва, 1989), Республиканской научной конференции патофизиологов (Алма-Ата, 1990), Всесоюзной школе-семинаре "Шо-термо-хемилкшкесценций" (Суздаль, 1990), IX Всесоюзном семинаре "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Минск, 1990), X Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1990), Y конференции республик Средней Азии и Казахстана (Чолпон-Ата, 1991), Всесо-

кшюй конференции "Клиническая витаминология" (.Москва, i99i), Ш международной конференции "Экологическая патология и ее фар-шкокоррекция" (Чита, 1991), Y конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), IY Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992;, IY конференции "Биоантиок-еидант" (Москва, 1992), конференции "Проблемы экологической медицины" (Алма-Ата, 1993)

Диссертационная работа апробирована на объединенном заседании Научно-исследовательского центра (НИЦ), кафедр патологической физиологии, биохимии, патологической анатомии, гистологии и проблемной комиссии "Медико-биологические проблемы в медицине" Карагандинского государственого медицинского института.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы в журналах, сборниках научных трудов, материалах съездов, конференций. На основании результатов исследования изданы методические рекомендации, утвержденные МЭ Республики Казахстан.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 322 страницах машинописи, из которых собственно текст занимает 255 страниц. Работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, восьми глав собственных наблюдений, заключения и выводов. Список литературы содержит 500 наименований, из которых 312 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 49 таблицами и 73 рисунками, среди которых 43 микрофотографий и 28 элелтронограмм.