Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы 14
1.1.Современные представления о патогенезе бронхиальной астмы 15
1.1.1. Патогенез аллергической бронхиальной астмы 16
1.1.2.Патогенез бронхиальной астмы, ассоциированной с инфекцией 18
1.2. Роль провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы 19
1.3. Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы .21
1.4. Роль системы «протеолиз-антипротеолиз» в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы .22
1.5. Роль системы биотрансформации ксенобиотиков в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы 25
1.6. Современне представления о фенотипах бронхиальной астмы 27
Глава 2. Характеристика материала, объем и методы исследований .31
2.1. Краткая гигиеническая характеристика условий труда и контингентов обследованных групп 33
2.2. Методы клинического обследования больных 37
2.3. Методы биохимических исследований 40
2.4. Молекулярно-генетические методы исследования .43
2.5. Иммунологические методы исследования 45
2.6. Статистические методы обработки и анализа материала 48
Глава 3. Результаты собственных клинико-лабораторных исследований 56
3.1. Результаты клинико-функционального обследования 56
3.2. Результаты биохимических исследований 64
3.3. Результаты иммунологических исследований .70
3.4. Результаты молекулярно-генетических исследований .74
3.4.1. Результаты молекулярно-генетических исследований генов провоспалительных цитокинов 75
3.4.2. Результаты молекулярно-генетических исследований генов противовоспалительных цитокинов 77
3.4.3. Результаты молекулярно-генетических исследований генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков 79
3.4.4. Результаты молекулярно-генетических исследований генов системы «протеолиз-антипротеолиз» 81
3.4.5. Результаты молекулярно-генетических исследований генов системы антиоксидантной защиты 82
Глава 4. Результаты факторного и кластерного анализа 85
4.1. Результаты факторного анализа 85
4.2. Результаты кластерного анализа 88
4.2.1. Поиск показателей-предикторов фенотипов и определение чувствительности и специфичности предикторов 92
4.2.2. Фенотипы профессиональной бронхиальной астмы 101
Глава 5. Анализ связи между изученными генетико-биохимическими системами и клинико-лабораторными, биохимическими показателями .. 107
Глава 6. Обсуждение результатов 112
Выводы 131
Список сокращений .133
Список литературы
- Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы
- Методы биохимических исследований
- Результаты молекулярно-генетических исследований генов провоспалительных цитокинов
- Поиск показателей-предикторов фенотипов и определение чувствительности и специфичности предикторов
Введение к работе
Актуальность работы.
В последние десятилетия в большинстве стран отмечается нарастание распространенности БА [Вишнивецкий, И.И., 2015; Чучалин А. Г., 2014; Измеров Н. Ф., 2015].Профессиональной бронхиальной астмой (ПБА) болеют лица трудоспособного возраста, что приводит к значительным финансовым затратам, к снижению качества жизни, к потери трудоспособности, а при неадекватных подходах к ведению больных профессиональной бронхиальной астмы - увеличению летальности.
Гетерогенность бронхиальной астмы предполагает ее неоднородность на многих уровнях: клеточном, молекулярно-генетическом, иммунном, воспалительном и др. Значимость идентификации фенотипов БА обусловлена различием факторов риска, неоднородностью этиологических факторов, различным патогенезом, течением и прогнозом заболевания, различными подходами к терапии и ответом на лечение. На данный момент известно более 100 различных воспалительных медиаторов, вовлеченных в развитие комплекса воспалительных реакций и процессов в дыхательных путях у больных БА. Фенотипирование профессиональной бронхиальной астмы становится ключевым методом для выбора оптимальной терапии, позволяет обеспечить дифференцированный подход к лечению, разработке индивидуальных схем терапии данного заболевания и эффективных алгоритмов применения лекарственных препаратов, прогнозировать ответ на лечение и течение заболевания. Сложность фенотипирования бронхиальной астмы в настоящее время связана с недостаточной разработкой информативных патогенетически значимых молекулярных критериев (биомаркеров).
Классификация болезней с генетической точки зрения становится все более объективной по мере обнаружения полиморфных вариантов генов, вызывающих болезнь. Это касается как наследственных, так и мультифакториальных болезней, в возникновении и развитии которых участвуют как генетические факторы, так и факторы внешней среды. [Пузырев В. П., 1996; Dixon А. Е., 2012]
Современные технологические достижения характеризуются созданием новых подходов к методам диагностики, лечения и профилактики болезни, новыми теориями о факторах риска заболевания, о причинах формирования раннего начала, тяжелых клинических форм и невосприимчивости к лечению. Объективная оценка проблемы профессиональной бронхиальной астмы возможна только на основе единого, отвечающего современному уровню знаний подхода к определению, классификации, диагностике и лечению данного заболевания.
На данном этапе развития медицины труда широкое распространение получили исследования не только производственных факторов риска развития профессиональных заболеваний органов дыхания, клинических и функциональных его проявлений, но и геномные исследования по изучению генетико-биохимических полиморфных систем и взаимосвязи отдельных аллельных вариантов генов с различными патологическими и
воспалительными процессами, с интенсивностью протекания биохимических реакций для поиска информативных биомаркеров, влияющих на эффективность лечебных и профилактических мероприятий, направленных на снижение риска развития ПБА. Определение факторов риска на генетическом уровне позволит учитывать индивидуальные особенности организма и подойти к основам персонифицированной медицины. Следует отметить сложность установления диагноза именно профессиональной бронхиальной астмы, что связано с необходимостью использования обширного диагностического комплекса.
В связи с этим выявление фенотипов ПБА, а также их отличительных биохимических, иммунологических и молекулярно-генетических характеристик представляется актуальным для выявления ранних признаков развития и прогноза клинического течения ПБА с целью разработки и внедрения этиопатогенетически обусловленных профилактических и лечебно-диагностических мероприятий.
Цель работы: поиск биохимических и молекулярно-генетических маркеров различных фенотипов профессиональной бронхиальной астмы для оценки риска раннего развития, тяжести клинического течения и прогноза заболевания.
Задачи:
1. Изучить выраженность изменений биохимических маркеров воспаления у
больных различными формами ПБА и проанализировать зависимость их изменений от
нозологической формы и тяжести клинического течения заболевания.
-
Исследовать участие полиморфных генов провоспалительных (фактор некроза опухоль альфа - TNF-a G-308A, интерлейкин-17А - IL-17A G-197A) и противовоспалительных (интерлейкин 4 - IL4 С-589Т, интерлейкин 10 - IL10 G-1032A, интерлейкин 10 - IL10C-592A) цитокинов, ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков (микросомальная эпоксидгидролаза 1 - ЕРНХ1 Туг-113His), ферментов системы «оксиданты-антиоксиданты» (митохондриальная супероксиддисмутаза -MnSOD Т-58С), а также ферментов системы «протеолиз-антипротеолиз» (матриксной металлопротеиназы 12 - ММР-12 A-82G) в патогенезе различных форм ПБА для оценки значимости их биохимических полиморфизмов в механизмах формирования и развития указанной нозологии.
-
Определить особенности формирования и клинического течения различных нозологических форм ПБА в зависимости от особенностей экспрессии изученных генов биохимических и иммунологических полиморфных систем.
4. Проанализировать зависимость выраженности изменений биохимических
маркеров воспаления от генотипических разновидностей изученных систем про- и
противовоспалительных цитокинов, ферментов биотрансформации ксенобиотиков,
ферментов систем «оксиданты-антиоксиданты» и «протеолиз-антипротеолиз».
5. На основании анализа полученных результатов клинических, биохимических и
молекулярно-генетических исследований и анализа гигиенической характеристики
условий труда обследованных лиц выделить информативные критерии формирования фенотипов профессиональной бронхиальной астмы.
6. На основании разработанных клинических, клинико-лабораторных и гигиенических критериев выделить основные фенотипы профессиональной бронхиальной астмы и определить их основные отличительные особенности для использования результатов фенотипирования в системе лечебно-диагностических и профилактических мероприятий.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые разработаны критерии формирования фенотипов профессиональной бронхиальной астмы на основании анализа полученных результатов гигиенических, клинических, биохимических и молекулярно-генетических исследований. Впервые определены фенотипы ПБА, включающие кроме клинических показателей маркеры биохимических и генетико-биохимических полиморфных систем, патогенетически связанных с развитием указанной нозологии. На основании многофакторного анализа результатов проведенных исследований выделены информативные критерии формирования фенотипов ПБА, включающие показатели гуморального иммунитета, биохимические маркеры воспаления и аллельные варианты генов полиморфных биохимических и иммунологических систем: интерлейкинов (IL-17A G-197A, IL-10 С-592А), эпоксидгидроксилазы (ЕРНХ1 Tyr113His Т337С) и супероксиддисмутазы (MnSOD Т-58С). При использовании кластерного анализа выявлено 6 абсолютно не зависимых друг от друга фенотипов ПБА, из которых наиболее информативными оказались 4 (1, 3, 4, 6). На основе клинико-лабораторного анализа, предложена дифференциально-диагностическая таблица фенотипических вариантов профессиональной бронхиальной астмы, позволяющая индивидуализировать терапию и прогнозировать тяжесть течения заболевания. Новые данные, полученные в результате исследования, дополнят представления о роли генетических полиморфизмов в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы.
Полученные результаты биохимических и молекулярно-генетических показателей состояния системы провоспалительных (TNF-a G-308A, IL17A G-197A) и противовоспалительных (IL4 С-589Т, IL10 G-1032A, IL10C-592A) цитокинов, системы биотрансформации ксенобиотиков (ЕРНХ1 Туг-113His) и систем «оксиданты-антиоксиданты» - супероксиддисмутазы 2 (MnSOD Т-58С), а также «протеолиз-антипротеолиз» - матриксной металлопротеиназы 12 (ММР-12 A-82G) у больных профессиональной бронхиальной астмой, на основе которых выделялись фенотипы, могут служить критериями индивидуального риска развития профессиональной бронхолегочной патологии и могут быть внедрены в практику обследования больных ПБА для оценки тяжести клинического течения, индивидуального прогноза заболевания и выбора патогенетической терапии.
Практическая значимость.
1. Заявка на международный патент «Способ определения риска развития
фиброзных изменений в легких и печени» (приоритет от 24.07.2014 № 201400780).
2. Методические рекомендации «Тест-система для определения индивидуального
риска развития заболеваний бронхолегочной системы при воздействии
производственных факторов». - Москва. - 2013. Утверждены Пленумом Научного
совета 45 по Медико-экологическим проблемам здоровья работающих.
3. Методические рекомендации «Метод определения генетического
полиморфизма матриксной металлопротеиназы-1 с помощью реакции
пиросеквенирования». - Москва. - 2013. Утверждены Пленумом Научного совета 45 по
Медико-экологическим проблемам здоровья работающих.
-
Методические рекомендации «Диагностическое значение определения полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы - 12». Москва. - 2014. Утверждены Пленумом Научного совета 45 по Медико-экологическим проблемам здоровья работающих.
-
Методические рекомендации «Полиморфизм фактора некроза опухоли-а в оценке тяжести клинического течения профессиональной бронхиальной астмы». -Москва. - 2014. Утверждены Пленумом Научного совета 45 по Медико-экологическим проблемам здоровья работающих.
6. Медицинская технология: Прогноз тяжести клинического течения
профессиональной бронхиальной астмы методом определения соотношения
полиморфных вариантов генов провоспалительных и противовоспалительных
цитокинов. Новосибирск. - 2015. Утверждены Пленумом Научного совета 45 по Медико-
экологическим проблемам здоровья работающих.Технология внедрена в клинике ФГБНУ
«НИИ МТ» (акт внедрения от 05.10.2015 г.), в ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России
(акт внедрения от 01.03.2015 г.), результаты исследований включены в курс лекций и
практических занятий на кафедре медицины труда Первого МГМУ имени И. М.
Сеченова.
-
Медицинская технология: Разработка клинико-лабораторных критериев различных фенотипов профессиональной бронхиальной астмы. Новосибирск. - 2015. Утверждены Пленумом Научного совета 45 по Медико-экологическим проблемам здоровья работающих. Технология внедрена в клинике ФГБНУ «НИИ МТ» (акт внедрения от 05.10.2015 г.), в ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (акт внедрения от 01.03.2015 г.), результаты исследований включены в курс лекций и практических занятий на кафедре медицины труда Первого МГМУ имени И. М. Сеченова.
-
Медицинская технология: Выделение молекулярно-генетических маркеров различных фенотипов профессиональной бронхиальной астмы. Новосибирск. - 2015. Утверждены Пленумом Научного совета 45 по Медико-экологическим проблемам здоровья работающих. Технология внедрена в клинике ФГБНУ «НИИ МТ» (акт
внедрения от 29.06.2015 г.), в ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (акт внедрения от 01.03.2015 г.), результаты исследований включены в курс лекций и практических занятий на кафедре медицины труда Первого МГМУ имени И. М. Сеченова.
Апробация работы проведена на заседании специалистов клинического отдела профессиональных и производственно обусловленных заболеваний ФГБНУ «НИИ МТ» 29 мая 2015 года.
Результаты работы докладывались и обсуждались на - Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Региональные аспекты инновационных технологий профилактики, диагностики, лечения и реабилитации больных профессиональными и производственно-обусловленными заболеваниями верхних дыхательных путей и легких», 7 февраля 2013 г.; - Доклад в КНР 28 мая - 8 июня «Современные аспекты профпатологии в России Молекулярно-генетические исследования в медицине труда». - XXI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 7-11 апреля 2014 г.; - Школе-семинаре «Инновационные технологии в медицине труда и промышленной экологии» XIII Всероссийского Конгресса с международным участием «Профессия и здоровье», г. Иркутск- г. Новосибирск, 17-26 сентября 2015 г.; - Конкурс научных работ молодых учёных и специалистов XIII Всероссийского Конгресса с международным участием «Профессия и здоровье» (I место), г. Иркутск - г. Новосибирск, 17-26 сентября 2015 г.; на Ученом совете Института 23.09.13 и 18 мая 2015 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, 5 из них - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 33 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка сокращений. Список литературы содержит 151 наименований, представленных 84 отечественными и 67 зарубежными источниками.
Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» в патогенезе профессиональной бронхиальной астмы
В развитии и течении профессиональной бронхиальной астмы выделяют множество причин и факторов риска, которые провоцируют приступы и утяжеляют в дальнейшем течение заболевания. Механизм развития ПБА, как мультифакториального заболевания, очень непрост и полностью еще не изучен. Над проблемами диагностики, лечения и прогнозирования указанной патологии ведутся работы во многих странах, выстраивая сложную цепочку происходящих процессов в бронхах от причин и клинических проявлений данной болезни до возможности выявления предрасположенности к гиперреактивности бронхов при предварительных медосмотрах. Важная цель изучения патогенеза бронхиальной астмы – проследить схему развития болезни на всем ее протяжении, и на ее основании разработать новые, более эффективные средства как базисной терапии, купирования неотложных состояний при астме, так и своевременной диагностики ПБА. [143; 46; 27]
Согласно современным представлениям в основе профессиональной бронхиальной астмы лежит хроническое воспаление бронхиальной стенки с повышением количества эозинофилов, Т-лимфоцитов, тучных клеток в слизистой оболочке бронхиального дерева, утолщением базальной мембраны и последующим развитием субэпителиального фиброза, что приводит к воспалительным изменениям и развитию гиперреактивности бронхов и бронхообструкции.
Развитие аллергической ПБА обусловлено аллергической реакцией (АР) I типа (немедленная АР) по Gell и Coombs, в которой принимают участие IgE и IgG4. Этому процессу способствует дефицит Т-супрессорной функции лимфоцитов.
В механизме развития аллергической ПБА выделяют четыре фазы. Первая стадия – иммунохимическая – характеризуется тем, что на поверхности клеток мишеней аллергии (основное количество тучных клеток и базофилов находится в подслизистом слое и при стимуляции аллергеном количество их возрастает в десятки раз) при повторном поступлении аллергена в организм больного В лимфоциты секретируют специфические антитела преимущественно класса IgE (реагиновые антитела). После этого активируется субпопуляция Т-хелперов (Th2), которая продуцирует ряд цитокинов (интерлейкин-4), участвующих в осуществлении аллергической реакции I типа и переключающих синтез иммуноглобулинов в В-лимфоцитах на IgE и IgG. Вместе с активацией Th2-пути тормозится функция субпопуляции Т-лимфоцитов-хелперов (Th1-путь), секретирующих -нтерферон, тормозящий синтез IgE В-лимфоцитами. [114; 78; 136; 118] Вторая фаза (патофизиологическая) бронхиальной астмы, характеризующаяся развитием бронхоспазма, отека слизистой оболочки и инфильтрации бронхиальной стенки клеточными элементами, воспалением, гиперсекрецией слизи, обусловлена воздействием медиаторов аллергии и воспаления, которые выделяются тучными клетками, эозинофилами и лейкоцитами. Начало реакции через 1-2 минуты, достигая максимума через 15-20 минут и длительностью до 2х часов. Основными клетками, участвующими в развитии ранней астматической реакции, являются тучные клетки и базофилы. В процессе дегрануляции этих клеток выделяется большое количество биологически активных веществ — медиаторов аллергии и воспаления (гистамин, лейкотриены, простагландин Д2, различные протеолитические ферменты (металлопротеиназы). Кроме того, из тучных клеток выделяются интерлейкины, нейтрофильный и эозинофильный хемотаксический факторы, тромбоцитоактивирующий фактор, фактор некроза опухолей. Поздняя астматическая реакция начинается через 4-6 часов и длится до 8-12 часов. Основные проявления данной реакции являются гиперсекреция слизи, воспаление и отек слизистой оболочки бронхов. Различные клеточные элементы скапливаются в бронхиальном дереве под влиянием секретируемых тучными клетками медиаторов и цитокинов,что способствует развитию воспалительных изменений бронха, хронизации воспалительного процесса и формированию при последующих обострениях необратимых морфологических изменений. [40; 126; 144; 97]
Установлено, что в механизме привлечения воспалительных элементов в бронхи огромную роль играет адгезия клеток к эндотелию. Процесс адгезии связан с появлением на клетках эндотелия молекул адгезии (Е-селектина и внутриклеточного ICAM-1), а на эозинофилах и других клетках воспаления — соответствущих рецепторов и усиливается действием цитокинов — фактора некроза опухоли (ФНО, TFN) и интерлейкина-4, которые продуцируются тучными клетками. В настоящее время известно, что эпителий бронхов играет большую роль в развитии воспаления и бронхоспазма. Бронхиальный эпителий выделяет прововоспалительные цитокины, которые способствуют поступлению в стенки бронхов воспалительных клеток и активируют Т-лимфоциты и моноциты, участвующие в развитии иммунного воспаления. [120; 2]
Ведущую роль в развитии аллергической бронхиальной астмы играет гиперпродукция антител класса Е (IgE-зависимая бронхиальная астма). Существуют данные, указывающие, что у больных БА имеется повышение продукции не только IgE, но и иммуноглобулина G (IgE-IgG4-зависимая бронхиальная астма). [74; 42] Она характеризуется началом заболевания в более позднем возрасте (старше 40 лет), длительными приступами, меньшей эффективностью проводимых лечебных мероприятий. [147]
Реже в патогенезе аллергической БА играет ведущую роль аллергическая реакция III типа (иммунокомплексный тип). Образуются антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G и М. Далее идет формирование комплекса антиген-антитело, который активирует комплемент и освобождает лизосомальные протеолитические ферменты и медиаторов. Итогом этих процессов является бронхоспазм и развитие отека и воспаления в бронхах. [9]
В патогенезе инфекционно-зависимого варианта БА основная роль принадлежит Т-лимфоцитам, участвующим в гиперчувствительности замедленного типа. При повторных контактах с инфекционным аллергеном происходит гиперсенсибилизация, что приводит к выделению медиаторов замедленного действия, которые вызывают в клетках-мишенях (тучные клетки, базофилы, макрофаги) освобождение простагландинов, лейкотриенов и цитокинов, вследствие чего и развивается бронхоспазм. Также формируется воспалительный инфильтрат, содержащий нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, который является источником медиаторов немедленного типа (гистамин), вызывающих спазм бронхиального дерева и его воспаление. Из эозинофилов выделяются также белки, непосредственно повреждающие мерцательный эпителий бронхов, что затрудняет эвакуацию мокроты. Редко, но возможно развитие аллергической реакции немедленного типа с образованием IgE на ранних стадиях инфекционно-зависимой бронхиальной астмы. [43] Возможен вариант развития нарушение функции мерцательного эпителия и понижение активности -2-адренорецепторов. Глюкокортикоидные гормоны снижают сопротивляемость организма инфекционным агентам, уменьшают продукцию провоспалительных цитокинов (интерлейкина 17, фактора некроза опухоли) и активируют синтез противовоспалительных цитокинов (интерлейкина 4, 10), что нарушает цитокиновый баланс, приводя к хронизации инфекции.
Методы биохимических исследований
Воспалительная реакция дыхательных путей при астме сопровождается увеличением в просвете бронхов количества активированных эозинофилов, тучных клеток, макрофагов и Т-лимфоцитов. Воспаление и отек являются нормальным физиологическим ответом на повреждение ткани или инфекцию. Увеличение притока крови к поврежденному участку позволяет доставить к нему клетки воспаления и ускорить процессы заживления. Хроническое воспаление бронхиальной стенки при профессиональной бронхиальной астме сопровождается повышением количества эозинофилов, Т-лимфоцитов, тучных клеток в слизистой оболочке бронхиального дерева, утолщением базальной мембраны и последующим развитием субэпителиального фиброза, что приводит к воспалительным изменениям и развитию гиперреактивности бронхов и бронхообструкции. Основная проблема при профессиональной бронхиальной астме состоит в том, что воспаление из острой фазы переходит в хроническую, тем самым способствуя повторению приступов бронхиальной астмы. При длительном течении бронхиальной астмы в стенках бронхов происходят органические изменения, сопровождающееся их утолщением и так называемым «ремоделированием». Это приводит к тому, что сужение бронхов становится необратимым и тогда ПБА тяжело поддается лечению. Таким образом поиск информативных критериев риска развития профессиональной бронхиальной астмы и выявление ранних лабораторных признаков заболевания представляется актуальной задачей развития медицины труда.
Анализ полученных результатов исследований белковых фракций сыворотки крови выявил в группе больных с сочетанной и ассоциированной с инфекцией ПБА диспротеинемию с достоверным понижением уровня альбумина по сравнению с контролем [Таб. 3.2.1.] и повышением фракций 1-, 2-, -глобулинов, причем среднестатистические показатели выходили за пределы референсных значений. В группе больных с аллергической формой ПБА изменения касались фракции 2- и -глобулинов. Фракция -глобулинов,
состоящая из иммуноглобулинов A, M, G, была достоверно повышена в группе больных с аллергической ПБА (р 0,01).
Показатели белкового обмена в обследованных группах ПБА,ассоцииров анная с инфекцией (68 чел.) Аллергич еская ПБА (57 чел.) Сочетанная форма (42 чел.) Контрольная группа (40 чел.) Норма в популяции Альбумин 50,3±3,6 55,01±3,4 50,1±3,44 56,4±1,7 55,8-65 Фракция al-гл. 5,7±1,7 4,3±1,35 5,1±1,2 4,56±0,1 2,2-4,6 Фракция а2-гл. 13,1±1,4 9,67±1,63 13,56±1,86 # # 7,32±0,18 8,2-12,5 Фракция р-глобулинов 13,6±1,8 12,9±2,06 13,95±1,62 9,81±0,17 7,2-14,2 Фракция у-глобулинов 19,3±2,5 21,7±2,86 20,86±2,52 18,3±0,23 11,5-18, 0,001. Достоверность различий с контрольной группой: р 0,05; р 0,01; # достоверность различий по сравнению с группой с аллергической ПБА р Увеличение показателей -глобулинов во всех группах обследованных может объясняться увеличением уровня липопротеинов низкой плотности, так как большинство обследуемых представлено средней и старшей возрастными группами.
Повышение фракции 1-глобулинов в 1й и 3й группах в сравнении с контрольной группой, можно объяснить повышением уровней альфа-1-кислого гликопротеина (-1-к, орозомукоид) и 1-ингибитора, которые входят в данную фракцию. Гамма-глобулины, достоверно повышены в группах больных с аллергической и сочетанной ПБА (2я и 3я группа), по сравнению с контролем. Фракция -глобулинов содержит иммуноглобулины (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), поэтому повышение содержания -глобулинов отмечают при реакции системы иммунитета, когда происходит выработка АТ и аутоантител: при вирусных и бактериальных инфекциях, воспалении, коллагенозах, деструкции тканей и ожогах. Значительная гипергаммаглобулинемия, отражая активность воспалительного процесса, характерна для хронических активных бронхо-легочных заболеваний. Повышение фракции -глобулинов наблюдают у 88-92% больных ПБА. Для исключения возможного влияния сопутствующих заболеваний печени, ЖКТ и мочеполовой системы было проведено стандартное комплексное обследование в клинике ФГБНУ «НИИ МТ», включающее биохимический анализ крови с определением ферментов печени; общий анализ мочи, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и почек и т.д. При анализе данных не выявлено межгрупповых различий. Таким образом при анализе биохимических показателей белкового обмена нами выявлена характерная для воспалительной реакции тенденция: диспротеинемия со снижением фракции альбуминов и гиперглобулинемия – повышение 1-, 2-, -, -глобулинов у работников, имеющих контакт с веществами сенсибилизирующего и раздражающего действия. К главным белкам острой фазы у человека относят СРБ. Уровень этого белка возрастает очень быстро (в первые 6-8 часов после повреждающего воздействия). Его концентрация увеличивается в 2-100, а иногда и в 1000 раз.
Подобные реакции носят защитный характер. Известно, что С-реактивный белок (СРБ) усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов, он необходим для неспецифического опсонирования бактерий. СРБ связывает не только бактерии, но и токсины, а также частицы поврежденных тканей, благодаря чему усиливается фагоцитоз и активируется система комплемента по классическому пути. СРБ стимулирует продукцию супероксидного аниона в фагоцитах, увеличивает синтез провоспалительных цитокинов, играющих важную роль не
только в развитии воспаления, но и в регуляции синтеза биологически активных веществ, а также в иммунном ответе. Кроме того, СРБ оказывает влияние на функцию Т-лимфоцитов хелперов, киллеров и натуральных киллеров (NK-лимфоцитов), что неминуемо сказывается на интенсивности иммунного ответа и естественной цитотоксичности.
Уровень С-реактивного белка статистически достоверно повышен во всех группах обследованных больных ПБА по сравнению с контрольной группой. Наибольшие значения реактивности данного показателя отмечаются в группе больных с ПБА, ассоциированной с инфекцией. [Рис. 3.2.1.]
Результаты молекулярно-генетических исследований генов провоспалительных цитокинов
Представлен группой старшего возраста (50 лет и более). Чаще женщины. Со стажем работы более 25 лет. Тяжесть ПБА 2-3. Симптомы выражены, тип воспаления – нейтрофильный, наличие гнойной мокроты, снижение ОФВ1 менее 50%. Наличие хронических инфекционных заболеваний ЛОР-органов (чаще в анамнезе до 2-3 нозологий). Повышение иммуноглобулинов класса G, сочетание патогенной аллели провоспалительного интерлейкина 17A G-197A, ассоциированной с инфекционными заболеваниями, и патогенной аллели А противовоспалительного интерлейкина 10 C-592A, ассоциированных со сниженной экспрессией гена. Влияние неорганического и смешанных факторов на рабочем месте. Согласующиеся симптомы. Время от начала заболевания более 11 лет. Чаще строительные работы (штукатуры, маляры, – грунтовка, шпатлевка, шлифовка, покраска поверхностей), работники медицинской сферы (дезинфицирующие средства). Рентгенологические особенности – спаечные процессы и пневмосклероз. Повышенные концентрации белков острой фазы воспаления (-1-кг, СРБ, гаптоглобин). Эндокринная патология. Ангиосклероз сетчатки. [Таб. 4.2.2.]
Таким образом, выделенные фенотипы 1, 3, 4, 6 имели особенности в сроках развития заболевания, каждый фенотип характеризовался спецификой воздействующего фактора. Так в фенотипе 1 – неорганический фактор, в 3 – органический фактор, 4 фенотипе – металл-аллергены, а в 6 – неорганические и смешанные факторы. Важным показателем, который позволяет достоверно дифференцировать выделенные фенотипы профессиональной бронхиальной астмы, являются сроки развития заболевания от начала контакта с веществами раздражающего и сенсибилизирующего действия. Так фенотип 3 характеризуется ранним развитием заболевания (до 5 лет) от начала контакта с органическими веществами. В фенотипе 4 начало заболевания при стаже 15 лет, а фенотипе 6 время от начала заболевания от 11 лет. Обращает на себя внимание различие фенотипов по половой принадлежности, так в фенотип 4 в основном входят мужчины, а фенотип6 представлен в основном женщинами, тогда как 1 и 3 фенотипы имеют равное распределение по полу. В выделенных фенотипах специфическую особенность имеет распределение полиморфизмов генов различных полиморфных биохимических систем. Так в фенотипе 3 сочетания патологической аллели С в гене микросомальной эпоксидгидролазы 1 (EPHX1Tyr-113His), изменяющей свойства фермента и приводящая к снижению его активности на 50% - «медленный» аллель и уменьшающая его способность к гидроксилированию ксенобиотиков, и патологической аллели супероксиддисмутазы 2 T-58C, определяющей активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в митохондриях. В фенотипе 4 – сочетания патологической аллели Т противовоспалительного интерлейкина 4 С 589Т, угнетающего клеточный иммунитет и повышающий уровень IgE, повышенный уровень циркулирующих иммунных комплексов, гомозиготного АА варианта интерлейкина 10 C-592A и аллели G матриксной металлопротеиназы 12 А-82G, влияющей на уровень транскрипции гена и как следствие – повышение активности MMP12. В фенотипе 6 – сочетание патогенной аллели провоспалительного интерлейкина 17A G-197A, ассоциированной с инфекционными заболеваниями, и патогенной аллели А противовоспалительного интерлейкина 10 C-592A, ассоциированных со сниженной экспрессией гена.
Фенотипирование профессиональной бронхиальной астмы становится ключевым методом для выбора оптимальной терапии, позволяет обеспечить дифференцированный подход к лечению, разработке индивидуальных схем терапии данного заболевания и эффективных алгоритмов применения лекарственных препаратов, прогнозировать ответ на лечение и течение заболевания. Более 10 лет лет активно обсуждаются альтернативные классификации БА, в том числе и профессиональной БА, основанные на идентификации клинических и биологических фенотипов заболевания, что поможет определять индивидуальный подход к ведению каждого пациента с целью достижения максимально возможного уровня контроля заболевания, 106 снижения частоты обострений, тяжелых форм ПБА, возможности предотвращения частых респираторных заболеваний и эндокринной патологии. [41]
Анализ связи между изученными генетико-биохимическими системами и клинико-лабораторными, биохимическими показателями Изучение ассоциаций мультифакториальных заболеваний, таких как профессиональная бронхиальная астма, с определенными генами основано на предположении о том, что если тот или иной ген участвует в формировании предрасположенности к мультифакториальному заболеванию, то определенная аллель данного гена должна обнаруживаться у больных значительно чаще, чем в популяции. Частота встречаемости других аллелей этого гена у больных должна быть ниже, чем в популяции. В большинстве случаев в качестве маркеров выбирают аллели таких генетических полиморфных систем, продукты которых могут участвовать в патогенезе заболевания (системы про- и противовоспалительных цитокинов, гены системы биотрансформации ксенобиотиков, «оксидантной-антиоксидантной системы», «протеолиз антипротеолиз», белки острой фазы воспаления, иммуноглобулины и др.). При обнаружении увеличенной частоты встречаемости исследуемого маркера у больных по сравнению с контролем можно сделать заключение о существовании его ассоциации с заболеванием. Данные ассоциации могут имеет причину: исследуемый генетический маркер может быть одним из генов, определяющих предрасположенность к заболеванию, а его продукт — существенным звеном патогенеза заболевания, непосредственно влияющий на развитие болезни или появление тяжелых осложнений, либо стимулирует/подавляет выработку веществ, которые, в свою очередь, уже сами влияют на патогенез.
В последние годы большое значение придают выявлению клинико лабораторных, биохимических, иммунологических и других маркеров наследственной предрасположенности до проявления клинических симптомов или изучению их индивидуальных колебаний, которые рассматриваются как факторы предрасположенности к определенному заболеванию. Вместе с изучением взаимосвязи отдельных фенотипов и полиморфных вариантов генов различных биохимических систем, в настоящее время, актуальным является и их взаимосвязь с клиническими, биохимическими, иммунологическими показателями, т.е. определение для конкретного фенотипа клинических или биохимических фенотипов.
При анализе показателей ФВД в зависимости от исследуемых генотипов была выявлена корреляция (t=2,39, р 0,05) у пациентов с вариантами АА и АG гена интерлейкина 17 А (IL17A G-197А) с понижением значений ОФВ1 и индекса Тиффно по сравнению с пациентами с GG вариантом гена в группе больных с инфекционно-зависимой и сочетанной формами профессиональной бронхиальной астмы, т.е. лица с АА и АG вариантами гена интерлейкина 17 А имели достоверное снижение значений ОФВ1 и индекса Тиффно по сравнению с больными ПБА с GG вариантом гена.
Уровень показателя -1-кислого гликопротеина в группах с инфекционно-зависимой и сочетанной ПБА (1 и 3) (1,98±0,26 и 2,0±0,26) с наличием у обследованных гомозиготного АА варианта и гетерозиготного GA варианта гена интерлейкина 17 А (G-197А) коррелировал с уровнем орозомукоида в группе с аллергической ПБА (2) (r= 3,182 и r=2,77; р 0,05). Пациенты с AA и AG вариантами гена интерлейкина 17А имели достоверное повышение уровня показателя -1-кислого гликопротеина. [Рис. 5.1.]
Поиск показателей-предикторов фенотипов и определение чувствительности и специфичности предикторов
Таким образом наибольший белковый дисбаланс наблюдался у пациентов с инфекционно-зависимой и сочетанной формами ПБА. Повышение фракции 1-глобулинов в 1й и 3й группах в сравнении с контрольной группой, можно объяснить повышением уровней альфа-1-кислого гликопротеина (-1-к, орозомукоид) и 1-ингибитора, которые входят в данную фракцию. Увеличение показателей -глобулинов во всех группах обследованных может объясняться увеличением уровня липопротеинов низкой плотности, так как большинство обследуемых представлено средней и старшей возрастными группами.
В результате иммунологического обследования получены данные, позволяющие сделать вывод о преобладающем влиянии на состояние иммунитета у больных с инфекционно-зависимой и сочетанной формами профессиональной бронхиальной астмы. Выявлено достоверное (р 0,01 и р 0,01 соответственно) превышение ЦИК в 1й и 3й группах, что позволяет рассматривать это как маркер длительной персистирующей инфекции при ПБА, так как формирование циркулирующих иммунных комплексов представляет собой физиологические механизмы защиты, следствием которых является быстрое устранение как эндогенных, так и экзогенных антигенов (вирусы, микроорганизмы, растительные антигены, паразиты, антигены грибов, пищевых продуктов или пыльцы) посредством ретикуло-эндотелиальной системы. Пребывающие в крови циркулирующие иммунные комплексы находятся в непосредственной связи с эритроцитами, а также в свободной форме присутствуют в плазме. ЦИК, связанные с эритроцитами, не оказывают частого повреждающего действия, из-за чего большее внимание привлекает вопрос определения уровней свободных циркулирующих иммунных комплексов. ЦИК формируются после каждой встречи антигена с антителом и разрушаются усилиями мононуклеарных фагоцитов по завершению активации комплемента.
В группе с аллергической ПБА при проведении анализа полученных результатов активности общего IgE выявлено достоверное увеличение уровня данного показателя в группе с сочетанной и аллергической ПБА по сравнению с группой контроля (р 0,01). Использование анализа множественного межгруппового сравнения показал, что наибольший уровень данного иммуноглобулина представлен в группе с сочетанной профессиональной астмой (165 МЕ/МЛ), что объясняет вклад иммунологических механизмов в развитие заболевания у обследованных 2й и 3й групп. Подверженность некоторым болезням обусловлена сочетанием в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, проявляющийся при взаимодействии с факторами среды патологическим фенотипом. Благодаря достижениям молекулярной генетики и развитию позиционного и кандидатного картирования, появилась возможность решения этой проблемы в описании полиморфизмов конкретных генов, ответственных за формирование предрасположенности к тем или иным мультифакторным заболеваниям. [38; 31]
Персонализированная медицина, изучающая генетические основы индивидуального ответа при различных заболеваниях в настоящее время интенсивно развивается. В основе лежат представления о замене нуклеотидов в молекуле ДНК (генетический полиморфизм), которые влияют на функциональную активность продуктов генов, таких как усиление или ослабление выработки кодируемых веществ, изменение времени реакций на тот или иной раздражитель. Наибольшее значение имеет изучение полиморфизмов генов, продукты которых влияют на различные звенья патогенеза. В нашем исследовании в качестве подобной модели представлены гены нескольких систем, актуальнось изучения которых подтверждена многими исследованиями. [66; 55]
Исследование полиморфизмов указанных генов у различных групп больных профессиональной бронхиальной астмой выявило, что в первой группе, ассоциированной с инфекцией наблюдается достоверное превышение частоты встречаемости в 57,2% патологической аллели А гена интерлейкина 17 А G-197А, ассоциированной с наследственно обусловленным повышение уровня провоспалительного цитокина Ил17А. Биологическая функция Ил 17 А направлена на обеспечение взаимодействия между врожденным и приобретенным иммунитетом и обуславливается полиморфизмом гена интерлейкина 17 А G-197А. При анализе результатов распределения частоты полиморфного варианта гена IL10 G-1082A было выявлено достоверное повышение частоты встречаемости у 47,7% больных ПБА по сравнению с группой популяционного контроля (41.2%) (2 = 4,57, р 0,05). Однако при межгрупповом сравнении было выявлено, что генотип GG гена Ил-10 чаще (61,2%) встречается при профессиональной бронхиальной астме, ассоциированной с инфекцией, что может отражать несостоятельность механизмов иммунной защиты органов дыхания и ослабление репаративных процессов в лёгочной ткани. Ил-10 имеет возможность ингибировать продукцию провоспалительных цитокинов.
Во второй группе с аллергической профессиональной бронхиальной астмой при анализе результатов распределения частоты полиморфного варианта гена было выявлено достоверное превышение в группе у больных аллергической ПБА в 54,6% и в группе с сочетанной ПБА (50,3%) (2 = 7,57 и 2 = 9,21 р 0,05) , то есть эти лица имели наследственно обусловленное снижение уровня ИЛ 10, обладающего противовоспалительным действием. При анализе результатов распределения частоты полиморфного варианта гена EPHX1 Tyr-113His было выявлено достоверное повышение частоты встречаемости у 51,7% обследованных больных ПБА по сравнению с группой популяционного контроля (41%) (2 = 9,71, р 0,05), что указывает на снижение активности фермента на 50% - «медленный» аллель и уменьшает его способность к гидроксилированию ксенобиотиков.
При индивидуальном анализе результатов распределения частоты полиморфного варианта гена MnSOD T-58C выявлено, что у 67% (=5,23 р 0,05) лиц с наличием аллели С отмечалось формирование заболевания при небольшом (до 5ти лет) стаже работы в условиях воздействия веществ раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Таким образом, обнаружение полиморфных вариантов генов TNF- G-308А, IL17A G-197A, IL4 С-589Т, IL10 G-1082A, IL10 С-592А, EPHX1 Tyr-113His, MnSOD T-58C, ММР12 А-82G может свидетельствовать о нарушении соотношения уровня про- и противовоспалительных цитокинов, уменьшении способности к гидроксилированию ксенобиотиков, снижении уровня фермента антиоксидантной защиты, нарушении в системе «протеолиз-антипротеолиз, в следствии чего происходит активация воспалительных реакций у больных ПБА. Также отмечается более раннее развитие заболевания (до 5 лет) у лиц имеющих аллели С и G генов системы биотрансформации ксенобиотиков (EPHX1 Tyr-113His) и антиоксидантной защиты (MnSOD T-58C).