Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы
1.1. Получение гаплоидов в культуре пыльников
1.1.1. Биология развития микроспор в культуре пыльников 13
1.1.3. Факторы, влияющие на гаплопродукцию 24
1.1.3. Генетический контроль гаплопродукции в культуре пыльников 25
1.2. Получение гаплоидов методом селективной элиминации хромосом
1.2.1. Получение гаплоидов обыкновенного ячменя в скрещиваниях Hordeum vulgare L. х Hordeum bulbosum L 32
1.2.2. Получение полигаплоидов пшеницы при скрещивании с Zea mays L. и Pennisetum americanum L 40
1.3. Селекционное использование диплоидизированных гаплоидов 48
ГЛАВА 2. Материал и методика исследований
2.1.Изучаемый материал 61
2.2.Мето дика исследований 64
ГЛАВА 3. Получение гаплоидов в культуре пыльников
3.1. Факторы, влияющие на гаплопродукцию 77
3.2. Генотип донорного растения
3.2.1 . Гаплопродукция у сортообразцов мягкой и твердой пшеницы саратовской селекции 115
3.2.2.Особенности культивирования пыльников межвидовых гибридов 121
3.2.3. Получение гаплоидов ячменя в культуре пыльников 133
3.2.4. Регенерация растений 142
ГЛАВА 4. Генетический контроль морфогенеза на гаплоидном и диплоидном уровнях
4.1. Андрогенез в культуре пыльников линий, содержащих гены низкорослости 166
4.1. Влияние Rht-генов на морфогенез в культуре незрелых зародышей мягкой и твердой пшеницы 174
ГЛАВА 5. Получение гаплоидов методом селективной элиминации хромосом
5.1.Получение гаплоидов обыкновенного ячменя при скрещивании Hordeum vnlgare L. х Hordeum bulbosum L 188
5.1.1. Удвоение хромосомного набора регенерантов 203
5.2. Получение полигаплоидов пшеницы в скрещиваниях с кукурузой и африканским просо 206
ГЛАВА 6. Использование диплоидизированных гаплоидов в селекции
6.1.Методы гаплоидии в селекции ячменя 219
6.2. Гаплоидия в селекции пшеницы 225
Выводы 243
Список литературы 248
- Биология развития микроспор в культуре пыльников
- Получение полигаплоидов пшеницы при скрещивании с Zea mays L. и Pennisetum americanum L
- Гаплопродукция у сортообразцов мягкой и твердой пшеницы саратовской селекции
- Андрогенез в культуре пыльников линий, содержащих гены низкорослости
Введение к работе
Актуальность проблемы. Три последних десятилетия исследований по культуре клеток и тканей растений in vitro позволили существенно повысить эффективность методов и сделать их доступными для практического использования. В официальных каталогах зарегистрированы сорта не только двудольных растений, которые долгое время были модельными обьектами в культуре тканей, но и зерновых злаков. В значительной степени прикладное использование методов in vitro связано с клеточной и хромосомной инженерией. В экспериментальных работах и практической селекции широко используют гаплоиды - спорофиты с гаметическим числом хромосом.
Основное селекционное преимущество использования гаплоидов исходит из возможности одноэтапного получения гомозигот, что позволяет быстро фиксировать морфофизиологические параметры адаптивности и сокращать сроки создания приспособленных к суровым условиям Поволжья засухоустойчивых сортов, способных стабильно формировать высокие урожаи зерна и отвечающих всем потребностям современного рынка.
У гаплоидов каждый ген представлен единственным аллелем, и рецессивные аллели одних генов проявляются наряду с доминантными аллелями других.
Генетическое расщепление при использовании гаплоидов менее сложно (фактически оно не превышает числа классов гамет), и для выделения определенной комбинации генов нужна сравнительно малочисленная популяция.
Как известно, отбор в традиционной селекции проводится по одному колосу или одному растению, а на проявление признака в сложной гибридной популяции оказывают влияние как внутрипопуляционные взаимоотношения между растениями, так и различные эффекты взаимодействия генов, что делает отбор малоэффективным. Потомства диплоидизированных гаплоидов представляющие линию и состоящие из нескольких растений, легче оценивать и отбирать.
Для массового получения гаплоидов пшеницы и ячменя широко используются два метода - культуры пыльников и селективной элиминации хромосом чужеродного вида-опылителя. Несмотря на значительные успехи, достигнутые при разработке этих методов и создании на их основе ряда сортов важнейших видов зерновых культур, их эффективное применение сдерживается рядом причин, главными из которых являются воспроизводимость полученных результатов в различные сезоны и для различных генотипов в сочетании со снижением затрат на получение.
Проблема прямого использования DH-линий (потомств диплоидизированных гаплоидов) в качестве элитных для создания сортов пшеницы и ячменя в Поволжье является новой. Известно, что возделываемые сорта саратовской селекции гетерогенны - у пшеницы выявлен огромный внутрисортовой полиморфизм по компонентному составу глиадина (Метаковский и др., 1987). Гомогенность сортов гаплоидного происхождения затрагивает проблему их адаптивности в этом уникальном климатическом регионе, в первую очередь, засухоустойчивости.
Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является изучение возможностей использования гаплоидии в селекции засухоустойчивых сортов пшеницы и ячменя в условиях Поволжья.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- усовершенствовать биотехнологии получения гаплоидов в культуре зародышей и пыльников ячменя и пшеницы на основе оптимизации существующих методик и собственных разработок;
- изучить факторы, влияющие на гаплопродукцию;
- изучить сравнительную эффективность различных методов получения гаплоидов у пшеницы и ячменя; - изучить влияние Rht-генов на андрогенез в культуре пыльников и зародышей пшеницы in vitro;
- оценить селекционную ценность сортов, созданных методами гаплоидии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов оптимизации биотехнологий получения гаплоидов пшеницы и ячменя в культуре пыльников и зародышей.
2. Значение Rht-генов в культуре in vitro пшеницы.
3. Возможность создания сортов пшеницы и ячменя для условий Поволжья с использованием гаплоидии.
Научная новизна. Впервые изучено влияние Rht-генов в генофоне мягкой и твердой пшеницы на эффективность культивирования пыльников и незрелых зародышей. Показан существенный положительный эффект гена Rht-Blc как на гаплоидном, так и на диплоидном уровнях. Линии, содержащие ген Rht-Blc, характеризуются длительной морфогенетической активностью каллусов из незрелых зародышей при пассировании, а также более высокими значениями основных показателей, определяющих эффективность гаплопродукции в культуре пыльников, по сравнению со своим сибсом.
Впервые показана возможность использования пролиферативного антигена инициален (ПАИ) в качестве маркера морфогенетической активности каллусов пшеницы, что позволяет отбирать генотипы с высокой регенерационной способностью в культуре тканей in vitro.
Проведено комплексное изучение факторов, влияющих на эффективность гаплопродукции ячменя и пшеницы в культуре пыльников и зародышей, что послужило основой для массового получения DH-линий этих культур и их использования в практической селекции. Экспериментально доказано, что традиционное воздействие на колосья и пыльники донорных растений пониженными положительными температурами не является триггером спорофитного развития микроспор - оно происходит и в пыльниках не хранившихся на холоде колосьев.
Установлено, что высокая частота альбинизма регенерантов характерна для различных культуральных систем (культуры пыльников и культуры гаплоидных зародышей). Отсутствие альбиносов при прямой регенерации и появление их в значительном количестве среди регенерантов, полученных из каллусов незрелых зародышей, свидетельствует о том, что определяющей предпосылкой этого феномена является гаплоидный статус культивируемых клеток, прошедших стадию неорганизованного роста, а не генезис каллусных культур (микроспора или зародыш).
Частота проявления альбинизма зависит от генотипа растения-донора, а также физических условий культивирования полученных новообразований. Наибольшей частотой альбинизма характеризуются твердая пшеница, ячмень и межвидовые гибриды пшеницы. Постоянное культивирование при 12-15°С приводит к повышению частоты регенерации зеленых растений по сравнению с обычными режимами культивирования (25-27°С).
Впервые показано, что в суровых агроклиматических условиях Поволжья гомогенные сорта, элитные линии которых получены методами гаплоидии, не снижают засухоурожайности, как основного показателя их адаптивности в этом регионе. По коэффициентам пластичности и стабильности сорта ярового ячменя Нутанс 240 и яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 не уступают лучшим саратовским сортам-стандартам. При длительном самоопылении сорта пшеницы и ячменя гаплоидного происхождения сохраняют константность и однородность как по своей морфологии, так и электрофоретическим характеристикам запасных белков.
Практическая ценность работы. Адаптированы и усовершенствованы гаплоидные биотехнологии в культуре пыльников и незрелых зародышей пшеницы и ячменя для условий Поволжья. Результаты разработок опубликованы в "Методических рекомендациях по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников" (Дьячук Т.И., Дьячук П.А., 1989).
В результате использования гаплоидных биотехнологий получено 14495 DH-линий, в том числе, яровой мягкой пшеницы - 8297, озимой мягкой пшеницы - 428 и ярового ячменя - 5770. В содружестве с лабораторией селекции яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока методом культуры пыльников создан сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, допущенный к использованию в 8 регионе РФ (А.с. № 30538 от 01.06.1999 г.) и защищенный патентом РФ (№ 0344 от 05.11.1996 г.). В содружестве с отделом селекции ячменя Краснокутской СОС подготовлен для передачи на Государственные испытания сорт ярового ячменя пивоваренного направления Нутанс 240.
Полученные DH-линии используются как доноры важнейших селекционных признаков в рекомбинационной селекции, что явилось основой для создания новых засухоустойчивых сортов ячменя Нутанс 287, Нутанс 288 и Нутанс 279 и перспективной линии яровой мягкой пшеницы С-2127.
Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Аты, 1988, 1989), Международных рабочих совещаниях по программе 5.1.1.1. КПНТП СЭВ (Алма-Ата, 1988; Одесса, 1989; Москва, 1990), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1989; Москва, 1989; Алма-Аты, 1993), 1-м Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1991), на 5-ом сьезде ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987 ), 1-ом сьезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 5-ой международной конференции по пшенице (Анкара, 1996), Международной научной конференции "Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова" (Саратов, 1997), , .
Международном совещании "Проблемы селекции полевых культур на адаптивность и качество в засушливых условиях", посвященной 115- летию со дня рождения А.П. Шехурдина (Саратов,2001), Научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (М:МСХА, 2002), Всероссийской научной конференции "Селекция, семеноводство и технологии возделывания сельскохозяйственных культур сухо-степного Заволжья" (Пенза, 2002) и 6-й Всероссийской научно-практической конференции "Селекция и семеноводство полевых культур" (Пенза, 2002).
Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. Изучение роли генов Rht в культуре органов и тканей пшеницы in vitro было проведено совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии, селекции и генетики Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова д.с.х.н Лобачевым Ю.В. и к.с.х.н. Ткаченко О.В. Эксперименты по изучению специфики образования и накопления молекулярного маркера морфогенеза -пролиферативного антигена инициалей (ПАИ) проводились совместно со старшим научным сотрудником института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов) к.б.н. Евсеевой Н.В. Участие автора было определяющим при оформлении научных публикаций. Доля соискателя в создании сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 составляет 15%.
Связь работы с крупными научными программами. Данная работа выполнялась с 1984 по 2002 г.г. в соответствии с международной программой КП НТП СЭВ по пятому приоритетному направлению "Ускоренное развитие биотехнологии", программой ВРО ВАСХНИЛ- и РАСХН "Биологические основы интенсификации селекционного процесса культурных растений и животных".
Биология развития микроспор в культуре пыльников
В жизненном цикле покрытосеменных завершение редукционного деления в большинстве случаев знаменует начало кратковременной стадии мужского гаметофита. Формирующаяся одноядерная микроспора впоследствии дифференцируется в пыльцевое зерно. Важным свойством ранней дифференциации пыльцевого зерна, приводящим к его созреванию, является асимметричное деление сильновакуолизированной микроспоры, в результате которого образуются две неравноценные клетки - генеративная -меньших размеров с ядром из конденсированного хроматина и большая вегетативная клетка с диффузным, слабо красящимся ядром (первый гаплоидный митоз). Во время более поздних стадий дифференциации пыльцевого зерна генеративная клетка делится с образованием двух спермиев, которые вовлекаются в процесс двойного оплодотворения в зародышевом мешке. Судьба вегетативной клетки до конца не установлена. Предполагают, что она либо дегенерирует, либо существует как остаточная структура в пыльцевой трубке или в зародышевом мешке (Батыгина, 1974; Поддубная-Арнольди, 1976).
В отличие от гаметофитного спорофитный путь развития характеризуется формированием копий зиготических зародышей (эмбриоидов) из микроспор. Этот феномен, известный как андрогенез, (гаплоидный эмбриогенез, пыльцевой эмбриогенез, андроклиния) -наступает, когда пыльники растений, изолированные на определенной стадии развития, культивируются на относительно простых питательных средах с гормональными добавками или без них.
Началу развития метода послужили работы Гуха и Махешвари, показавшие, что пыльники Datura innoxia, культивируемые на питательных средах, давали эмбриоподобные структуры (Guha, Maheshvari, 1964,1966). Позднее на рисе было установлено, что на средах с добавлением 2,4-Д и НУК пыльники через 4-8 недель культивирования формировали каллусы. Цитологическая проверка каллусов подтвердила их гаплоидную природу. Перенос каллусов на среды с ИУК и кинетином способствует регенерации растений (Nizeki, Оопо, 1968). Вслед за этими работами были получены гаплоиды и у других видов злаков - ячменя (Clapham,1971), пшеницы (Ouyang, 1973; Picard, Buyser, 1983; Суханов, 1983), тритикале (Bernard, 1980), кукурузы (Genovesi, Collins, 1982), овсе (Rines,1983). Можно сказать, что в настоящее время гаплоидный андрогенез в культуре пыльников находится под экспериментальным контролем у важнейших видов зерновых злаков.
Уже к 90-м годам 20-го века было сообщение о том, что эмбриоидогенный или каллусный тип развития в культуре пыльников индуцирован у 250 видов покрытосеменных растений (Lorz et al., 1988). Из них более 40 видов пыльцевых растений, в том числе, важнейших видов злаков, впервые были получены китайскими учеными (Ни et al., 1986).
В бывш. СССР первые гаплоидные растения в культуре пыльников пшеницы были получены Приходько Н.И. (1980) в ВИРе им. Н.И. Вавилова и Сухановым В.М. (1982) в лаборатории генетики СГУ (г. Саратов). Двудольные растения, принадлежащих к сем. Solanaceae, являются идеальным объектом для успешной индукции спорофитного развития в культуре пыльников. Среди однодольных наибольшее внимание привлекают злаки, как наиболее ценные в экономическом отношении. На состоявшемся в 1984 году в Пекине международном симпозиуме по генным манипуляциям у растений были продемонстрированы первые практические результаты, полученные с использованием этого метода.
Теоретические и практические проблемы метода были освещены в ряде обзоров (Maheshvari et al., 1980; Maheshvari, 1982; Heberle-Bors, Dunwell, 1985; Горбунова и др., 1992; Анапияев, 2001). Несмотря на достигнутые успехи в получении гаплоидных растений в культуре пыльников важнейших видов злаков, реальное практическое использование этого метода продолжает сдерживаться рядом причин, важнейшими из которых являются низкая частота индукции андрогенетических структур, генотипическая зависимость, высокая частота альбиносных растений. Эти факторы выдвигают на первый план экономические затраты на получение гомозиготных линий при их использовании в практической селекции.
Развитие микроспор в культуре пыльников происходит двумя способами: а) прямого андрогенеза (в этом случае гаплоидные растения возникают на основе прямого эмбриоидогенеза) и б) непрямого андрогенеза, когда исходные клетки делятся и образуют недифференцированный каллус, в котором после переноса на дифференцирующую среду регенерируют растения. В определенных условиях процесс развития микроспоры может протекать в обоих направлениях (Новак, 1986).
Инициация спорофитного типа развития микроспор in vitro зависит от событий, которые предшествуют и следуют за первым митозом. У большинства изученных видов наиболее оптимальной стадией переключения микроспор на спорофитный путь развития является стадия вакуолизированной микроспоры и значительно реже - более поздняя или ранняя стадия развития пыльника.
Получение полигаплоидов пшеницы при скрещивании с Zea mays L. и Pennisetum americanum L
В жизненном цикле покрытосеменных завершение редукционного деления в большинстве случаев знаменует начало кратковременной стадии мужского гаметофита. Формирующаяся одноядерная микроспора впоследствии дифференцируется в пыльцевое зерно. Важным свойством ранней дифференциации пыльцевого зерна, приводящим к его созреванию, является асимметричное деление сильновакуолизированной микроспоры, в результате которого образуются две неравноценные клетки - генеративная -меньших размеров с ядром из конденсированного хроматина и большая вегетативная клетка с диффузным, слабо красящимся ядром (первый гаплоидный митоз). Во время более поздних стадий дифференциации пыльцевого зерна генеративная клетка делится с образованием двух спермиев, которые вовлекаются в процесс двойного оплодотворения в зародышевом мешке. Судьба вегетативной клетки до конца не установлена. Предполагают, что она либо дегенерирует, либо существует как остаточная структура в пыльцевой трубке или в зародышевом мешке (Батыгина, 1974; Поддубная-Арнольди, 1976).
В отличие от гаметофитного спорофитный путь развития характеризуется формированием копий зиготических зародышей (эмбриоидов) из микроспор. Этот феномен, известный как андрогенез, (гаплоидный эмбриогенез, пыльцевой эмбриогенез, андроклиния) -наступает, когда пыльники растений, изолированные на определенной стадии развития, культивируются на относительно простых питательных средах с гормональными добавками или без них.
Началу развития метода послужили работы Гуха и Махешвари, показавшие, что пыльники Datura innoxia, культивируемые на питательных средах, давали эмбриоподобные структуры (Guha, Maheshvari, 1964,1966).
Позднее на рисе было установлено, что на средах с добавлением 2,4-Д и НУК пыльники через 4-8 недель культивирования формировали каллусы. Цитологическая проверка каллусов подтвердила их гаплоидную природу. Перенос каллусов на среды с ИУК и кинетином способствует регенерации растений (Nizeki, Оопо, 1968). Вслед за этими работами были получены гаплоиды и у других видов злаков - ячменя (Clapham,1971), пшеницы (Ouyang, 1973; Picard, Buyser, 1983; Суханов, 1983), тритикале (Bernard, 1980), кукурузы (Genovesi, Collins, 1982), овсе (Rines,1983). Можно сказать, что в настоящее время гаплоидный андрогенез в культуре пыльников находится под экспериментальным контролем у важнейших видов зерновых злаков.
Уже к 90-м годам 20-го века было сообщение о том, что эмбриоидогенный или каллусный тип развития в культуре пыльников индуцирован у 250 видов покрытосеменных растений (Lorz et al., 1988). Из них более 40 видов пыльцевых растений, в том числе, важнейших видов злаков, впервые были получены китайскими учеными (Ни et al., 1986).
В бывш. СССР первые гаплоидные растения в культуре пыльников пшеницы были получены Приходько Н.И. (1980) в ВИРе им. Н.И. Вавилова и Сухановым В.М. (1982) в лаборатории генетики СГУ (г. Саратов). Двудольные растения, принадлежащих к сем. Solanaceae, являются идеальным объектом для успешной индукции спорофитного развития в культуре пыльников. Среди однодольных наибольшее внимание привлекают злаки, как наиболее ценные в экономическом отношении. На состоявшемся в 1984 году в Пекине международном симпозиуме по генным манипуляциям у растений были продемонстрированы первые практические результаты, полученные с использованием этого метода.
Теоретические и практические проблемы метода были освещены в ряде обзоров (Maheshvari et al., 1980; Maheshvari, 1982; Heberle-Bors, Dunwell, 1985; Горбунова и др., 1992; Анапияев, 2001). Несмотря на достигнутые успехи в получении гаплоидных растений в культуре пыльников важнейших видов злаков, реальное практическое использование этого метода продолжает сдерживаться рядом причин, важнейшими из которых являются низкая частота индукции андрогенетических структур, генотипическая зависимость, высокая частота альбиносных растений. Эти факторы выдвигают на первый план экономические затраты на получение гомозиготных линий при их использовании в практической селекции.
Развитие микроспор в культуре пыльников происходит двумя способами: а) прямого андрогенеза (в этом случае гаплоидные растения возникают на основе прямого эмбриоидогенеза) и б) непрямого андрогенеза, когда исходные клетки делятся и образуют недифференцированный каллус, в котором после переноса на дифференцирующую среду регенерируют растения. В определенных условиях процесс развития микроспоры может протекать в обоих направлениях (Новак, 1986).
Инициация спорофитного типа развития микроспор in vitro зависит от событий, которые предшествуют и следуют за первым митозом. У большинства изученных видов наиболее оптимальной стадией переключения микроспор на спорофитный путь развития является стадия вакуолизированной микроспоры и значительно реже - более поздняя или ранняя стадия развития пыльника.
Гаплопродукция у сортообразцов мягкой и твердой пшеницы саратовской селекции
Начиная с 1984 нами было изучено 442 генотипа пшениц, основную часть которых составили гибриды и сорта яровой и озимой мягкой пшеницы, межсортовые гибриды, а также межвидовые гибриды и виды Т. durum, Т. timopheevii, Т. aethiopicum, Т. persicum, Т. dicoccum. Из всего набора сортов и гибридов 5,4% не формировали в культуре пыльников ни одного эмбриоида, основная часть генотипов (92%) формировали от 1 до 6 андрогенетических структур на 100 пыльников и лишь 2,6% всех изученных образцов пшеницы имели частоту андрогенеза более 6%. Скрининг различных генотипов в различных условиях выращивания донорных растений показал, что наибольшую частоту отзывчивости имела линия мягкой пшеницы № 35/5 в полевых условиях выращивания доноров в 1986 году - 41,8%. Эта линия получена на Ершовской опытной станции от скрещивания Inia 66 х Кавказ. Благодаря высокой частоте формирования андрогенетических структур, линия была использована для изучения процессов морфогенеза и классификации аномалий в культуре пыльников пшеницы в совместных работах с БИН им. Комарова (г. Санкт-Петербург).
Частота формирования эмбриоидов у этого образца была 41,1%, регенерация растений составила 18,2 %, т.е. на каждые 100 культивируемых пыльников было получено 18 гаплоидных растений. У других сортов регенерация растений была на уровне 0,2-5,8 %.
Способность к андрогенезу в культуре пыльников некоторых сортов и перспективных форм яровой мягкой пшеницы саратовской селекции показана в табл.3.12.
У всех испытанных сортов и форм были получены эмбриоиды и зеленые растения, однако частота их формирования зависела от генотипа. Хорошей отзывчивостью в культуре пыльников отличались сорта Лютесценс 62, Альбидум 43, Саратовская 46, слабой - Саратовская 38 и Саратовская 42. Необходимо отметить, что общая частота образования регенерантов не всегда связана с максимальным выходом жизнеспособных растений. Отмечены сортовые различия и по этому признаку. Так, значительная часть регенерантов, полученных на основе сортов Саратовская 46, Альбидум 43 и перспективной формы С-1871 оказалась альбиносами - 70,4; 60,0 и 70,7% соответственно. Такие сорта, как Саратовская 29, Лютесценс 62 и Саратовская 54 формировали в культуре пыльников, главным образом, зеленые растения.
Таким образом, несмотря на резко выраженную генотипическую зависимость, у мягкой пшеницы регенерация растений в культуре пыльников возможна практически из всех генотипов. Проанализированный набор различных тетраплоидных видов - Т. durum, Т. aethyopicum, Т. persicum, Т. dicoccum - характеризовался более низким андрогенетическим потенциалом по сравнению с мягкой пшеницей. Исключение составил образец Т. persicum (к-133 85), который на протяжении ряда лет изучения превосходил другие тетраплоидные виды, а также многие сортообразцы и гибриды мягкой пшеницы по способности давать гаплоидные растения в культуре пыльников. Индукция андрогенетических структур у твердой пшеницы происходит примерно с такой же частотой, как и у мягкой. Однако, среди новообразований преобладают неморфогенные каллусы и недифференцированные эмбриоиды (глобулы) и процесс регенерации растений у этого вида протекает гораздо хуже, чем у мягкой пшеницы. У сорта Краснокутка 6 количество недифференцированных новообразований составило 67,8%, у Саратовской Золотистой 73,8%, а у Л1945 - 84,6% от их общего количества. Регенерация растений из них была очень низкой - всего 0,8-4,1%. Из 377 новообразований, полученных в этом опыте, регенерировано всего 9 растений. Причиной низкой эффективности гаплопродукции в культуре пыльников твердой пшеницы может служить отсутствие адекватных индукционных питательных сред. В связи с этим мы провели сравнительное изучение отзывчивости и регенерации растений в культуре пыльников различных сортообразцов и гибридов твердой пшеницы на твердых и жидких питательных средах с добавлением Фиколл-400 (табл.3.13). На агаровой питательной среде N6 частота индукции новообразований колебалась от 1,2 до 4,6%, на жидкой питательной среде, в которой агар был заменен на Фиколл 400, этот показатель составил 2,9-9,6%. Различия были незначимы только для одного сортообразца твердой пшеницы. Регенерация растений из новообразований, полученных на твердой питательной среде N6, колебалась у различных генотипов от 10,0 до 22,2%, в то же время культивирование пыльников на жидких питательных средах привело к лучшей дифференцированности каллусов и эмбриоидов, в связи с чем регенерация растений составила уже 30,4-58,3% (табл.3.14). Таким образом, использование жидких питательных сред в значительной степени позволяет решать проблемы, связанные с регенерацией растений у трудноотзывчивых сортообразцов.
Андрогенез в культуре пыльников линий, содержащих гены низкорослости
Идентификация крупных генов (олигогенов), контролирующих индукцию новообразований в культуре пыльников и регенерацию из них растений имеет ключевое значение по различным причинам. 1.Скрининг генотипов позволяет отбирать высокоотзывчивые сорта, которые могут использоваться как модельные для отработки оптимальных режимов культивирования, а также в опытах по клеточной селекции и генетической инженерии. 2. Прогнозирование ответной реакции генотипов по фенотипически выраженным признакам позволит значительность повысить эффективность технологии культивирования пыльников на всех этапах. 3. Достижение значительного эффекта позволит сделать возможными манипуляции с отзывчивостью к культивированию с целью повышения эффективности применения технологий в селекционном процессе. В литературе имеются сообщения о возможности конструирования линий с повышенным потенциалом регенерации in vitro посредством переноса в геном с помощью shooty-мутанта A. tumifaciens штамма GV 2206 генов, активирующих процесс регенерации растений картофеля (в данном случае цитокининовых генов) (Аветисов и др., 1991). 4. Генетически детерминируемые различия по отзывчивости к культивированию, особенно определяемые одной хромосомой, потенциально ценны для анализа физиологических различий, связанных с отзывчивостью к культивированию клеток и тканей in vitro. Высота растений - интегрированный показатель, контролируемый как минимум тремя самостоятельными группами генетических систем, среди которых ведущая роль принадлежит Rht-генам, являющимися специфическими олигогенеми низкорослости. Короткостебельные сорта способны формировать повышенный урожай за счет перераспределения биомассы и устойчивости к полеганию. Rht-гены разбиты на три класса, при этом для селекции в зоне с недостаточным увлажнением рекомендуется использовать гены, эффекты которых составляют менее 30% (Лобачев, 1990).
Существенное влияние этой системы на баланс эндогенных гормонов позволяет предположить ее детерминацию на процессы, происходящие в культуре клеток и тканей.
Результаты экспериментов показали, что гены низкорослости оказывают неоднозначное влияние на различные этапы андрогенеза в культуре пыльников. В генофоне мягкой пшеницы линия с геном Rht-Blb имеет существенно более высокий выход регенерантов от число инокулированных пыльников, хотя на промежуточных этапах оценки достоверно не отличается от своего сибса. В генофоне твердой пшеницы этот ген не оказал влияния ни на одном этапе культивирования.
В генофоне мягкой пшеницы ген Rht-Blc оказал существенное положительное влияние на эффективность культивирования. Положительный эффект гена на показатель "выход морфогенных пыльников" составил 60%, на показатель "выход гаплоидных новообразований" - 40,7% и на показатель "регенерационная способность" - 200% (рис.4.1, табл. 4.1). В генофоне мягкой пшеницы ген Rhtl4 оказал достоверное отрицательное влияние на показатели "выход морфогенных пыльников" и "выход новообразований" (эффект гена по обоим показателям составил 73,3%). В генофоне твердой пшеницы этот ген оказывает положительное влияние на выход регенерантов по отношению к морфогенным пыльникам и к новообразованиям по сравнению с высокорослым сибсом, но по отношению к количеству инокулированных пыльников регенерационная способность увеличилась несущественно. В то же время у твердой пшеницы регенеранты удалось получить только у лини с геном Rht-14. При этом на этапе индукции гаплоидных структур достоверного влияния на выход морфогенных пыльников и общее количество новообразований этот ген не оказывает и даже имеет тенденцию к снижению величины этих показателей. Таким образом, в зависимости от генофона (мягкая или твердая пшеница) ген Rht-14 оказывает различное влияние на способность к регенерации растений из полученных каллусов и эмбриоидов. Изменение величины проявления признаков, обусловленных действием генетической системы Rht, проявляется и in vivo при переносе генов из мягкой пшеницы в твердую (Lobachev, 1998). Кроме того, существуют данные и о влиянии уровня плоидности на способность к андрогенезу in vitro. Влияние генотипа особенно наглядно демонстрируют данные по соотношению различных типов гаплоидных структур (каллусов и эмбриоидов) среди общего количества новообразований. Хорошо известно, что регенерационная способность зависит не только от количества, но и качества новообразований, степени их дифференцированности (Henry, Buyser, 1990). У мягкой пшеницы слабоотзывчивый сорт Саратовская 29 и высокорослые сибсы не имеют заметного превосходства структур того или иного типа. То же самое можно отметить для линии с геном Rht-Blb. У линии, несущей ген Rht-Blc, характеризующейся наибольшей отзывчивостью в культуре пыльников, количество эмбриоидов достоверно превышает количество каллусов, что и является, очевидно, одной из причин лучшей регенерационной способности этого генотипа. Наоборот, линия с геном Rhtl4, достоверно снижающая способность к регенерации, характеризуется и меньшим количеством эмбриоидов по сравнению с каллусами (табл. 4.2).
