Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 История развития чаеводства в Краснодарском крае и Абхазии 11
1.2 Современное состояние и перспективы развития чаеводства 13
1.3 Морфобиологические особенности растений чая {Camellia sinensis (L.) Kuntze) 15
1.4 Климат и почвы влажной субтропической зоны, требования растений чая к условиям произрастания 19
1.5 Размножение чая 23
1.5.1 Клональное микроразмножение чая в культуре in vitro 24
1.6 Селекция чая 36
1.7 Естественная изменчивость растений чая 44
1.8 Спонтанная изменчивость, ее роль в эволюции и селекции растений.. 47
2. Условия, объекты и методы исследований 56
2.1 Почвенно-климатические условия в зонах проведения полевых опытов 56
2.2 Изучаемые сорта, формы, популяции чая и методы их исследования 58
3. Спонтанная изменчивость сорта колхида, популяции кимынь и местной популяции чая в двух агроэкологических зонах абхазии 66
3.1 Частота и спектр спонтанных соматических мутаций сорта Колхида и популяций чая 66
3.2 Перспективные спонтанные формы чая 73
3.2.1 Морфобиологическая характеристика спонтанных форм чая з
3.2.2 Кариологический анализ спонтанных форм чая 81
3.2.3 Хозяйственная ценность спонтанных форм чая 82
3.2.4 Биохимический анализ спонтанных форм чая 85
4. Селекционная оценка спонтанных сортов и индуцированных форм чая в условиях влажных субтропиков россии 88
4.1 Продуктивность спонтанных сортов и индуцированных форм чая 88
4.2 Морфобиологические особенности спонтанных сортов и индуцированных форм чая 95
4.3 Основные показатели качества чайного сырья спонтанных сортов и индуцированных форм чая 99
4.4 Экономическая эффективность спонтанных сортов и индуцированных форм чая 103
5. Клональное микроразмножение чая и сохранение пенных генотипов в культуре in vitro 106
5.1 Введение эксплантов чая в стерильную культуру in vitro 106
5.2 Индукция морфогенеза и получение микропобегов чая в культуре in vitro 109
5.3 Укоренение микропобегов чая в культуре in vitro 112
5.4 Индукция органогенеза из каллусной ткани в культуре in vitro 115
5.5 Адаптация микрорастений чая к условиям ex vitro 117
5.6 Депонирование микропобегов чая в культуре in vitro 120
Заключение 122
Предложения селекции и производству 124
Список использованной литературы
- Морфобиологические особенности растений чая {Camellia sinensis (L.) Kuntze)
- Изучаемые сорта, формы, популяции чая и методы их исследования
- Морфобиологическая характеристика спонтанных форм чая
- Экономическая эффективность спонтанных сортов и индуцированных форм чая
Морфобиологические особенности растений чая {Camellia sinensis (L.) Kuntze)
Большая заслуга в развитии чаеводства в Краснодарском крае принадлежит НИИГСиЦ (ныне ФГБНУ ВНИИЦиСК) и ученым: А.Д. Александрову, Н.М. Вильчинскому, И.И. Лаврейчук, В.П. Гвасалия, М.Т. Туову, А.И. Троянской, В.А. Евстафьевой, Т.П. Алексеевой. Ими были разработаны и внедрены в производство новые системы подрезки чайных плантаций, способы сбора листа, повышающие урожайность на 20 - 25 %, а также технология вегетативного размножения чая, позволившая поднять чаеводство на качественно новый уровень. Проведены исследования по селекции, агротехнике, орошению и удобрению чая. Изданы методические указания по технологии возделывания чая в субтропической зоне Краснодарского края (Алексеева, 1977). В отделе механизации, B.C. Подгоричани изобретены машины для проведения шпалерной подрезки и сбору чайного листа. Получили государственное признание новые селекционные сорта, выведенные учеными института. Это сорта: Мацестинский (Гвасалия В.П.) и Каратум, Сочи (Туов М.Т.).
Чаеводство в Абхазии являлось самой высокорентабельной отраслью сельского хозяйства, чистая прибыль от которой составляла 69,7 % от всех отраслей сельского хозяйства. Первые 27 га чайных плантаций были заложены в 1927 году. Большую помощь в развитии чаеводства оказали специалисты Эшба Г.Ф., Накопия В.Ш., Хашба Д., Гвасалия В.П. Чай выращивали в пяти районах Абхазии. Наиболее выраженная специализация была сконцентрирована в Гальском и Очамчирском районах, где было сосредоточено до 90 % всех чайных плантаций республики. Площадь листосборных плантаций по районам составляла: Гальский - 6667 га; Очамчирский - 4238 га; Гульрипшский - 308 га; Сухумский 80 га; Гудаутский - 767 га. Всего в Абхазии насчитывалось 12 тыс. га листосборных плантаций. В настоящее время общая площадь чайных насаждений составляет 6 тыс. га, в листосборе осталось всего 2 тыс. га. Всю деятельность отрасли координирует «АО Абхазчай».
Чай для россиян является составной частью национальной культуры. Приверженность к чаю не поколебали ни кофе, ни другие напитки. Потребление чая в России составляет 180 тыс. тонн и на рынке чая сохраняется стабильная динамика роста. За год «среднестатистический» житель России заваривает чуть больше 1,3 кг чая.
Краснодарский край является единственным производителем чая в Российской Федерации. Сейчас мы являемся свидетелями того, как некогда прибыльная отрасль стала убыточной и находится на грани кризиса. Объясняется это рядом причин, прежде всего увеличением себестоимости чайной продукции, снижением ее конкурентной способности, обусловленной нерегулируемой поставкой на российский рынок дешевого импортного чая, а также фальсифицированного и фасованного под маркой «Краснодарский чай».
В результате расформирования объединения «Краснодарский чай» была разрушена единая система по производству, переработке и реализации отечественного чая и на его основе были созданы акционерные общества: ЗАО «Дагомысчай», «Адлер - чай», ОАО «Мацестинский чай», ЗАО «Хоста - чай», ЗАО «Солох - Аул чай» и ЗАО «Шапсугский чай».
По состоянию на 01.03.2014 г. общая площадь чайных плантаций составляет 1428 га, из которых 1422 га находится в общественном секторе (6 чаеводческих хозяйств) и 6,0 га в частном секторе. Согласно полученным данным от управления сельского хозяйства г. Сочи (2014 г.) в эксплуатации фактически находится 214 га, что составляет всего 15 % от общей площади насаждений чая. Резко снизилась урожайность, так в 2008 году валовый сбор чайного листа составил 800 тонн с 506 га, в 2009 году - 573 тонны с той же площади, а в 2013 году -с214га-151 тонна. В период с 2005 по 2014 годы на 80 % плантаций не проводятся элементарные агротехнические мероприятия, а с 1993 года полностью вышла из эксплуатации оросительная система, что привело к значительному снижению урожайности. Появилась негативная тенденция к сворачиванию производства чая в крупнейших чаеводческих хозяйствах, таких как ЗАО «Дагомысчай». Главные причины это нежелание собственников и учредителей заниматься чаеводством, недостаточное государственное финансирование, отсутствие законодательных и нормативных актов, дефицит трудовых ресурсов и отсутствие оборотных финансовых средств. Для устойчивого развития чаеводства потребуется целевая программа по развитию чаеводства на период до 2020 года, предусматривающая меры государственной поддержки и субсидирования затрат на реконструкцию отрасли. Необходимо строить новые и реконструировать старые оросительные системы, провести закладку сортовых и обновление старых чайных плантаций, включая инвентаризацию всех насаждений. Для ускоренного восстановления возрастных плантаций требуются: срочная тяжелая и полутяжелая подрезка кустов, а для изреженных насаждений - ремонт. Для выращивания сортового посадочного материала необходим мощный агрокомплекс по вегетативному размножению. Увеличение площадей под культуру чай можно проводить за счет расширения ареала его возделывания, освоением предгорных районов, расположенных на высоте 600 м над уровнем моря. Превосходство горных районов перед низменностями обусловлено высокой и регулярной увлажненностью почвы и наличием снежного покрова в холодные месяцы года, что обеспечит защиту растений от действия низких температур.
Мировое потребление чая растет и составляет 4 млн. т, производство находится на уровне 4,1 млн. т (ФАО, 2010). Каждый день на планете выпивается больше полутора миллиардов чашек чая. Чай выращивают в 37 государствах мира, и его производство в последние годы неуклонно растет. Прежде всего это: Индия, Китай, Шри-Ланка (о. Цейлон), Япония, Индонезия, Иран, Пакистан, Вьетнам, Бирма, Кения, Уганда, Тайвань, Турция, Малага, Мозамбик, Перу, Аргентина, Бразилия, Мексика, Гватемала, Боливия, Колумбия и др.
Китай остается самой крупной страной по производству чая с объемом производства в 1,4 млн тонн, и его доля в мировом производстве составляет 33% (FAO: Прогнозы по ценам на чай — AGRO XXI). Индия - бесспорно, самый крупный в мире производитель высококачественных сортов чая в мире - 945 тыс. т (Мировой рынок чая: состояние и тенденции watermarket. ru articles/23 51).
Изучаемые сорта, формы, популяции чая и методы их исследования
Местом происхождения практически всех отечественных сортов -популяций чая считается п. Чаква (Аджария), где с 1925-х годов проводилась селекционная работа в филиале ВНПОЧСКиЧП. Под руководством В.Н. Покровского (Покровский, 1927, 1928, 1932) и К.Е. Бахтадзе -академика ВАСХНИЛ, Героя Социалистического труда, были созданы в 40 -50-х годах XX века первые высокоурожайные отечественные сорта -популяции чая (Бахтадзе, 1935, 1940, 1948, 1971). Здесь также работали видные селекционеры (Колелейшвили, 1973; Кутубидзе 1957, 1986).
Исходным материалом для селекции служили богатые коллекции семян и растений чая, привезенные из различных экспедиций в Китай, Японию, Индию, Шри-Ланку, Индонезию. Под различными названиями были ввезены более ста сортов - популяций чая. Назывались они чисто символично, от места происхождения и торговой марки поставщика. Лучше других акклиматизировалась китайская разновидность чая. Сорта чая в Китае - это популяции, носящие название тех районов, из которых они происходят. Известные сорта - популяции китайского чая: Янлоудун, Нинджоу, Фуджау и Кимынь, которые при продолжительном произрастании в определенных экологических условиях приобрели особенности экологических популяций. Это Кимынь, Кангра и Дарджилинг (Дараселия, 1989).
Популяция Кимынь - из восточной китайской провинции Аньхой. Относится к лучшей категории китайского крупнолистного чая. Кангра по происхождению китайский чай, но завезен из округа Кангра, лежащего вблизи Кашмира, на южном склоне западной части Гималаев. Дарджилинг из горной области северо-восточной Индии, морфологически неоднороден, т.к. состоит из смеси китайских и индийско-китайских рас (Дараселия, 1989).
Китайская разновидность заняла основное место в чайном хозяйстве влажных субтропиков. Второстепенное место заняла мелколистная и среднелистная японская разновидность чая. Растения же индийской разновидности, такие как Ассам и Манипури, не смогли приспособиться к внешним условиям из-за низких температур. В экологических популяциях влажных субтропиков присутствуют индокитайские гибриды, возникшие в природных условиях Шри-Ланки и известные под названием Цейлонский гибрид (Чхаидзе, 1991).
Так шел процесс акклиматизации и естественной селекции чая. В результате этого наиболее крупнолистные растения южных групп чая разместились в более южных районах, растения японского и китайского чая остались произрастать повсеместно. В образовании местной популяции принимали участие множество сортов - популяций, гибридов китайского, индийского и японского чая (Чхаидзе, 1991).
Для селекционной работы К.Е. Бахтадзе использовала следующие экологические популяции: индийско - китайскую (ИК); крупнолистную китайскую (КК); среднелистную китайскую (СК); мелколистную китайскую (МК); крупнолистную японскую (КЯ). Все эти популяции характеризуются высокой изменчивостью признаков и свойств, что является положительным фактором для селекции, но отрицательным для производства. Отбор — был и остается ведущим приемом при создании новых сортов и форм чая (Бахтадзе, 1948).
Основная селекционная работа К.Е. Бахтадзе проводилась в нескольких направлениях: изучались морфобиологические особенности чая; отбирались лучшие формы и выращивались на изолированных участках; размножались наиболее перспективные; изучались на константность признаков и основным биохимическим показателям; закладывались маточные плантации. Широко применялась гибридизация и отбор растений по морозостойкости и засухоустойчивости, повторная гибридизация с растениями следующего поколения, выросшими в более северных районах (Бахтадзе, 1948; Дараселия, 1989).
Созданные К.Е. Бахтадзе сорта - популяции отечественного чая принято делить на три группы: I группа - объединяет южные гибриды, в создании которых принимали участие индийские и китайские разновидности чая. Это растения с крупными листьями, продолжительным периодом вегетации, высокой урожайностью и высокими биохимическими показателями. В эту группу входят сорта популяции чая: Грузинский №№ 1, 3, 4, 5, и сорта: Грузинский № 15 (Колхида х индийско - китайским), Грузинский № 16 (клон № 37 х индийско - китайским) и сорт Колхида (клон № 257, выделенный на крупнолистной китайской разновидности). Все эти популяции и сорта чая рекомендуются для южных чаеводческих районов, где температура в зимний период не опускается ниже минус 8 С. II группа - объединяет популяции крупнолистного китайского чая, более зимостойкого, по сравнении с индийскими сортами. Это сорта популяции чая: Грузинский №№ 6, 10, 11. Рекомендуются для более северных районов, где температура воздуха в отдельные зимы может снижаться до минус 8 - 15 С. III группа - объединяет самые зимостойкие сорта - популяции мелколистного и среднелистного китайского чая. Сюда входят: Грузинский №№ 7, 8 - «Герой зимы», 12 - «Зугдидский зимостойкий». Предлагается для возделывания в северных и предгорных чаеводческих регионах с наличием снежного покрова и минимальной температурой минус -20 С. Все эти сорта и популяции чая характеризуются высокой продуктивностью и качеством готовой продукции, повышенной морозостойкостью. Известно, что разные подвиды чая свободно скрещиваются между собой, а их гибриды представляют собой сложные гетерозиготи, геномный комплекс которых насыщен множеством признаков присущих китайской, ассамской и японской разновидностям. В их возникновении и эволюции большую роль играют мутации, интрогрессия и естественная гибридизация. При скрещиваниях отмечено доминирующее влияние материнского растения (Чхаидзе, 1991).
Разработка технологии вегетативного размножения дала толчок для развития клоновой селекции. Путем клоновой селекции были выведены высокоурожайные клоны: №№ 37, 70, 72, 107, 121, 257 и др. Самым известным из них является клон № 257, крупнолистного китайского чая, известный под названием Колхида (Колелейшвили, 1973). В 1973 году Госкомитетом по сортоиспытанию МСХ СССР - сорт Колхида был рекомендован для производственного размножения. С этого времени началась масштабная научно-исследовательская работа по разработке индустриальной технологии по его вегетативному размножению (Тоидзе, 1976; Сарджвеладзе, 1981; Гогуадзе, 1986; Габричидзе, 1986; Хахо, 1986). Всего в чаепроизводящих районах СССР этим сортом было заложено более 5500 га плантаций: в Грузии - 3749,4, Краснодарском крае - 100, Абхазии 1634,4, Азербайджане - 16,2 (Дараселия, 1989).
Сорт Колхида отличается высокой урожайностью, а приготовленный из него напиток не уступает лучшим мировым стандартам и обладает неповторимым вкусом и розанистым ароматом. По сравнению с местной популяцией, сорт Колхида дает урожай до 52,1 ц/га, и на 50 - 60 % превышает по урожайности местную популяцию и все существующие сорта - популяции, при этом отличается высокими биохимическими показателями (Колелейшвили, 1973).
Морфобиологическая характеристика спонтанных форм чая
У сорта Колхида выделено для дальнейшей селекционной работы 4 формы. Исходный сорт Колхида по зимостойкости и характерным морфологическим признакам относится к китайской крупнолистной разновидности чая, антоциановая окраска его молодых флешей заметно выделяет его на чайных плантациях. Характеризуется интенсивным образованием побегов. Лист у него яйцевидной или удлиненно овальной формы, длиной 13,0 ± 0,6 см, шириной 5,8 ± 0,3 см. Пластинка листа светло-зеленой окраски, нежная, пузырчатая. Кончик листа - 1,0 см. Угол прикрепления листа - 63. Длина междоузлий 4,0 ± 0,3 см. Размер типса - 1,2 см. Средняя масса 3-х листных флешей - 1,2 г. Цветение в октябре. Длина вегетационного периода - 215 дней.
Форма № 553. Лист яйцевидной формы, длиной 14,5 ± 0,5 см, шириной 7,0 ± 0,4 см. Листовая пластинка тонкая, нежная, с антоциановой окраской, пузырчатая. Края волнистые, отогнуты к низу. Кончик листа 1,3 см. Угол крепления листа к побегу - 65. Междоузлия длинные - 5,5 ± 0,4 см. Средняя масса 3-х листных флешей - 1,5 г, с антоциановой окраской. Размер типса -1,8 см. Цветение позднее - ноябрь. Генеративная активность низкая. Длина вегетационного периода - 225 дней.
Форма № 555. Листья обратно - яйцевидной формы, ярко зеленые, пузырчатые. Длина листа 14,7 ± 0,2 см, ширина 6,8 ± 0,3 см. Кончик листа -1,4 см. Угол прикрепления листа к побегу - 65. Междоузлия 6,0 ± 0,4 см, 3-х листные флеши с антоциановой окраской, со средней массой - 1,5 г. Размер типса - 1,7 см. Цветение слабое, позднее (ноябрь), генеративная активность подавлена. Продолжительность вегетационного периода растения составила - 220 дней. Форма № 574. Листья яйцевидной формы, нежные, пузырчатые. Длина листа 14,8 ± 0,5 см, ширина 7,5 ± 0,5 см. Кончик листа - 1,2 см. Угол прикрепления листак побегу - 65. Длина междоузлий 5,8 ± 0,4 см. Типе длиной - 2,0 см. Флеши с антоциановой окраской, со средней массой - 1,5 г. Цветение позднее, конец октября - ноябрь. Генеративная активность снижена. Длина вегетационного периода - 220 дней. Форма № 588. Листья удлиненно-яйцевидной формы, ярко зеленой окраски, пузырчатые. Длина листа 13,6 ± 0,4 см, ширина 6,2 ± 0,5 см. Угол крепления листа к побегу - 63. Длина междоузлий 6,5 ± 0,3 см. Размер типса -1,8 см. Кончик листа - 1,3 см. Флеши с антоциановой окраской, средней массой - 1,3 г. Цветение позднее - в ноябре. Генеративные процессы подавлены. Период вегетации - 220 дней. Местная популяция - исходная (выделено 4 формы)
Исходная Местная популяция представлена смесью японской, китайской и индийской разновидностями чайного растения. Лист ланцетовидной формы или удлиненно-овальный. Окраска темно-зеленого цвета, без блеска. Листовая пластинка гладкая, кожистая. Длина листа 10,0 ± 0,5 см, ширина 4,0 ± 0,4 см. Кончик листа - 0,7 см. Размер типса - 1,0 см. Угол прикрепления листа к побегу - 52. Длина междоузлий 3,5 ± 0,7 см, 3-х листные флеши с антоциановой окраской, со средней массой 0,5 - 0,6 г. Цветение - в сентябре. Вегетационный период 210-215 дней.
Форма № 827. Листья удлиненно-овальной формы, темно-зеленого цвета. Листовая пластинка пузырчатая. Длина листа 13,2 ± 0,3 см, ширина 6,0 ± 0,2 см. Кончик листа - 1,0 см. Размер типса - 1,5 см. Угол прикрепления листа к побегу - 58. Междоузлия длиной 4,2 ± 0,5 см. Средняя масса 3-х листных флешей - 1,3 г. Цветение в октябре. Генеративные процессы подавлены. Длина вегетации - 220 дней.
Форма № 833. Форма листа удлиненно - овальная. Длина листа 13,5 ± 0,4 см, ширина 6,1 ± 0,4 см. Окраска листа темно-зеленая. Кончик листа - 1,0 см. Листовая пластинка пузырчатая. Типе размером - 1,4 см. Угол крепления листа к побегу - 62. Длина междоузлий 4,9 ± 0,5 см, 3-х листные флеши с антоциановой окраской, средней массой - 1,2 г. Цветение - октябрь. Генеративные процессы снижены. Продолжительность вегетационного периода - 220 дней.
Форма № 855. Форма листа удлиненно - овальная, цвет - темно-зеленый. Листовая пластинка пузырчатая. Длина листа 13,3 ± 0,3 см, ширина - 6,0 ± 0,3 см. Кончик листа 1,3 см. Типе размером 1,5 см. Угол крепления листа к побегу - 59. Длина междоузлий 4,2 ± 0,4 см. Средняя масса 3-х листных флешей - 1,3 г, с антоциановой окраской. Цветение в ноябре. Генеративные процессы снижены. Продолжительность вегетации - 220 дней.
Форма № 864. Лист удлиненно-овальной формы, темно-зеленого цвета. Листовая пластинка пузырчатая. Длина листа 13,4 ± 0,2 см, ширина 6,2 ± 0,3 см. Кончик листа - 1,3 см. Размер типса - 1,7 см. Угол прикрепления листа к побегу - 58. Длина междоузлий 4,6 ± 0,3 см. Средняя масса 3-х листных флешей с антоциановой окраской - 1,4 г. Цветение в ноябре. Генеративная активность снижена. Продолжительность вегетационного периода - 225 дней.
Из морфологического описания выделенных форм чая следует, что естественной изменчивости подвержены практически все признаки чая, в том числе такие селекционно-ценные как размер, форма, окраска листа, угол прикрепления листа к побегу, интенсивность побегообразования, длина вегетационного периода, генеративная активность. Все это позволяет среди спонтанно измененных растений выделить формы, которые могут служить исходным материалом для селекции новых сортов чая.
Экономическая эффективность спонтанных сортов и индуцированных форм чая
Для индукции морфогенных структур и поддержания тканей в активно пролифирирующем состоянии, были испытаны минеральные питательные среды: Мурасиге - Скуга (Murashige, Skoog, 1962), Гамборга В5 (Gamborg, 1968) и WPM (Woody Plant Medium, Lloyd, 1980), в различных сочетаниях с гормонами роста: 6 - БАЛ, зеатином, аденином, гибберелловой кислотой (Гкз), НУК, ИМК, ИУК, мезоинозитом. Всего шесть вариантов модифицированных питательных сред. Присутствие антибиотиков на данном этапе было исключено, поскольку они ингибировали пролиферацию и вызывали аномалии в развитии микропобегов.
На 1 варианте питательной среды Мурасиге - Скуга, несмотря на активную пролиферацию, и высоту микропобегов 2,2 ± 0,2 см, период культивирования был продолжительным и составил 1,5 - 2 месяца. Коэффициент размножения составил 2,8 микропобега с одного экспланта.
На 2 варианте питательной среды Гамборга Bs, при добавлении к основному составу гибберелловой кислоты (Гкз - 2,0 мг/л) и НУК - 0, 5 мг/л, происходило подавление пролиферации и образование витрифицированных (обводненных) микропобегов с аномалиями в развитии. Вследствие этого, микропобеги отличались слабым ростом, а период культивирования был самым продолжительным 2 - 2,5 месяца, а коэффициент размножения низким - 1,6 микропобега с одного экспланта (Таблица 16).
Пассирование эксплантов на 3 варианте питательной среды WPM с концентрацией цитокининов: 6 - БАП (3,0 мг/л), аденина - 0,9 мг/л, способствовало активной пролиферации и морфогенезу, наблюдался рост многочисленных пучков адвентивных микропобегов, коэффициент размножения был сравнительно высоким, с 1 экспланта можно было получить 3,5 микропобегов. При этом срок культивирования составил 1,5 месяца.
На уменьшенной вдвое, по минеральному составу питательной среде Мурасиге - Скуга, с ИМК - 1,0 и ИУК - 0,5 мг/л (вариант 4) был отмечен довольно высокий коэффициент размножения - 3,1 микропобега с одного экспланта, но период культивирования был продолжительным и составил 2,5 месяца.
Лучшей питательной средой (5 вариант) на которой наблюдался самый высокий коэффициент размножения, оказалась минеральная основа по прописи М - С, с добавлением 6 - БАЛ - 2,0 мг/л, гибберелловой кислоты -1,0 мг/л, НУК - 0,2 мг/л и мезоинозита 100 мг/л. При этом срок культивирования составил 1,5 месяца (Рисунок 29).
На контроле, на питательной среде М - С, без добавления стимуляторов роста был отмечен самый низкий коэффициент размножения -1,0. Микроразмножение проводили микропобегами, которые делили на сегменты с латеральной или апикальной почкой. Сортовые особенности здесь не имели значения, все зависело от концентрации и сочетания регуляторов роста. В результате исследований установлено, что для индукции морфогенеза и получения высокого коэффициента размножения микропобегов чая в культуре in vitro наиболее эффективной является среда Мурасиге - Скуга, с добавлением 6 - БАП - 2,0 мг/л, гибберелловой кислоты -1,0 мг/л, НУК - 0,2 мг/л и мезоинозита 100 мг/л.
В процессе микроразмножения было получено достаточное количество экспериментального материала, чтобы использовать его в постановке опыта с ризогенезом. Для этой цели подошли микропобеги, отличающиеся активным ростом и развитием. Для индукции корнеобразования базовой была выбрана питательная среда по прописи М - С, уменьшенная вдвое по основному минеральному составу, с добавлением стимуляторов роста ауксиновой природы: ИМК, ИУК и НУК, в различных сочетаниях и концентрациях (Таблица 17).
Влияние ауксинов на рост и укоренение микропобегов чая в культуре in vitro (2013 г.) Питательная среда Высажено микропобегов, шт. Всегополучено, шт. Продолжительность культивирования, месяц Средняя высота микрорастений см Контаминация, % Ризо-генез,% Каллусо-генез,%
В 1 варианте опыта, на уменьшенной вдвое по основному составу питательной среде Мурасиге -Скуга, с добавлением ауксинов ИМК - 1,0 мг/л, корнеобразование не отмечалось, микропобеги отличались слабым ростом 1,5 см в высоту. Наблюдался активный процесс нарастания каллусной массы в базальной части микропобега. В результате каллусогенез составил 93,3 %.
Во 2 варианте опыта, средняя высота микропобегов чая достигла максимальных размеров - 6,0 см. Несмотря на отсутствие корнеобразования на Vi питательной среде Мурасиге - Скуга с ауксинами ИМК - 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, был отмечен активный морфогенез и образование каллуса у 96,7 % микропобегов.
Следует отметить, что 2 вариант питательной среды ( МС; ИМК - 1,0 мг/л; ИУК - 0,5 мг/л) можно использовать на этапе микроразмножения. Вместе с тем, полученные микропобеги, благодаря мощному каллусу и развитию морфогенных структур можно адаптировать в вермикулите, минуя стадию корнеобразования (Рисунок 30). Рисунок 30 - Микропобеги чая на питательной среде Vi М - С, ИМК - 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л (2013 г.)
Лучшей питательной средой для укоренения микропобегов чая является Vi по прописи Мурасиге - Скуга, с добавлением ауксинов ИМК - 1,0 мг/л и НУК - 2,0 мг/л (Рисунок 31). Несмотря на среднюю высоту микрорастений чая 2,5 см, через 2,5 месяца ризогенез у них составил 82,0 %. От базального каллуса микропобега наблюдался рост 2-х, 3-х основных корней, размером 2,5 - 3,0 см, от которых отходили боковые проводящие корни, длиной 1,5 - 2,0 см, с большим количеством корневых волосков. Весь процесс микроразмножения, от высадки первичного экспланта на питательную среду, до укоренения микрорастений чая, составил 7-8 месяцев.
Большой интерес в наших исследованиях получили исследования, направленные на получение сомаклональных вариантов через каллусную культуру клеток. В процессе субкультивирования отмечено нарастание базального каллуса у основания микропобега. Несмотря на то, что в течение 2-х лет каллус регулярно изолировался от микропобегов и пассировался на свежие питательные среды, индукции органогенеза не наблюдалось.
Были апробированы 3 варианта модифицированных питательных сред, на основе базовой среды Мурасиге - Скуга. Через 3 месяца из меристематических очагов каллуса был отмечен органогенез и появление сомаклонов на среде, с добавлением цитокининов и ауксинов: 6 - БАЛ - 2,0 мг/л; гибберелловой кислоты - 1,0 мг/л; НУК - 0,2 мг/л и мезоинозита - 100 мг/л. Этот вариант оказался наиболее эффективным, органогенез составил 53,3 % (Таблица 18; Рисунок 33).