Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Происхождение культуры. Народно-хозяйственное значение 7
1.2 Морфологические и биологические особенности 8
1.3 Направление селекции 14
1.3.1 Использование гетерозиса в селекции моркови столовой 14
1.4 Генетические основы мужской стерильности в селекции 16
1.5 Получение удвоенных гаплоидов 19
Культура неопыленных семяпочек 20
Культура микроспор 20
1.6. Факторы влияющие на эффективность эмбриогенеза 22
1.6.1. Генотип донорного растения 22
1.6.2. Стадия развития микроспор 23
1.6.3. Влияние предобработки растительного материала 23
1.6.4. Состав питательной среды 24
2. Цель, задачи, условия проведения, материал и методика исследований 25
3. Экспериментальная часть 40
3.1. Морфобиологическая характеристика семенных растений инбредных потомств моркови столовой 40
3.2. Оценка инбредных потомств по семенной продуктивности 49
3.3. Анализ изменчивости признаков растений первого года в инбредных потомствах моркови столовой 52
3.4. Оценка комбинаций скрещивания по проявлению цмс и комплексу хозяйственно ценных признаков 75
3.4.1. Изменчивость признаков семенных растений комбинаций скрещивания ms x mf инбредных форм моркови столовой 75
3.4.2. Изменчивость селекционно ценных признаков комбинаций скрещивания инбредных ms x mf форм моркови столовой 79
3.5. Культура неопыленных семяпочек 88
3.6. Культура микроспор 94
Практические рекомендации 109
Список использованной литературы 110
Приложения 126
- Морфологические и биологические особенности
- Морфобиологическая характеристика семенных растений инбредных потомств моркови столовой
- Изменчивость селекционно ценных признаков комбинаций скрещивания инбредных ms x mf форм моркови столовой
- Культура микроспор
Морфологические и биологические особенности
Морковь столовая (Daucus carota L.) относится к семейству Сельдерейные (Apiacae). Растение двулетнее. В первый год жизни растение образует розетку листьев и утолщенный корень - корнеплод, во второй год – семенные растения и семена. Форма розетки листьев может быть прямостоячей, полу раскидистой, раскидистой, прижатой, высота 30-50 см. У диких форм листовая розетка обычно прижатая.
У растений первого года жизни листья черешковые, розеточные, простые, удлиненные, дважды-четырежды перисторассеченные. Форма сегментиков первого и последующих порядков рассеченная или лопастная. Иногда нижняя сторона листовой пластинки бывает опушена, окраска светло-зеленая, зеленая, темно-зеленая, серо-зеленая, сизо-зеленая и фиолетово-зеленая. Количество листьев в розетке — 7-15, иногда больше. Молодые листья имеют более светлую окраску, по сравнению со старыми. Два-три перисторассеченных листа с широким листовым влагалищем образуют розетку.
Разные сорта моркови отличаются по размеру черешка. Черешки у ранних сортов более короткие, тонкие, у поздних - длинные, более толстые. Черешки в основном опушенные, окраска зеленая, у некоторых сортов у основания и по ребрам фиолетово-красная.
Стебель моркови второго года жизни дудчатый, ребристый, голый или опушенный, слабо - или сильноветвистый; высотой 0,5-1,5 м, а иногда до двух метров высоты. Окраска стебля зеленая, желто-зеленая.
Каждый побег оканчивается соцветием в виде сложного зонтика. Соцветия состоят из более мелких зонтичков, а зонтички — из цветоносов и цветков. Цветки мелкие, обоеполые, хотя в одном соцветии иногда встречаются однополые, с нижней двугнездной завязью, двумя столбиками и пятью тычинками. Цветение — протеандрическое.
Плод – двусемянка, округлый, немного сжатый с боков, при обмолоте и обработке легко разделяется на отдельные семянки. Полуплодники на поперечном разрезе полукруглые с пятью главными и четырьмя вторичными ребрами. В бороздках между главными под вторичными ребрышками размещаются канальцы с эфирным маслом, придающие семенам моркови специфический запах. Поверхность семянок покрыта в один ряд волосками, с помощью которых семянки прочно цепляются друг за друга.
Форма семян – плоско-яйцевидная (торона, соприкасающаяся со вторым семенем в плоде, - плоская), длина семян моркови 2,0-4,0 мм, ширина 1-1,5 мм ( с волосками до 2 мм ), толщина 0,4-1,0 мм, в 1 кг не обтертых ( с волосками) семян содержится 500-520 тыс. и 800-900 тыс. обтертых семян. Масса 1000 не обтертых семян в среднем 2,0-2,4 г, обтертых — 1,0-1,4 г (Красочкин, 1948; Еременко Л.Л., 1975).
При оптимальных условиях (солнечная, теплая погда, нормальная влажность почвы) семена моркови через 20 дней после цветения достигают молочной спелости, еще через 5-10 дней восковой и еще через10-20 дней полной зрелости (Сазонова, 1971). В сложном зонтике формирование семян происходит по разному в кругах зонтика и зонтичков. Во всех кругах зонтичков размеры зародышей возрастают от периферии к центру. Рост зародышей в семенах на побегах разных порядков идет неодинаково. Быстрее всего зародыши растут в семенах главных зонтиков (Еременко Л.Л., 1975).
С появлением настоящих листьев начинается процесс формирования корнеплода. У моркови стержневая корневая система, распространяющаяся в глубину до 2-2,5 м, а по диаметру доходит до 1-1,5 м. Корнеплод образуется в результате вторичного утолщения корня и имеет сложное строение: различают головку, шейку и собственно корень, флоэмную и сердцевинную часть. По сравнению с флоэмой, сердцевина содержит значительно меньше каротина, она светлее окрашена, более грубая, содержит мало сахаров, поэтому вкусовая и питательная ценность ее ниже. В отличие от корнеплодов свеклы, брюквы и др., у корнеплода моркови боковые корешки располагаются не двумя, а четырьмя продольными рядами.
На поверхности корнеплода находятся глазки («чечевички»), через которые в его ткань поступает воздух, необходимый для внутренних частей корня. Чем плотнее почва и чем более затруднен в нее доступ воздуха, тем сильнее разрастаются чечевички, часто придавая корню уродливый вид, а это снижает качество урожая (Агапов, 1956). Корнеплоды моркови имеют различные типы окраски: белую, белую зеленоголовую, желтую, оранжевую, интенсивно-оранжевую, красно-оранжевую, фиолетовую. Окраска корнеплода зависит от генотипа, возраста растения, факторов внешней среды, характера и количества пигментов (Калачева А.В. с соавт., 2011). По форме корнеплоды могут быть: округлые, овальные, усеченно-конические, цилиндрические, конические и веретеновидные, с вариациями перехода между ними. Максимальная длина товарного корнеплода у разных сортов может достигать от 10 до 30 см, а наибольший диаметр – 3-5 см, иногда до 10 см. Масса товарного корнеплода в оптимальных условиях выращивания колеблется от 100 до 300 г.
В первый год жизни в онтогенезе моркови выделяют следующие фенофазы: 1) прорастание семени появление всходов; 2)образование корневой системы и листьев; 3)формирование корнеплодов. Во второй год жизни – стеблевание, формирование генеративных органов, образование плодов и созревание семян (Агапов, 1956, Галеев Н.А., 1985). Прорастание начинается при температуре 4-100С, оптимальная температура Семена моркови прорастают очень медленно – это зависит от температуры и влажности почвы и обусловлено наличием в них эфирных масел. Всходы появляются на 12-18 сутки. Прорастание семян начинается с поглощения семенем воды и заканчивается образованием у проростка ассимиляционной поверхности. Во время прорастания кроме воды семена поглощают еще кислород. Наибольшее количество минеральных элементов морковь поглощает во вторую половину вегетации (Агапов, 1949; Петриченко, Туркина, 2011).
Рост листовой розетки зависит от сортовых особенностей, метеорологических и почвенных условий. Оптимальная температура для роста листьев 18-22 0С. После появления всходов первый настоящий лист появляется через 10-15 дней. Наиболее развитые листья вырастают в июле-августе, выполняя основную роль в создании урожая. По длине листа и черешка при одинаковых световых условиях можно судить о требовательности различных сортов к интенсивности освещения (Эдельштейн, 1962). Корневая система моркови после прорастания семян быстро развивается и еще до выхода семядолей на поверхность почвы достигает длины 10 см. В фазе семядольных листьев на главном корне образуются 6-9 боковых, длиной 3-8 мм. После появления настоящих листьев первичная кора корешка сбрасывается и заменяется новой – происходит так называемая линька корня. После линьки начинается рост корнеплода. В эту фазу растения испытывают большую потребность во влаге. Недостаток влаги замедляет рост и отрицательно сказывается на дальнейшем формировании корнеплода. На второй год жизни из корнеплода развивается семенное растение. Стебле образование отмечается на 30-35-е сутки после высадки. Семенное растение состоит из многих или нескольких стеблей, имеющих боковые разветвления. Стебли достигают 0,5-1,5 м, иногда могут быть 2,0 м. Рост семенного растения продолжается до окончания цветения. Каждый побег оканчивается соцветием в виде сложного зонтика.
Существует много классификаций семенных растений моркови в зависимости от типа цветения семенного растения. Но наиболее приемлема классификация М. Маргидан (1955), И.А. Прохорова и С.П. Потапова (1973):
1) первый тип - с одним стеблем, на котором образуется 7-8 побегов первого порядка (лидерный тип); побеги первого порядка сконцентрированы в верхней части центрального побега, ветвление доходит до второго, редко до третьего порядка;
2) второй тип - с 4-6 стеблями, один из которых развивается сильнее других (ясно выражена центральная ось); побеги первого порядка сконцентрированы в нижней части центрального побега, развиты слабее и подчинены ему; ветвление доходит до третьего порядка; основная масса зонтиков расположена на побегах первого порядка;
3) третий тип - с 7-18 стеблями одинакового развития, семенники, кроме центрального побега, имеют несколько побегов замещения, образовавшихся из боковых почек головки корнеплода.
Морфобиологическая характеристика семенных растений инбредных потомств моркови столовой
В процессе филогенеза у растений моркови выработана определенная взаимосвязь между признаками, которая характеризует растительный организм как целостную, сбалансированную систему. На наличие корреляционных связей между морфологическими параметрами и семенной продуктивностью растений моркови указывали Литвинова М.К., Федорова М.И., Сазонова Л.В., Жидкова Н.И.
Для создания исходного материала моркови столовой при селекции на гетерозис большое значение имеет изучение морфобиологических параметров семенных растений, оценка их репродуктивной способности, продуктивности и изменчивости основных признаков растений инбредных потомств и комбинаций скрещивания.
Особенно это важно для фертильных линий, которые являются компонентами для комбинаций скрещиваний. Они должны обладать ценными хозяйственными признаками, обильным образованием пыльцы при цветении и устойчивым сохранением фертильности в потомствах. Продуктивность семенных растений различна, особенно инбредных потомств.
Для создания гетерозисного гибрида необходимо получить три константные линии: А – мужски - стерильная (100% ms); В – фер- Морковь тильная (100%mf-закрепитель ms); С – фертильная ms-растение константная линия, которая при скрещивании с линией А обеспечит высокий гетерозис гибрида F1. В связи с этим из всего разнообразия исходного материала необходимо выделить высокоурожайные биотипы (mf) и ms-формы с высокой степенью стерильности.
При создании селекционного материала с признаком mf-растение стерильности представляет научный интерес изучение морфологических параметров семенных растений с различной степенью ЦМС и установление взаимосвязей между стерильным гаметофитом и морфологией семенного растения. Фенотипически стерильность выражается в виде белых, светло-зеленых и зеленых цветков и коричневых пыльников, не содержащих пыльцевых зерен.
Характеристика инбредных потомств с/п Минор. Исследование структуры семенных растений инбредных потомств с/п Минор показало, что одним из наиболее вариабельных признаков является число стеблей (Сv=9-30%). Значительной вариабельностью по данному признаку отличалось потомство № 633(Сv=30 %). Наибольшая выравненность по числу стеблей отмечена в популяции № 242 – Сv=9% растения которой характеризовались многостебельно-стью с числом стеблей 10-12. Высота семенных растений большинства изученных потомств достигала 160 и более см. По высоте семенные растения характеризовались выровненностью (Сv=1-5 %). В инбредных потомствах № 241, № 242 и № 622 высота семенных растений не превышала 160 см. Растения потомства №633 отличались высокой изменчивостью по высоте, которая варьировала от 155 до 170 см. Наименьшая вариабельность отмечена в инбредных потомствах № 241, № 622, №627, № 629, № 242 и № 119 – (Сv=1-2%) (табл. 5, прил. 1).
Большинство растений инбредных потомств с низким процентом стерильности формировали 5-12 стеблей; потомства со степенью стерильности 65-80% отличались большей высотой по сравнению с фертильными потомствами. Высота семенных растений большинства таких потомств достигала 193 см и более. При этом растения потомств первого инбридинга отличались большим числом стеблей, чем растения второго инбридинга (табл. 6).
Среди изученных семенных растений потомств, в которых все растения были стерильны, наблюдалась средняя изменчивость по числу стеблей (Сv=12-29 %). Наибольшей выравненностью по изучаемому признаку обладали растения № 632 - Сv=12% которые формировали 8-11 стеблей; семенные растения № 537-2 формировали от 4 до 7 стеблей. Изменчивость данного признака средняя - Сv=21%. По числу стеблей высокая изменчивость (Сv=29 %) наблюдалась в № 103, семенные растения формировали 4- 8 стеблей. Большая часть (67 %) растений изученных потомств формировали до 7 стеблей (табл. 7, прил. 1). Таблица 6 - Морфобиологические параметры семенных растений стерильных потомств (2014-2017 годы)
По высоте семенные растения полностью стерильных потомств отличались вы-равненностью (Сv=2-3 %). Высота большинства изученных семенных растений достигала 190 и более см. В потомствах № 120 и № 632 высота семенных растений не превышала 190см. Растения в №551-2, № 537-2, № 106, № 120 и № 632 отличались выровненностью по этому признаку. В потомстве № 103 высота растений находилась в пределах 190-200 см при варьировании (Сv=3%) (табл. 7, прил.1).
Характеристика инбредных потомств с/п Марлинка. Среди изученных потомств с/п Марлинка изменчивость по числу стеблей находилась в пределах - 4-14 штук, при Сv=5-23% в зависимости от потомства. Среди стерильных потомств, выравненностью по изучаемому признаку обладали растения потомств № 636 - Сv=5% которые формировали 10-11 стеблей; семенные растения № 131, № 638 отличались малостебельностью и формировали от 4 до 5 стеблей. Изменчивость данного признака средняя - Сv=11% и Сv=16% соответственно. Высокую изменчивость по числу стеблей (Сv=23 %) наблюдали в потомстве № 136, семенные растения формировали 5-8 стеблей. Большая часть растений изученных потомств формировали в среднем 5-6 стеблей. По высоте семенные растения изучаемых потомств в пределах каждого из них были более выровненными (Сv=1-2 %). Высота семенных растений большинства изученных потомств достигала 180 и более см, кроме потомства № 638, высота семенных растений которого не превышала 175 см (табл. 8).
Растения фертильных потомств формировали 5- 16 стеблей, но большинство из них (75%) были многостебельными, при этом изменчивость составила Сv=0-21 %. Значительная вариабельность по данному признаку отмечена в потомстве № 637 (Сv=21 %). Наибольшая выравненность по количеству стеблей отмечена в популяциях № 145 и № 635, растения которых характеризовались многосте-бельностью и формировали 11-12 стеблей (табл. 9).
Высота семенных растений большинства изученных фертильных потомств составляла от 140 до 177 см. По высоте семенных растений изучаемые потомства были более выровнены (Сv=2-6 %). Наибольшая изменчивость по высоте растений отмечена в потомстве №128, которая варьировала от 140 до 175 см. В 70 % инбредных потомств отмечено низкое варьирование по высоте растений (Сv=2%). В потомстве № 644 высота семенных растений не превышала 145 см (табл. 9).
При сравнительной оценке характера проявления признака стерильности в ин-бредных потомствах с различным его проявлением отмечены следующие особенности. В целом в пределах инбредных потомств I1 и I2 частота встречаемости растений с признаком ЦМС сравнима и в среднем составила 52%, при диапазоне варьирования от 20 до 80% в зависимости от потомства (табл. 10).
В потомстве первого инбридинга отмечено формирование большего числа стеблей по сравнению с растениями второго инбридинга. Их число составляло от 5 до 13 стеблей при высокой изменчивости данного признака (Сv=25-57 %). Растения потомств с низкой степенью стерильности в среднем формировали 6-15 штук, потомств с высоким процентом стерильных растений –8 - 13. В потомствах второго инбридинга число стеблей составляло 4-10 штук, при этом 67% семенных растений имели 4-7 стеблей (табл. 10).
Высота семенных растений изученных потомств изменялась в пределах 100 -190 см, а коэффициент варьирования находился в пределах разных потомств - от 3% до 23%. Наиболее выровнены по этому признаку были растения потомства № 649; высокой изменчивостью по высоте (Сv=23%) характеризовались растения потомства № 642. Растения со степенью стерильности 65-80 % отличались большей высотой по сравнению с фертильными растениями (табл.10).
Рис.1. Внешний вид семенных mf- и ms-растений моркови столовой. Сравнение стерильных и фертильных растений разных инбредных потомств показало, что ms-растения формируют преимущественно 4-11 стеблей, в то время как у mf-растений их насчитывается до 15. Стерильные растения почти на 30-40 см выше, чем фертильные, хотя пределы варьирования признака у них шире (рис.1, рис.2).
Изучение взаимозависимостей между признаком ЦМС и параметрами семенного растения показало высокую прямую зависимость (r = 0,91) между степенью стерильности и числом стеблей и обратную – с высотой семенных растений (r = - 0,92). То есть, растения с цитоплазматичекой мужской стерильностью отличаются большей высотой и меньшим числом стеблей по сравнению с mf-растениями. Аналогичную взаимосвязь параметров семенных растений с их стерильностью отмечала в своей работе М.К. Литвинова.
Изменчивость селекционно ценных признаков комбинаций скрещивания инбредных ms x mf форм моркови столовой
Все комбинации скрещивания были выравнены по высоте листовой розетки и длине листовой пластинки (рис.12), при диапазоне варьирования…..(прил. ) По ширине листовой пластины 62% КС были выравнены. Низкой вариабельностью по данному признаку характеризовались потомства (632, 633, 120, 114, 104) – Cv =5-8%. Значительная вариабельность отмечена в потомстве № 106 – Cv=32%, тогда как изменчивость по другим признакам у него средняя (Cv=4-14%). В целом наибольшая выравненность по комплексу признаков листовой розетки отмечена в КС № 633 и № 632 (прил. 1)
В результате исследований установлено, что изменчивость признаков корнеплода в комбинациях скрещиваний в среднем незначительно. Большинство изученных КС характеризовались незначительной изменчивостью длины корнеплода – Cv=3-8%; диаметра головки – Cv=3-6%, диаметру основания – Cv=3-16% и индекса корнеплода - Cv=3-11%. По индексу сбега 77% КС имели среднюю степень вариабельности, а относительно выровненным по данному признаку была КС № 111. По изменчивости массы корнеплода с листовой розеткой большая часть комбинаций скрещиваний характеризовалась низкой вариабельностью, наиболее выравненные – КС № 101, 104, 114 (Cv=4%). Средней степенью изменчивости по данному признаку характеризовались КС №103, 106, 122. Высокой изменчивостью обладала КС № 247 (Сv=23%), масса корнеплода с листовой розеткой которого составила 223 г, при средней массе 206 г по всей совокупности потомств (рис.1).
По массе корнеплода низкой вариабельностью характеризовалось 46% КС с массой корнеплода 159-182 г, при средней массе в с/п Минор 167 г. Средней степенью изменчивости по данному признаку (Cv=11-19%) характеризовались 52% инбредных потомства. Самой высокой изменчивостью обладало потомство № 247 (Сv=24%), средняя масса корнеплода которого составила 188 г (прил.)
Анализ результатов оценки показал, что в целом среди изученных гибридных комбинаций с/п Минор наибольшая выравненность по комплексу селекционных признаков растений отмечена в КС с высокой степенью стерильности, среди которых, как видно из таблицы 22, особо выделяются КС №№ 101, 104, 109, 114, и 632. Большинство КС этой группы характеризовались незначительной изменчивостью доли корнеплода в массе растения – Cv=4-12%, кроме КС № 103 - Cv=30%. Проведенные исследования показали, что изученные комбинации скрещивания с/п Минор отличались высокой сохранностью корнеплодов после хранения. В большинстве потомств этот показатель был 100% (табл. 22), что говорит об устойчивости к болезням хранения, которые характеризуются высокой вредоносностью и могут снижать выход товарной продукции. Такие комбинации представляют интерес для вовлечения в программу скрещивания, так как в их потомстве можно ожидать наличие форм с устойчивостью к болезням хранения.
Корнеплоды в комбинациях скрещиваний были выравнены по окраске. Интенсивно-оранжевой окраской характеризовались КС №104 и №247, при этом корнеплоды отличались гладкой поверхностью.
По вариабельности признака «длина листовой пластинки» только 21% потомств с/п Марлинка обладали низкой изменчивостью, в отличие от комбинаций скрещивания с/п Минор, где все потомства были выровнены по данному признаку. Средняя степень вариации отмечена у 75% потомств. Длина листовой пластинки изменялась от 13,4 до 18,2 см. По числу листьев 33% КС обладали высокой изменчивостью Cv=20-29% и только два потомств были выровнены по данному признаку - № 250 и №133 (прил).
По признаку ширина листовой пластинки, как и по числу листьев, высокой степенью изменчивости характеризовалось 33% изученных КС. Большая их часть (54%) имели среднюю степень изменчивости по данным признакам, в отличие от КС с/п Минор, которые в основном характеризовались выравненностью по ширине листовой пластинки. Низкой степенью изменчивости КС с/п Марлинка по ширине листовой пластинки характеризовались только три КС №133, №636 и №641 (Cv=6-9%).
По длине черешка значительной вариабельностью обладали растения комбинации скрещиваний № 259 и № 140 (Cv=20-22%). Наиболее выровненным по большинству признаков листовой розетки является КС № 636 (прил). Анализ варьирования признаков корнеплода в комбинациях скрещиваний показал, что наиболее стабильными является диаметр головки корнеплода, как и в с/п Минор. При этом размер диаметра головки у 21% потомств находился в пределах значений сортопопуляции, 71% потомств имели меньшие значения признака, чем исходная сортопопуляция; у 8% диаметр головки характеризовался более высокими значениями. По длине корнеплода, как видно из рисунка 2, только 4 % инбредных потомств характеризовалось средней степенью изменчивости, в то время, как у с/п Минор все потомства выровнены по данному параметру. По признаку «диаметр основания» 96% потомств обладали выравненностью (Cv 10%), при этом на уровне сортопопуляции был 21% потомств, а 42% из них имели меньшие значения признака, чем исходная сортопопуляция (прил). Распределение потомств по уровню варьирования индекса сбега в с/п Марлинка отличалось от распределения в с/п Минор, большим числом выровненных КС (54%). по индексу формы. По общей массе растения большинство изученных комбинаций скрещивания – 71%, характеризовались низким коэффициентом варьирования, при диапазоне изменчивости составил 206-305 г. Средняя вариабельность (Cv=10-19%) наблюдалась у 25% потомств с массой 227-298 г (прил). Значительной изменчивостью характеризовалось только потомство № 256 (Сv=26%) со средней массой корнеплода 189 г (прил).
По изменчивости массы корнеплода в комбинациях скрещивания с/п Марлинка, в отличие от КС с/п Минор, выровненных потомств было больше половины и не было потомств с высокой вариабельностью (рис. 13).
В комбинациях скрещиваний с высокой степенью стерильности с/п Марлинка, так же как и в с/п Минор корнеплоды имели окраску от оранжевой до интенсивно-оранжевой. Интенсивно-оранжевой окраской характеризовалось потомство №152, имея при этом гладкую поверхность и 100% сохранность (табл. 22). Следует отметить, что изученные комбинации скрещивания с/п Марлинка характеризовались высокой сохранностью корнеплодов после хранения. Большая часть КС обладала сохранностью на уровне 100%, а два потомства №№138 и 146 – 82-95%. Высокая сохранность является очень важной для корнеплодов моркови, так как после уборки они хранятся в течение длительного времени. Интересно отметить, что корреляционный анализ связей между биометрическими параметрами растений первого года жизни выявил усиление сопряженности между признаками листовой розетки и корнеплода в группе 100% стерильных комбинаций скрещивания, по сравнению с полностью фертильными инбредными потомствами (прил. ). При этом, в этой группе КС с/п Минор в основном увеличивается число тесных положительных взаимосвязей, а в с/п Марлинка - отрицательных. Тем не менее, направленность взаимосвязей между основными параметрами в инбредных потомствах и комбинациях скрещивания каждой сортопопуля-ции сохраняется. Так, масса корнеплода ms- и mf-потомств с/п Минор положительно сопряжена с его толщиной (r= 0,53…0,56 ), а в с/п Марлинка – отрицательно (r= -0,50… -0,71). В свою очередь у диаметра корнеплода (Минор) и длины корнеплода (Марлинка) отмечена положительная взаимосвязь с длиной листовой пластинки (r= 0,55…0,74), поэтому во всех анализируемых группах ms- и mf-растений моркови столовой прослеживается одна общая закономерность - наличие положительной корреляции между массой корнеплода и длиной листовой пластинки (r=0,52…0,78). Остальные выявленные взаимосвязи имеют более выраженную сортовую специфику (прил. ). Наличие большего числа тесных взаимосвязей объясняет большую выравненность ms-растений в комбинациях скрещивания по большинству признаков, по сравнению с mf-растениями инбредных потомств.
Культура микроспор
Влияние фазы развития микроспор на эффективность эмбриогенеза. Одним из важнейших факторов, влияющих на образование эмбриоидов при андрогенезе, является определение оптимальной стадия развития мужского гаметофита для введения в культуру in vitro. Ранее было определено, что индукция андрогенеза у моркови может наблюдаться как на стадии тетрад (Andersen S. et al., 1990), ранней одноядерной (Matsubara S. et al., 1995; Gorecka К. et al., 2010) так и на стадии поздних вакуолизированных микроспор (Тюкавин и др., 1999; Домблидес A., 2001; Gorecka К. et al., 2009). У моркови столовой генеративные органы имеют очень мелкие размеры и идентификация бутонов, содержащих потенциально эмбриогенные микроспоры, является основной проблемой при разработке эффективной технологии получения удвоенных гаплоидов (Шмыкова, 2006; Тюкавин, 2007).
Известно, что на стадию развития будет оказывать влияние не только размер самого бутона, его окраска, степень раскрытия, но и место расположения бутона соцветии и ряду зонтичка (Домблидес A., 2001). При этом, по мере развития соцветия, крайние зонтички в соцветии выдвигаются в стороны, а сам бутон увеличивается в размере, меняет окраску от зеленой до светло зеленой и далее цветок приобретает окраску распустившихся лепестков (рис. 17). Как правило, в суспензии микроспоры моркови, выделенные из одинаковых по расположению и размеру бутонов, находятся на разных стадиях развития с преобладанием какой-то одной.
На донорных растениях сорта Шантенэ, была проведена серия опытов по определению оптимальной стадии развития микроспор и пыльцы для индукции эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор моркови. Донорные растения выращивали в защищенном грунте. Закладку опыта проводили каждые 3 дня.
Бутоны срывали с соцветий первого порядка с одних и тех же трех растений, участвующих в эксперименте, с зонтичков краевых цветков 1-2 ряда. Перед введением в культуру in vitro для определения стадии развития микроспор препараты окрашивали дифференциальным красителем (Alexander, 1969). В результате этого эксперимента было подтверждено, что наибольший выход эмбриоидов наблюдается у растений моркови, находящихся в начале цветения, из бутонов в которых наибольшая часть микроспор находится на поздней одноядерной стадии развития (табл. 26, рис.18). Из бутонов содержащих тетрады и микроспоры на ранней одноядерной стадии развития, а также из бутонов с двухклеточной и зрелой пыльцой эмбриоидов получено не было. Последующие эксперименты на всех образцах проводили, отбирая бутоны только с микроспорами на поздней одноядерной стадии развития.
В процессе эмбриогенеза есть много факторов, отрицательно влияющих на индукцию эмбриогенеза. Неактивными микроспорами выделяются токсические вещества, которые препятствуют эмбриогенному развитию микроспор. Этилен является одним из таких веществ, выделяемых в результате разрушении клеток стенок пыльников при получении суспензии микроспор в культуре in vitro (Johansson, 1983). В последнее время проведено много исследований, направленных на снижение концентрации этилена в питательных средах. С этой целью был использован активированный уголь (АУ) в качестве ингибитора синтеза этилена, что оказало положительное влияние на развитие соматических зародышей масличной пальмы и какао(50 ). При исследовании влияния АУ в составе питательных сред для некоторых видов семейства Brassica было отмечено повышение эффективности эмбриогенеза. Добавление в нижний слой двухслойной питательной среды активированного угля увеличивало частоту образован ия эмбр иоидов у B. na pus (Mathi as, 1988). У р ап са н аличи е в ср еде АУ улучшает регенерацию растений из эмбриоидов, но не повышает эмбриогенез (Gland et al., 1988).
В процессе культивирования органов и тканей моркови выделяются фенольные соединения, являющиеся токсическими веществами, угнетающими рост растения in vitro. Активированный уголь обладает способностью адсорбировать эти соединения (Fridborg et al., 1978), при этом он не обладает избирательным действием и может одновременно адсорбировать некоторые компоненты, необходимые для растений.
При проведении исследований нами было отмечено положительное влияние АУ в питательной среде на образование и развитие эмбриоидов в культуре микроспор моркови. Наилучший результат в этом исследовании был получен при использовании питательной среды № 4, дополненной активированным углем в качестве адсорбента. Эффективность эмбриогенеза при этом возросла до 84 эм-бриоидов на чашку петри.
Нами были цитологически изучены этапы образования эмбриоидов в культуре микроспор моркови (рис. 27).
Первые деления в культуре микроспор моркови под микроскопом были обнаружены уже через 3 дня после начала культивирования, а на 30-45 сутки эм-бриоиды были хорошо видны невооруженным глазом (рис. 19). Было отмечено, что если продолжать культивировать эмбриоиды на питательной среде с 13% сахорозой более 60 суток, то активно начинается процесс образования вторичных эмбриоидов (рис. 20) и в последующем это может привести к ложным результатам по увеличенному количеству образовавшихся эмбриоидов за счет вторичного эмбриогенеза.
Обычно эта проблема носит генотип - специфический характер. В нашем эксперименте, такие растения появлялись в культуре микроспор у сортообразца Шантенэ, где процент альбиносных и частично альбиносных растений составлял около 50%.
Для моркови критическим этапом является адаптация растений-регенерантов, полученных в условиях in vitro к условиям выращивания их in vivo. При переносе растений регенерантов в условия с влажностью, которая меньше чем в культуральном сосуде, растения быстро увядают. Предположительно, это связано с ненормальным функционированием замыкающих клеток устьиц, либо их деформации, а также комплексом метаболических процессов, связанных с водным режимом. При дальнейшем культивировании в условиях in vivo у растений-регенерантов формируются новые листья с устьицами, которые нормально развиты (Huguette et al., 1993). Минимизировать эти потери можно, используя профилактические обработки коммерческим препаратом «Квадрис 250 SC, K.C.», сразу после пересадки и через 2-е суток, затем по мере необходимости. В наших опытах процент гибели растений на этапе адаптации не превышал 20%- 30% в зависимости от образца.
Полученные растения-регенеранты, успешно прошедшие адаптацию, практически все были удвоенными гаплоидами. Это было подтверждено прямым подсчетом числа хромосом в меристематических клетках (рис.24) и с использованием косвенного метода определения плоидности путем подсчета количества хлоро-пластов в замыкающих устьичных клетках (рис. 25).
Часть растений – регенерантов R0 зацветала без прохождения стадии яровизации корнеплодов (рис. 26), основная же часть нуждалась в 2-3 месячной яровизации для успешного получения семян (рис.27).
Влияние генотипа донорного растения и состава питательной среды на эффективность эмбриогенеза в культуре микроспор. Известно, что одними из важнейших факторов, влияющих на эффективность эмбриогенеза является генотип и питательная среда Тюкавин и др., 1999; Gorecka К. et al. 2010; Чистова А.В., 2015). Из 10 изученных в 2017 году сортообразцов на 5 различных питательных средах, нам удалось получить эмбриоиды у 8 сортообразцов (табл. 28). Наибольший выход эмбриоидов наблюдался у селекционного образца 7кт (84 эмбриоида на чашку Петри).
Проведенный двухфакторый дисперсионный анализ (рис.28, табл.29), где генотип и среда являются определяющими факторами, показал, что генотип является главным фактором определяющим образование эмбриоидов из микроспор. В тоже время, совместное действие обоих факторов также определяет количество образовавшихся эмбриоидов.
В результате проведенной работы нами были изучены этапы эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор in vitro, изучены факторы, влияющие на эмбриогенез и получены удвоенные гаплоиды (DH-растения) из 8 сортообраз-цов моркови столовой.
Анализируя отечественный и зарубежный опыт, прослеживается перспективность разработок DH-технологий получения удвоенных гаплоидов у растений моркови столовой через культуру изолированных микроспор in vitro. Внедрение этой технологии позволит ускорить процесс создания конкурентно способных гибридов моркови.