Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Культура пыльников в селекции растений (Литературный обзор) 8
1.1 Метод экспериментального андрогенеза 8
1.2 Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников 9
1.3 Развитие пыльника злаковых 11
1.4 Андрогенез in vitro 13
1.5 Условия успешного культивирования пыльников для получения дигаплоидных линий 13
1.6 Предварительная подготовка пыльников 16
1.7 Среды для культивирования пыльников растений 18
1.8 Выбор и концентрация фитогормонов 19
1.9 Выбор сахаров для приготовления среды 1.10 Культура микроспор 21
1.11 Влияние периодичности пассирования каллусов, размера переносимого на регенерационную среду транспланта 23
1.12 Объем культуральных сред и используемых для культивирования сосудов, эффективность регенерации в культуре тканей риса 24
1.13 Взаимосвязь между морфологическими характеристиками каллусных тканей риса и их способностью регенерировать растения 25
1.14 Разнокачественность индуцируемых каллусов риса 26
1.15 Классификация каллуса риса по морфогенетическому потенциалу 27
1.16 Гистохимический анализ каллуса 29
1.17 Определение полисахаридных комплексов каллуса 30
1.18 Цито-гистологический анализ морфогенеза в культуре пыльников 31
1.19 Генетические факторы, влияющие на эффективность культивирования пыльников
1.19.1 Генотип донорных растений 31
1.19.2 Различия внутри подвидов 31
1.20 Создание сортов с использованием гаплоидной селекции 32
ГЛАВА 2 Методика исследований 35
2.1 Методика культуры пыльников in vitro 35
2.2 Методика определения плоидности растений 38
2.3 Методика приготовления гистологических срезов 39
ГЛАВА 3 Оптимизация условий культивирования пыльников in vitro риса подвида japonika L. (Результаты исследования) 42
3.1 Состав питательных сред и эффективность каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников риса
3.1.1 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях 6-бензиламинопурина (6-БАП)
3.1.2 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях сульфата железа (FeSO47H2O) .
3.1.3 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях -нафтилуксусной кислоты (-НУК)
3.1.4 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях нитрата серебра 52
3.1.5 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях абсцизовой кислоты (AБК) 54
3.2 Каллусогенез и регенерация риса в разных условиях культивирования 58
ГЛАВА 4 Прямая регенерация риса 62
4.1 Состав оптимизированных сред и эффективность их использования в различных комбинациях 71
4.2 Корреляция между результатами каллусогенеза и регенерации . 72
4.3 Выделение гибридных комбинаций с максимальным каллусогенезом 75
4.4 Кластеризация гибридных комбинаций по эффективности каллусообразования и регенерации во всех изучаемых средах 75
ГЛАВА 5 Цитологическое и гистологическое изучение пыльника и каллуса риса 79
5.1 Развитие пыльников риса в культуре in vivo 81
5.2 Изменения тканей стенки пыльника и развитие микроспороцитов in vivo 84
5.3 Развитие микроспор риса в культуре пыльников in vitro 90
5.4 Цито-гистологическое изучение андроклинного каллуса риса 95
ГЛАВА 6 Создание сортов на основе удвоенных гаплоидов риса и их характеристики 105
Заключение 114
Предложения для селекционной практики и производства список сокращений 117
Список литературы
- Предварительная подготовка пыльников
- Методика определения плоидности растений
- Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях сульфата железа (FeSO47H2O)
- Корреляция между результатами каллусогенеза и регенерации
Введение к работе
Актуальность темы. Для решения задачи обеспечения населения нашей страны высококачественной крупой риса и сокращения её импорта необходимо повысить урожайность культуры. Наиболее эффективный и дешевый способ – селекция. Однако, создание новых сортов - длительный процесс, растягивающийся во времени на 10 и более лет. В связи с этим усилия ученых направлены на разработку методов, ускоряющих этот процесс. Одним из них является метод культуры пыльников, позволяющий массово получать гаплоидные растения, сокращать время создания сортов риса, фиксировать рекомбинации. Несколько сортов риса созданы с его использованием, среди них Привольный-4, занявший в 2015 г. по урожайности первое место при испытании в ФГБНУ «ВНИИ риса».
Степень разработанности темы исследований. Базой для проведения теоретических и методологических исследований по совершенствованию технологии получения удвоенных гаплоидов in vitro для использования в селекции риса подвида japonica являлись труды российских и зарубежных ученых: Батыгиной Т.Б. 1987, 1994; Бутенко Р.Г. 1970, 1990, 1999; Давояна Э.И. 1988; Гончаровой Ю.К. 2003, 2005, 2008, 2014 ,2015; Кругловой Н.Н. 2008; Кучеренко Л.А. 1979, 1988, 1991, 1993; Муромцева Г.С. 1990; Ницше В. 1980; Харченко П.Н. 1991, 1993, 1997; Шевелухи В.С. 1996; Abe Т. 1984; Chen, C.C. 1977; Touraev A. 1996, 1997, 2001, 2009; Wang J.J. 1977; Xie J.H. 1995, 1997; Zhuo L.S. 1996; Lantos C. 2006.
Биотехнологический метод культуры пыльников позволяет ускорять селекционный процесс по созданию сортов сельскохозяйственных культур, проводить работы круглый год, экономить площади для выращивания исходного материала, повышать коэффициент размножения растений, снижать стерильность гибридов. Теоретическое обоснование использования научных знаний показывает, что эффективность метода культуры пыльников in vitro зависит от ряда взаимосвязанных условий (генетических, физиологических, внешней
среды, минерального и гормонального состава питательной среды, приемов культивирования). В связи с этим необходимо совершенствование технологий получения в культуре пыльников удвоенных гаплоидов гибридов риса подвида japonica для использования в селекции, что и предопределило выбор темы исследования.
Цель научных исследований - совершенствование метода получения в культуре пыльников удвоенных гаплоидов гибридов риса подвида japonica для использования в селекции.
Задачи исследований:
1. оптимизировать состав питательных сред для культивирования пыльников:
определить концентрации 6-БАП, -НУК, AБК, железа, нитрата серебра, стимулирующие массовый каллусогенез и регенерацию гибридов риса;
2. изучить влияние условий культивирования на каллусогенез и регенерацию;
3. оценить корреляционные связи между результатами каллусогенеза и
регенерацией;
4. выделить гибридные комбинации с максимальным каллусогенезом;
5. провести цито-гистологические исследования пыльников риса: изучить
развитие пыльников риса в культуре in vivo (развитие микроспороцитов
и изменения в тканях стенки пыльника), развитие микроспор риса в
культуре пыльников in vitro. Провести цито-гистологические
исследования андроклинного каллуса риса;
6. создать исходный материал и сорта риса, с применением технологии
культуры пыльников.
Научная новизна. Оптимизирован состав индуцирующих питательных сред для культивирования пыльников, стимулирующих регенерацию растений отечественных сортов и гибридов риса подвида japonica непосредственно на каллусогенной среде, что позволило усовершенствовать технологию получения удвоенных гаплоидов через культуру пыльников. Изучены цитоэмбриологические особенности формирования морфогенных
структур в культуре пыльников риса. Установлено, что у сортов и гибридов
отечественного генофонда процессы морфогенеза идут по пути
гемморизогенеза и формирования вторичных эмбриоидов из клеток каллуса. Впервые показано, что в культуре пыльников отечественных сортов и гибридов риса инициальными клетками андрогенеза являются только микроспоры. Клетки стенки пыльника в условиях in vitro не способны к эмбриогенезу. С использованием метода культуры пыльников созданы исходный материал и сорта риса. Научная новизна работы подтверждена тремя патентами и тремя авторскими свидетельствами на сорта риса (Соната, Ивушка, Привольный–4) и заявкой на новый сорт (Водопад).
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработан состав питательных сред для отечественных сортов и гибридов риса, позволяющий индуцировать морфогенез непосредственно на каллусогенной среде, что дает возможность сократить технологический цикл регенерации гомозиготных растений на 2-3 месяца, по сравнению с классической схемой культуры пыльников. Выделены гибридные комбинации, обеспечивающие максимальную эффективность процесса. Цитологически подтверждено, что при культивировании пыльников риса не происходит соматический эмбриогенез из клеток стенок, что позволяет использовать их культуру как надежный метод для регенерации удвоенных гаплоидов. С использованием разработанных методов создано 4 сорта риса: Соната, Ивушка, Привольный-4 и Водопад.
Методология и методы исследований. Работы велись по
общепринятой методике изолированных клеток и тканей Бутенко Р.Г. (1999). Манипуляции проводили в асептических условиях в боксе, с использованием агаризованных питательных сред Блейдса (Blaydes, 1966) и Murashige and Scoogy (MS, 1962).
Цито-гистологические исследования проводили согласно методикам Паушевой З.П. (1974) и Фурста Т.Г. (1974).
Экспериментальные данные обрабатывались статистическими методами с использованием программ Microsoft Excel, Statistica 6.0.
Константные линии изучали в отделе селекции и лаборатории генетики по полной схеме селекционного процесса в качестве кандидатов в сорта. Исследования проводили на лугово-черноземовидных слабосолонцеватых почвах, на которых находятся экспериментальные участки ФГБНУ «ВНИИ риса».
ФГБНУ «ВНИИ риса» входит в III агроклиматическую зону с умеренно-континентальным климатом. Сумма температур за период вегетации составляет 35670С. За период вегетации выпадает до 343 мм осадков, что составляет 50 % от годовой суммы. Среднемесячная температура воздуха в июле составляет 22,50С. Максимальная температура воздуха доходит до 40-410С.
Основные положения, выносимые на защиту:
- характеристика оптимизированного состава питательной среды для
индуцирования удвоенных гаплоидов в культуре пыльников сортов и гибридов риса;
влияние условий культивирования на каллусогенез и регенерацию;
корреляционная связь между результатами каллусогенеза и регенерацией;
гибридные комбинации с максимальным каллусогенезом;
результаты цитогистологического исследования формирования пыльника
и андроклинного каллуса риса;
- характеристика созданных на основе удвоенных гаплоидов новых сортов
риса.
Степень достоверности результатов исследований. Исследования проведены в период с 2003 по 2015 гг. Результаты экспериментальных исследований и выводы диссертации подтверждаются глубокой проработкой
литературных источников по теме, постановкой необходимого числа лабораторных опытов, наблюдений в течение вегетации. Данные обработаны методами математической статистики с использованием современных компьютерных программ. Идея работы базируется на анализе и обобщении современных фактических результатов известных литературных источников и полученных лично соискателем экспериментальных данных.
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена лично автором. Автор разработал и реализовал схему исследований, выполнил экспериментальную часть работы, статистическую обработку данных, полный цикл биотехнологической и селекционной работы, сформулировал научные выводы, собрал необходимые литературные источники, подготовил к публикации научные работы, диссертацию и автореферат.
Апробация работы и публикации результатов. Основные результаты диссертационной работы рассматривались на заседаниях методической комиссии ФГБНУ «ВНИИ риса» (2003–2015 гг.), также были представлены на: Х Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва 2013 г.; XI Международной научно-методической конференции, «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия культурных растений», Махачкала, 2014; XI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва, Российский университет дружбы народов, 2015 г.; Научно-практической конференции Кубанского отделения ВОГиС «Вклад Вавиловского общества генетиков и селекционеров и инновационное развитие Российской Федерации», Краснодар, КубГАУ, 2015 г.; Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы биотехнологии в растениеводстве», Сочи, 2016 г.; Международном саммите молодых ученых «Современные решения в развитии сельскохозяйственной науки и производства», Краснодар, 2016 г.
По материалам исследований, представленных в диссертации, опубликовано 50 печатных работ, в том числе 5 – в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ (1 публикация - в издании базы цитирования Scopus), получено 3 патента и 3 авторских свидетельства на сорта риса: Соната, Ивушка и Привольный–4.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах, состоит из введения, 6 глав, заключения, предложений для селекционной практики и производства, содержит 26 таблиц, 47 рисунков и 13 приложений. Список литературных источников включает 162 работы, из них 50 иностранных авторов.
Предварительная подготовка пыльников
Важным направлением в современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к заболеваниям, биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды, при сохранении и повышении их продуктивности и качества [100, 101]. Рациональное сочетание методов классической селекции с биотехнологическими методами позволяет решать поставленные задачи за более короткий срок [48, 49, 50, 64, 74].
Культура пыльников используется для получения гаплоидных растений с одинарным набором хромосом из микроспор. После удвоения числа хромосом за 1-2 поколения получаются гомозиготные по всем генам фертильные растения, в то время как при традиционных способах селекции на это затрачивается до 10 лет и более [109].
Этот метод изучен на 427 видах растений, которые принадлежат к 88 родам и 33 семействам. Среди них пшеница, рис, кукуруза, ячмень, люцерна, лен, табак, перец, апельсин, яблоня, виноград и другие культуры [13].
Одной из важнейших задач селекционной работы является получение генетически стабильных линий как исходного материала для создания гибридов F1. Процесс производства константных линий основан на гибридизации с последующим многократным отбором, использованием инфекционно-провокационных фонов, позволяющим оценить материал на устойчивость к стрессовым факторам среды. Этот метод достаточно трудоемок и продолжителен. Кроме того, использование ручного труда, незначительное количество получаемых семян и их высокая стоимость являются большим недостатком [12, 14, 83].
Использование культуры in vitro пыльников один из альтернативных путей индуцирования гаплоидных клеток, тканей и константных растений. Использование гаплоидной технологии дает ряд преимуществ, в частности, позволяет сократить время в создании исходного константного гомозиготного материала и, тем самым, облегчает и ускоряет селекционный процесс [41, 96].
Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников может идти по двум направлениям: прямая регенерация зародышей и косвенная -через каллусогенез. В первом случае внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен формируются проэмбриональные структуры, которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям. Эмбриоиды - зародышеподобные структуры [104]. Во втором – микроспора делится, возникшие в результате этого клетки быстро увеличиваются в размерах и образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения. При этом растения могут иметь разную плоидность - ди-, поли-, гаплоидные. Последние стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы [31, 124].
Пыльцевой эмбриогенез обусловлен функциональной и структурной детерминацией (процессом определения пути развития клеток на основе блокирования отдельных генов) пыльцевого ядра и клеток гаметофита, поэтому в развитии могут принимать участие: вегетативные, генеративные или оба типа клеток, при их слиянии образуется диплоидный эмбриоид. Для пасленовых характерен только эмбриогенез, для злаковых – образование как каллусов, так и эмбриоидов. Среди гаплоидов много альбиносов (особенно у злаков). Наибольший выход регенерантов-альбиносов в культуре пыльников, что вызвано, по-видимому, нарушениями развития пыльцы. Причина не установлена, возможно, это результат мутаций в микроспорах при культивировании [53].
Для культуры пыльников используют целые пыльники, стерильно выделенные из бутонов в определенной фазе развития. Их помещают на твердую питательную среду, либо на поверхность жидкой. В редких случаях культивируют бутоны или соцветия [108, 109].
Методика определения плоидности растений
Китайскими и индийскими учеными проделана работа по созданию метода, позволяющего получить прямую (одноступенчатую) регенерацию из пыльников риса для подвида indica. Однако, процент регенерации очень низок (1,5-2,0 %), при этом 48,0-53,0 % регенерированных растений альбиносы. Для создания одноступенчатой системы регенерации китайские исследователи использовали РАА (фенилуксусную кислоту), которую добавляли в каллусогенную индукционную среду N6 в различных концентрациях [125]. Оптимизация условий культивирования пыльников необходима для повышения эффективности метода андрогенеза и сокращения цикла на 2-3 месяца по созданию удвоенных гаплоидов у гибридов риса подвида japonica, к которому относятся возделываемые в нашем регионе сорта этой культуры. [63, 68, 71]. Оптимизация приведет к качественно новой ответной реакции микроспор, что позволит получать зеленые регенеранты непосредственно на каллусогенной среде [69, 70, 77]. Интенсивность морфогенетических процессов в клеточных культурах может быть увеличена за счет подбора специальных условий. Традиционно для индукции морфогенеза in vitro используются фитогормоны и синтетические регуляторы роста. В некоторых случаях эффективными стимуляторами морфогенеза оказываются вещества негормональной природы или условия культивирования тканей [32, 116]. Это подтверждает концепция в отношении органогенеза, выдвинутая Скугом и Миллером, согласно которой можно получить образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относительное соотношение ауксинов и цитокининов [142]. Но не существует общей формулы в отношении концентрации гормонов, а также других физиологически активных веществ, которые можно было бы применять во всех случаях. Ясно, что создание подходящей концентрации экзогенных гормонов – необходимое условие для получения и каллуса, и регенерации растения в культуре пыльников/микроспор. Установлено, что каллусы риса, полученные из пыльников, обладают наивысшей морфогенной способностью [41, 45].
Для получения регенерантов риса используют 3 типа сред: для индукции дедифференциации и каллусообразования, регенерации, образования и развития корней. Факторами, индуцирующими соматический эмбриогенез, являются фитогормоны.
Создание системы, при которой процессы морфогенеза из пыльников риса будут протекать непосредственно на каллусообразующей среде, дает ряд преимуществ по сравнению с классической схемой андрогенеза:
1) снижение гаметоклональной изменчивости у регенерантов, возникающей при длительном культивировании каллуса [155];
2) повышение регенерации растений, т.к. при длительном культивировании тканей in vitro способность к регенерации растений, как правило, уменьшается. Некоторые авторы связывают это с накоплением мутаций, снижающих жизнеспособность и морфогенетический потенциал клеток [41, 43, 117].
С наибольшей частотой новообразования из микроспор формируются при комбинации фитогормонов и условий культивирования. В исследованиях проводили подбор концентраций и соотношение фитогормонов (ауксинов, цитокининов), дополнительных стимуляторов роста, индуцирующих процессы регенерации на каллусообразующей среде; определяли влияние светового режима (свет, как и физиологически активные вещества -экзогенный фактор, влияющий на переход растительной клетки с одного уровня дифференциации на другой) [28, 65, 72, 78]. 3.1.1 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях 6-бензиламинопурина (6-БАП). Синтетический аналог 6-аминопурина, один из цитокининов, который вызывает синтез РНК и белка у чувствительного к нему объекта. 6-БАП используется при формировании каллусных культур [78]. В исследованиях изучали влияние на каллусогенез и регенерацию у гибридов риса F1 Хазар / Фонтан и ВНИИР7718 / ВНИИР7887 в культуре пыльников in vitro трех концентраций 6-бензиламинопурина (6-БАП) - 2,0; 4,0 и 6,0 мг/л.
Для индукции каллусогенеза из пыльников риса в качестве базовой использовали среду Блейдса 2,0 мг/л 2,4-Д (контроль) и варианты 2,4-Д 0,5 мг/л + 6-БАП в концентрациях - 2,0; 4,0 и 6,0 мг/л. Морфогенные каллусы для регенерации пересаживали на базовую среду МС с 1,0 мг/л -НУК и 5,0 мг/л кинетин.
Двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное влияние генотипа, состава питательной среды и их взаимодействия среда на эффективность культуры пыльников (приложение 1).
При использовании концентрации 6-БАП 2,0 мг/л в комбинации Хазар / Фонтан каллусогенез был недостоверно выше, чем при использовании 4,0 мг/л. Статистическая оценка данных подтвердила высокую способность пыльников формировать каллус и регенерировать растения при концентрации 2,0 и 4,0 мг/л 6-БАП в комбинации Хазар / Фонтан. В комбинации ВНИИР7718 / ВНИИР7887 как каллусогенез, так и регенерацию увеличивала концентрация 2,0 мг/л 6-БАП. Увеличение концентрации 6-БАП в каллусообразующей среде до 6,0 мг/л негативно влияло на индукцию каллуса и регенерацию растений (табл. 1 и 2). На регенерацию это влияние было достоверно для обеих изучаемых комбинаций.
Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях сульфата железа (FeSO47H2O)
В ходе исследований выявлено, что добавление нитрата серебра стимулирует образование каллусов. Использование нитрата серебра в агаризованной среде Блейдса в концентрации 2,0 мг/л позволяет получать в зависимости от генотипа от 7,3 до 25,6 %, а в концентрации 4,0 мг/л - от 9,35 до 20,0 % каллусогенных пыльников, что больше, чем в контроле (6,3-15,6 %) (табл. 9, рис. 5). Введение в среды AgNO3 в концентрации 6,0 мг/л ингибирует развитие вторичных эмбриоидов в каллусах риса. Доля образовавшихся эмбриоидов варьировала от 0,63 % до 1,10 %, что было значительно ниже по сравнению с вариантами сред, содержащими 2,0 и 4,0 мг/л AgNO3 (0,95 - 6,3 % и 1,10 – 3,33 % соответственно). Частота соматического эмбриогенеза в культуре пыльников риса повышалась при добавлении 2,0 и 4,0 мг/л AgNO3. Отсутствие нитрата серебра в контроле также снижало регенерационную способность (0 - 0,65 %).
Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях абсцизовой кислоты (AБК). Абсцизовая кислота ингибирует деление клеток и ростовые процессы. Исследования на различных видах растений показали, что при использовании АБК в сочетании с цитокининами у одних генотипов стимулируется соматический эмбриогенез, а у других – ингибируется [61, 105, 107]. Влияние АБК на каллусогенез и регенерацию гибридов риса изучали в сочетании с ауксином 2,4-Д на 10 гибридах F1: Изумруд / Лиман, ВНИИР7718 / Хазар, ВНИИР7718 / ВНИИР7887, Хазар / Лиман, ВНИИР7877 / ВНИИР7718, Хазар / Изумруд, Фонтан / Хазар, Хазар / ВНИИР 7887, Лиман / Фонтан и Изумруд / Хазар. Для индукции и роста каллуса риса использовали среду Блейдса с 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л АБК и вариант с добавлением 1,0 мг/л 2,4-Д и 2,0 мг/л АБК. Контроль среда Блейдса + 2,0 мг 2,4-Д. Морфогенные каллусы для регенерации пересаживали на среду МС + 1,0 мг/л -НУК + 5,0 мг/л кинетин.
Дисперсионный анализ позволил оценить достоверность влияния генотипа и АБК на каллусогенез и регенерацию гибридов риса. Каллусогенез в рассматриваемых комбинациях имел максимальные значения при концентрации АБК 1,0 мг/л, эта же концентрация была оптимальной для регенерации многих изучаемых гибридов (табл. 10).
В комбинации Лиман / Фонтан разницы влияния на каллусогенез концентраций АБК 1,0 и 2,0 мг/л не обнаружено (20,6 и 20,0 % соответственно). Для комбинации Хазар / Лиман лучше использовать концентрацию 2,0 мг/л. В большинстве же изучаемых образцов каллусогенез имел максимальные значения при концентрации АБК 1,0 мг/л (табл. 11). Таблица 11 - Каллусогенез гибридов риса при введении в ИПС AБК
Максимальная регенерация у большинства генотипов также отмечена при использовании АБК в концентрации 1,0 мг/л. Для некоторых гибридов более высокая регенерация отмечена при 2,0 мг/л: Фонтан / Хазар - 2,40 %, Изумруд / Хазар - 2,95 %, ВНИИР7718 / Хазар - 1,10 %, Лиман / Фонтан -0,55 % (табл. 12). Таблица 12 - Регенерация гибридов риса при введении АБК в ИПС
Влияние условий культивирования на каллусогенез и регенерацию гибридов отечественных сортов риса не изучалось, в зарубежной литературе приводятся противоречивые сведения. В Gorecka и другие указывают [127] на повышение эффективности культуры пыльников при непрерывном культивировании в темноте до образования эмбриоидов по сравнению с рекомендацией Andersen (1990): через 2 недели культивирования в темноте с последующим переносом пыльников на свежую питательную среду и на постоянный свет [114]. Тюкавин Г.Б. [87] также указывает на необходимость темнового периода культивирования.
В экспериментах часть пыльников культивировали при режиме: 12 часов – день, 12 часов – ночь; часть - в темноте в течение 25-30 дней до образования каллусов, затем культивирование каллусов в режиме 12 часов – день, 12 часов – ночь. Пыльники риса инокулировали на среду Блейдса с добавлением 2,0 мг/л 2,4-Д. Морфогенные каллусы для регенерации пересаживали на среду МС + 1,0 мг/л -НУК + 5,0 мг/л кинетин.
Изучение влияния 12–ти часового фотопериода на каллусогенез в 6-ти комбинациях не показало его достоверного влияния для большинства генотипов (табл. 13, рис. 6, приложение 6).
Анализ эффективности каллусогенеза в отдельных комбинациях (табл. 14, рис. 6) показал, что для большинства комбинаций характерно повышение каллусогенеза в темноте, но в отдельных комбинациях более высокий каллусогенез наблюдался на свету. Примером такой комбинации может быть гибрид Хазар/Лиман. Условия культивирования не оказали эффекта на каллусогенез в комбинации Изумруд/Лиман.
Регенерация проходила как в темноте, так и на свету (приложение 6). Таблица 14 - Каллусогенез в гибридных комбинациях при разных условиях культивирования Гибрид F1 Условия культивирования Каллусогенез, % Доверительныйинтервал, %-95,00 % Доверительныйинтервал, %+95,00 % ВНИИР7718 /ВНИИР7887 на свету 28,9 18,4 39,3 без света 41,6 31,2 52,1 ВНИИР7718/Хазар на свету 11,4 0,9 21,8 без света 26,6 16,2 37,1 Изумруд/Лиман на свету 9,3 1,2 19,8 без света 9,4 1Д 19,8 Лиман/Изумруд на свету 5,3 5,2 15,8 без света 15,0 4,5 25,4 Хазар/Лиман на свету 19,0 8,5 29,5 без света 4,9 4,5 15,4 Хазар/Фонтан на свету 20,8 10,3 31,3 без света 33,2 22,8 43,7 НСРо5 5,16 Более детальный анализ показал, что условия культивирования влияют на регенерацию только в комбинации Лиман/Изумруд (рис. 7, табл. 15).
В зависимости от генотипа процессы морфогенеза наблюдались через 40-60 дней культивирования пыльников на ИПС при использовании темнового периода и через 65-80 дней при культивировании в режиме 12 часов-день/12 часов-ночь без предварительного темнового периода. В результате морфогенеза получены эмбриоподобные структуры (вторичные эмбриоиды каллуса) или геммы (почки).
При культивировании пыльников в темноте получено большое количество мелких эмбриоподобных структур, их число быстро увеличивалось при инкубации на свету. Часть эмбриоидов и почек прорастали и регенерировали растения на питательной среде в темноте, но они не образовывали хлорофилла. После того, как пробирки выставляли на свет - регенеранты зеленели.
Корреляция между результатами каллусогенеза и регенерации
В гибридах F1 Шарм х Дулар, Нарцисс х №22 (АСС 6264) шли процессы регенерации растений непосредственно на каллусообразующей среде (приложение 9, варианты №№ 13, 14, 15, 19) соответственно по вариантам: 1,5 и 2,0 %; 2,2 и 3,2 %; 3,4 и 4,0 %; 3,6 и 4,2 % (рис. 9).
Использование более высоких концентраций РАА (4,0; 6,0 и 10,0 мг/л) влекло за собой снижение каллусообразования. На этих вариантах не регенерировано ни одного растения [65].
Недостаток в использовании РАА в сочетании с 2,4-Д заключался в том, что от 23 до 45 % растений имели мутационную леталь – albino.
При изучении влияния комплекса фитогормонов на регенерацию интактных растений на каллусообразующей среде использован ауксин -НУК, цитокинин БАП, абсцизин АБК, а также дополнительный стимулятор роста AgNO3 и удвоенную концентрацию Fe в форме хеллата. Базовая среда – MS. В качестве контроля использована среда MS с 2,0 мг/л 2,4-Д. На каждый вариант среды инокулировано 500 пыльников.
Часть пыльников культивирована с использованием темного периода в термостате до появления каллуса, а затем при фотопериоде 12 часов – день, 12 часов – ночь. Другая часть пыльников сразу была помещена в световой комнате при фотопериоде 12 часов – день, 12 часов – ночь. Процессы морфогенеза наблюдали на каллусообразующей среде при культивировании пыльников с темновым периодом, и без него. Наиболее интенсивно они проходили при сочетаниях и концентрациях гормонов в вариантах питательных сред №№ 21, 22, 23, 29 (приложение 7).
Пыльники, помещенные в термостат, культивировали в темноте при температуре 280С и относительной влажности 50 %. Индукция каллуса происходила на всех изучаемых вариантах сред на 25-30 сутки. Каллусогенез варьировал от 3,3 до 66,6 %, в среднем составил 8,97 %.
Затем каллусы выставляли на свет. На 15-30 день пребывания на свету (40-60 сутки с момента инокуляции пыльников) появлялись побеги. Этот признак варьировал от 0,4 до 13,3 % от числа посаженных пыльников различных генотипов (рис. 10, 11, табл. 17). Таблица 17 – Каллусогенез и прямая регенерация в культуре пыльников гибридов риса in vitro, культивируемых в условиях темнота/свет
В среднем регенерация зеленых растений составила 2,34 %, также отмечено образование корней без побегов. У отдельных генотипов ризогенез имел массовый характер (до 45,0 %).
На вариантах, находящихся 12 часов на свету (5 тыс. люкс) – день/12 часов - ночь и содержащих комплекс фитогормонов, каллус появлялся на 40-45 сутки с момента инокуляции пыльников на ИПС. В основном он был плотный структурированный от белого до светло-желтого цвета. Частота каллусообразования варьировала от 0,6 до 46,7 % в зависимости от генотипа. На 65-80 сутки с момента инокуляции пыльников каллусообразование сопровождалось стеблевым и корневым морфогенезом. Этот показатель составил 0,6–24,0 % от числа инокулированных пыльников (табл. 18, рис. 12).
ВНИИР7718/ВНИИР7887 (регенерация от 11,1 до 24,4 %), также этот гибрид показал хорошие результаты в варианте без нитрата серебра (регенерация -24,0 %). У гибрида ВНИИР7877 / ВНИИР7718 регенерация составила 2,7 % в варианте с повышенным содержанием нитрата серебра и 9,3 % в варианте без нитрата серебра. Некоторые гибриды нуждались в двойной дозе Fe, а также обязательном присутствии AgNO3 (ВНИИР7718/Хазар). У гибридной комбинации Лиман/Хазар не удалось стимулировать регенерацию растений ни в одном варианте сред. Это свидетельствует, что эффективность каллусо-и морфогенеза зависит не только от состава среды, но и в определенной степени от генотипа растений.
Процессы каллусогенеза и прямой регенерации шли на всех вариантах исследуемых сред при разных условиях культивирования, но наиболее сбалансированным оказался состав питательных сред в вариантах 22 и 23, на которых у большинства генотипов процессы морфогенеза завершились развитием полноценных растений. В основном же отзывчивость на различия в концентрациях фитогормонов в ИПС определялась генотипом изучаемого гибрида.
Преимуществом культивирования пыльников сначала в темноте до образования каллуса, а затем на свету заключается в том, что процессы регенерации наступали на 3 недели раньше, чем при культивировании пыльников без темнового варианта.
Методом прямой регенерации получено 119 зеленых растений, которые имели хорошо развитые побеги и корневую систему (рис.13 а, 13 б). Плоидность растений определяли подсчетом хромосом в корешках регенерантов риса с использованием метода давленных препаратов. Часть регенерантов являлись спонтанными удвоенными гаплоидами и имели 24 хромосомы, часть – гаплоидами, их генотип был представлен одним геномом (12 хромосом). Эти растения нуждались в диплоидизации. Для удвоения числа хромосом андрогенных растений использовали метод зачаточных метелок. Зачаточные метелки гаплоидов размером 0,5 – 1,0 см помещали на дедифференцирующую среду Блейдса с 2,0 мг/л 2,4-Д [93]. Полученный каллус пассировали на питательную среду MS с 5,0 мг/л кинетин и 1,0 мг/л -НУК, на которой осуществлялась регенерация удвоенных гаплоидов.
Исходя из полученных результатов исследований, а также выводов, имеющихся в литературе, можно сделать заключение, что дифференциация культивируемых клеток в определенных пределах зависит от экспериментальных условий. Создавая те или иные условия можно наблюдать разные уровни и формы дифференциации. Из гормональных факторов в дифференциации и прямой регенерации растений из пыльников/микроспор риса первостепенная роль отводится ауксинам, цитокининам, их концентрации и соотношению, но определяющую роль играет генотип растения. Данные эксперимента позволяют сделать вывод, что использование сочетания 6-БАП, -НУК, АБК в питательных средах в определенном соотношении положительно влияет на регенерацию зеленых растений на каллусогенной питательной среде без использования регенерационной. Разные генотипы риса требуют индивидуального подхода, необходимы вариации концентраций используемых фитогормонов для каждого конкретного сорта или гибрида.
Для отдельных генотипов разработана система прямой регенерации растений из пыльников риса in vitro за счет комплексного использования фитогормонов ауксин / цитокинин, которая позволит получать необходимые для селекции гомозиготные растения риса на 2-3 месяца быстрее, чем при использовании классической схемы андрогенеза.
На основании проведенных исследований для изучаемых гибридов риса F1 ВНИИР7718/ВНИИР7887, Хазар/Фонтан, Изумруд/Хазар, ВНИИР7877/ ВНИИР7718 и Хазар/Изумруд был разработан оптимизированный состав сред и условия культивирования (табл. 19), которые индуцировали процессы морфогенеза из пыльников с минимальной стадией каллуса без использования регенерационных питательных сред.