Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Теоретические основы использования культуры изолированной ткани в селекции ячменя
1.1 Актуальность и современное состояние проблемы поиска и создания генетических источников устойчивости ячменя к эдафическим стрессовым факторам 13
1.2 Сомаклональная изменчивость как источник генетического разнообразия в селекции растений 19
1.2.1 Природа / механизмы сомаклональной изменчивости 19
1.2.2 Эпимутации в культуре растительных клеток и тканей 22
1.2.3 Практическое применение сомаклональной изменчивости 25
1.2.4 Клеточная селекция растений – инструмент для создания стрессоустойчивых форм 29
1.3 Особенности культивирования каллусной ткани ячменя на селективных средах 35
1.4 Адаптивные реакции растений к основным стрессорам в условиях токсичности кислых почв
1.4.1 Почвенная токсичность алюминия и механизмы адаптации к ней у растений 41
1.4.2 Чувствительность и стратегии адаптации растений к токсичности тяжелых металлов 51
1.4.3 Особенности повреждающего действия засухи (осмотического стресса) на растения 61
Глава 2 Объекты и методы исследований
2.1 Объекты исследования 66
2.2 Условия культивирования растений in vitro 67
2.3 Условия проведения селекции в каллусных культурах 69
2.4. Методы исследования каллусных и растительных тканей 70
2.5 Оценка семенного потомства регенерантных растений 73
2.6 Статистическая обработка данных 77
Глава 3 Методология проведения клеточной селекции на устойчивость к ионной токсичности
3.1 Подбор исходных генотипов для введения в каллусную культуру 78
3.2 Создание селективных систем для отбора форм, устойчивых к токсичности алюминия 81
3.3 Генотипические особенности адаптации каллусных культур к алюмокислым условиям 93
3.4 Создание селективных систем для отбора форм, устойчивых к токсичности кадмия и марганца 98
3.5 Создание селективных систем для отбора форм, устойчивых к комплексному действию ионов алюминия, кадмия и марганца 109
3.6 Морфотопографический способ оценки устойчивости растений ячменя к ионной токсичности металлов 113
Глава 4 Методология проведения клеточной селекции на комплексную устойчивость к ионной токсичности металлов и засухе
4.1 Создание селективных систем in vitro с осмотическим стрессом 120
4.2 Разработка условий отбора in vitro каллусных культур, устойчивых к алюминию и водному дефициту 123
4.3 Оценка эффективности схем отбора каллусных культур с устойчивостью к комплексному воздействию токсичности металлов и водного дефицита 127
Глава 5 Разработка способов регуляции морфогенеза в каллусной культуре ячменя
5.1 Участие абсцизовой кислоты в повышении устойчивости каллусных культур к абиотическим стрессорам 131
5.2 Регуляция морфогенеза путем создания in vitro микробно растительных систем 142
Глава 6 Физиолого-биохимическая оценка регенерантных линий ячменя
6.1 Влияние условий культивирования каллусной ткани на селективных средах на биохимические и физиологические показатели растений-регенерантов 147
6.2 Изменение биологического состояния клеточного состава каллусной ткани ячменя в результате культивирования в алюмокислых условиях in vitro 156
Глава 7 Генотипическая вариабельность семенного потомства растений-регенерантов в условиях in vivo
7.1 Роль факторов отбора in vitro на формирование адаптивных реакций растений-регенерантов
7.1.1 Средообразующая активность корневой системы регенерантов в условиях токсичности алюминия 161
7.1.2 Влияние исходного генотипа на продуктивность семенного потомства регенерантных линий 177
7.1.3 Влияние условий культивирования каллусной ткани на формирование хозяйственно-ценных признаков регенерантов 178
7.2 Проявление неспецифической устойчивости в потомстве растений регенерантов 181
7.3 Результаты клеточной селекции ячменя на устойчивость к токсичности алюминия и засухе 196
Заключение 204
Список литературы 210
Приложения 258
- Актуальность и современное состояние проблемы поиска и создания генетических источников устойчивости ячменя к эдафическим стрессовым факторам
- Создание селективных систем для отбора форм, устойчивых к токсичности алюминия
- Влияние условий культивирования каллусной ткани на селективных средах на биохимические и физиологические показатели растений-регенерантов
- Результаты клеточной селекции ячменя на устойчивость к токсичности алюминия и засухе
Актуальность и современное состояние проблемы поиска и создания генетических источников устойчивости ячменя к эдафическим стрессовым факторам
Среди различных факторов окружающей среды, снижающих продуктивность сельскохозяйственных культур во всём мире, наиболее значимым является низкое плодородие кислых почв (Климашевский, 1991; Foy et al., 1996a, 1996b; Oettler et al., 2000; Barcelу, Poschenrieder, 2002; Kochian et al., 2002, 2005). В настоящее время по разным оценкам от 40 до 70% мирового фонда пахотных земель (3950 млн га) имеют кислую реакцию, из которых только 15% используются под посевы сельскохозяйственных культур (Добровольский, Урусевская, 2004; Доклад…, 2011). В Европе общая площадь кислых почв составляет 391 млн. га, из них на долю подзолистых и дерново-подзолистых почв приходится 146 и 75 млн га, соответственно (Лисицын, 2012). Несмотря на широкие масштабы известкования распространение кислых почв на планете увеличивается, что обусловлено, прежде всего, влиянием антропогенных факторов (ежегодное отчуждение из почвы большого количества оснований по причине интенсификации сельскохозяйственного производства, кислотные атмосферные выпадения и т.д.) (Особенности известкования…, 2014; Eswaran et al., 1997).
На территории России площадь, занятая кислыми почвами, исчисляется десятками миллионов гектаров, в т.ч. в Нечерноземной зоне достигает 40 млн га, составляя около 80% от общей площади пашни (Родина, 2006; Неттевич, 2008; Баталова, 2012), что приводит к ежегодному недобору урожая зерновых культур в объеме 16-18 млн т (Жученко, 1998, 2001, 2009; Доклад…, 2011).
По мнению многих авторов, низкое плодородие кислых почв обусловлено, как правило, сочетанием целого комплекса неблагоприятных факторов, таких как токсичность ионов водорода, дефицит или недоступность важных для растения элементов - фосфора, кальция, магния и молибдена.
Однако основная причина снижения урожайности культур связана с высоким количеством подвижного алюминия (А13+) (Авдонин, 1976; Климашевский, 1991; Головко и др., 2004; Неттевич и др., 2001; Родина, 2006; Eswaran et al., 1997; Matsumoto, 2000; Oettler et al., 2000; Samac, Tesfaye, 2003). Токсичность алюминия усиливается на слабо гумусированных подзолистых и дерново-подзолистых почвах, характерных для северо-восточной части России, где содержание подвижных форм А13+ может колебаться от 6,4 до 12,5% (от 3 до 20 мг на 100 г почвы). В пересчете на количество в пахотном слое 1 га алюминий составляет 130-250 т, т.е. во много раз больше чем N, P, K и других питательных элементов. Присутствие в почве алюминия в дозе 7-8 мг на 100 г почвы снижает урожайность на 20-50%. Кроме того, токсичности алюминия в кислых почвах сопутствует и токсичность марганца (Косарева и др., 1998; Особенности…, 2014; Шихова, Егошина, 2004; Небольсин, Небольсина, 2005; Zhang et al., 1999).
В настоящее время серьёзной проблемой современного аграрного производства является загрязнение тяжелыми металлами (ТМ) почв, используемых для производства растениеводческой продукции. Кадмий является одним из самых высокоопасных поллютантов, способных накапливаться в растениях даже при низких концентрациях иона в почвенном растворе. По данным Россельхознадзора в результате обследования 14257,7 тыс. га пахотных угодий на предмет выявления загрязнения почв солями кадмия, выявлено 27,7 тыс. га с содержанием кадмий выше ПДК. Зоны, в которых содержание тяжелых металлов в почвах сельскохозяйственных угодий в десятки и сотни раз превышают ПДК, отмечаются в Кемеровской, Белгородской, Челябинской, Московской, Смоленской, Тульской и Брянской областях (Проблемы ..., 2008; Широких и др., 2018). Наряду с технологическими выбросами, в почвы агроценозов кадмий поступает в результате широкого использования удобрений на основе фосфатов, содержащих этот элемент в виде естественной примеси в количествах от 2 до 200 мг/кг (Khan et al., 2017; Rizwan et al., 2016; Szolnoki et al., 2013).
Наибольший уровень кадмия наблюдается в подзолистых и дерново-подзолистых почвах: 0,7-1,31 мг/кг и выше (Серегин, Иванов, 2001; Ендовицкий и др., 2008; Nagajyoti et al., 2010).
Помимо ионной токсичности кислых почв существенной причиной потери сельскохозяйственной продукции является неблагоприятное воздействие на развитие растений и производство семян засухи, высокой солености воды и экстремальных температур. Недостаток воды наносит растениеводству больший урон, чем все остальные стрессовые факторы, взятые в совокупности (Шевелуха, 2003). Во всем мире возрос спрос на засухо- и солеустойчивые культуры. Европейская часть России считается зоной рискованного земледелия с недостаточными или неравномерными режимами осадков. Отмечен дефицит атмосферных осадков на 80% пахотных земель (Доклад…, 2013). В частности, в Волго-Вятском регионе отклонение от среднегодовой нормы достигает 3-5 кратной величины. Засухи, участившиеся последние 15 лет (Неттевич, 2008) и совпадающие с критическими фазами в развитии растений особенно негативно влияют на урожайность ячменя, имеющего слабое развитие корневой системы. Наличие токсичного алюминия в почве задерживает рост и проникновение корней в глубину, что снижает сопротивляемость растений к засухе, особенно в условиях дефицита осадков. В результате происходит недостаточное использование питательных веществ из подпахотного слоя, приводящее к потерям урожая до 85% (Климашевский, 1991, 1995).
У многих видов растений обнаружена естественная генетически обусловленная толерантность к алюминию, в т.ч. у основных зерновых культур (Климашевский, 1988; Пухальская, 2005; Яковлева, Капешинский, 2012; Aniol, Gustafson, 1984; Culvenor et al., 1986; Foy, 199b; Ishikawa et al., 2000; Li et al., 2009; Samac, Tesfaye, 2003; Abate et al., 2013).
Ячмень является широко распространенной и востребованной культурой в сельскохозяйственном производстве. Среди значимых зерновых культур устойчивость к алюминию увеличивается в ряду ячмень – пшеница – овес – тритикале – рожь (Djalovic, et al, 2010). Относительно высокая чувствительность ячменя к почвенным стрессорам, прежде всего, обусловлена слаборазвитой корневой системой при низкой способности к хелатообразованию (Косарева, 2012). Например, при повышении содержания подвижного алюминия на 1 мг/100 г почвы урожайность ячменя может снижаться до 4,7% (Юлушев, 1999). Повышение кислотоустойчивости вновь создаваемых сортов является основным резервом роста продуктивности ячменя (Родина, 1995, 2004; Косарева И.А., Семенова Е.В., 2005). В современном сельском хозяйстве повышение стрессоустойчивости сельскохозяйственных культур достигается сочетанием различных подходов. Наиболее дешевым и экологически чистым методом является селекция, которая обеспечивает повышение урожайности на фоне эдафического стресса при минимальных экономических и энергетических затратах (Родина, 2006; Баталова, 2013). Методами традиционной селекции (гибридизация и отбор) создаются пластичные сорта, обладающие повышенной устойчивостью к какому-либо стрессовому фактору. Преимущество гибридизации состоит в целенаправленном синтезе желательных для селекции свойств с использованием разнообразных компонентов. Гибридизация существенно расширяет творческие возможности отбора, благодаря возникающим перекомбинациям генов и трансгрессиям (Заушинцена, 2009).
За рубежом работы по созданию сортов зерновых культур, толерантных к кислотности почв и содержанию подвижного алюминия, проводят с середины прошлого столетия. Известно о внедрении в производство алюмотолерантных сортов ячменя, пшеницы, тритикале, сорго и риса (Essen еt al., 1962; Foy, 1996a,b; Muyaan et al., 1991; Tsvеtkov еt al., 1994; Lonkipoundis, 1995). Среди них сложный гибрид ячменя ХХХIV, устойчивый к алюминию на кислых почвах (Reid еt al., 1971). В России селекция ярового ячменя на устойчивость к кислотности почв ведется в Красноярском НИИСХ, Московском НИИСХ «Немчиновка» и других научных учреждениях. В настоящее время выявлены источники алюмо- и кислотоустойчивости среди отечественных сортов ячменя: Беркут, Вакула, Сибиряк (Яковлева и др., 2009), Московский 121, Полярный 14, Винер, Джин, Джюгяй, Абава, Pirkka, Jo 1389, Jo 1209, FaustI, Potra, Скиф, Prestige (Яковлева, Капешинский, 2012). Для расширения генетического разнообразия в качестве источников алюмоустойчивости используются дикие виды ячменя, в частности H. spontaneum C. Koch. (Рыбалка и др., 2009).
Во Всероссийском институте генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова (ВИР) издан каталог сортов ячменя, прошедших лабораторную оценку на устойчивость к ионам алюминия и марганца (Каталог…, 1999; Методические указания…, 2012).
В ФГБНУ ФАНЦ Северо-Востока с 1984 года ведутся успешные исследования по созданию сортов озимой ржи (Кедрова, 2000) и овса (Баталова, 2013), толерантных к повышенному содержанию ионов водорода и алюминия. Созданы алюмоустойчивые сорта ячменя: Добрый, Новичок, Лель, Тандем (Родина, 2006; Щенникова, 2016).
Проблеме и изучению засухоустойчивости растений в мировой научной литературе посвящено множество публикаций, защищено более 2800 патентов. В российских научно-исследовательских центрах созданы сорта ячменя, сочетающие засухоустойчивость с хорошей урожайностью: Наран (Бурятский НИИСХ), Красноярский 80, Кедр, Вулкан (Красноярский НИИСХ), Ача (СибНИИРС), Омский 80, Омский 85, Омский 86, Омский 88 (СибНИИСХ), Тандем, Родник Прикамья (ФАНЦ Северо-Востока), Леон, Заветный, Приазовский 9, Зерноградский 244 и Сокол («АНЦ «Донской»).
Создание селективных систем для отбора форм, устойчивых к токсичности алюминия
Изолированные клетки обладают высокой чувствительностью к алюминию, что объясняется тесным контактом между клетками и средой выращивания. Другое объяснение этого явления - высокая метаболическая активность клеточной культуры, находящейся в стадии активного роста и деления. Исследования подтверждают, что ответные реакции на воздействие алюминия целого растения и клеточной культуры могут не совпадать (Taylor, 1991,1995; Rincon, Gonzales, 1992; Ryan et al., 1993).
Основной трудностью при работе с алюминием в культуре in vitro является двойственная природа этого элемента. Она приводит к неясностям в определении его первичных токсических форм. Разработка новых сред с разной концентрацией фитотоксичных ионов для культуры клеток представляет определенные трудности, поскольку селективные ионы металлов способны взаимодействовать с другими ионами с образованием нерастворимых осадков. Образование комплексов ЕДТА с микроэлементами, входящих в состав питательных сред, может понизить концентрацию Cu, Fe, Mn, Zn. Существует опасность отбора in vitro преимущественно по устойчивости к недостатку микроэлементов, а не токсичности алюминия. Некоторые авторы (Koyama et al., 1990) считают, что если алюминий добавляется в культуральную среду, содержащую неорганический фосфат, то первичным селективным фактором, действующим в данном случае, служит скорее отсутствие растворимого фосфора, чем прямая токсичность алюминия.
Образование растворимых комплексов алюминий-фосфор в создании дефицита фосфора или уменьшение токсичности алюминия, связанное со снижением активности ионов при добавлении их в агаровую среду, могут значительно снизить фактические концентрации селективных ионов, по сравнению с первоначально добавленными в среды. Также необходимо учитывать токсическое действие ионов водорода в среде. Серьёзной проблемой остается поддержание постоянного уровня стресса в культуральных условиях по времени. Трудно определить основной стрессовый фактор в данном эксперименте. (Foy et al., 1996а; Пухальская, 2005; Лисицын, 2007).
В настоящее время удалось получить устойчивые к ионной токсичности алюминия растения-регенеранты злаков ячменя, озимой ржи, овса, пшеницы, риса, сорго, а также некоторых кормовых культур (Мазин и др., 1994; Зобова, 2007; Шуплецова, 2003; Широких и др., 2009; Виноградова, 2010; Foy et al., 1993; Foy, 1996а, 1996б; Shuman et al., 1993; Jan et al., 1997; Bonell, Lassaga, 2002; Muyuan et al., 2003). Однако, по-прежнему остается актуальной задача изучения взаимодействия генотипа и условий культивирования in vitro. До сих пор не решены проблемы, связанные с низким уровнем морфогенеза и коротким периодом компетенции каллусных клеток на селективных средах.
Для любого токсиканта в рамках клеточной селекции необходимо определить оптимальную стратегию применения, обеспечивающие приемлемые для отбора in vitro показатели выживаемости ( 40%) и регенерации каллуса ( 10%). С целью эффективного проведения клеточной селекции каллусных линий ячменя с устойчивостью к токсическому действию ионов водорода и алюминия выявляли оптимальные селективные условия/факторы: концентрацию токсичных ионов, кратность (количество) и последовательность селективных воздействий, а также оптимальный для селективного воздействия этап развития каллусной ткани. Определение рабочих концентраций селективных агентов
Изучали реакцию каллусной ткани ячменя при внесении в селективные среды ионов Al3+ и Н+ на этапах индукции первичного каллуса (среда MS 1), пролиферации каллусной массы - (среда MS 2) и морфогенеза (среда MS 3).
Индукция каллуса на селективных средах MS 1. Попытки получить каллус при эксплантировании зародышей на жесткие селективные среды с кислотностью рН 3,5-3,0 оказались неудачными. В этих условиях происходил полный некроз зародышей. Внесение в среду алюминия усиливало жесткость селективного давления. Путем эмпирического отбора выявлен приемлемый уровень стресса для получения морфогенного каллуса (89,4 %): рН 4,5 и Al3+ 20 мг/л. На фоне этих селективных условий в среде MS 1 индуцировали каллусную ткань 16 генотипов. Образование первичного каллуса (средние значения) практически не отличалась от контрольной среды (90,9%). Однако, выживаемость 3-х недельного каллуса составила в среднем 9,27%, тогда как в контрольных условиях была почти в 2,5 раза выше (22,1%). Частота регенерации выживших каллусов достигала 13,95% и, практически, не отличались от контрольного варианта (13,10%) (рисунок 3.1).
Внесение селективных ионов на этапе пролиферации каллуса (MS 2). Создание стрессовых условий на среде при наличии индуцированной ранее калусной биомассы существенно повысило порог чувствительности каллуса. Практический интерес представляло детальное изучение влияние кислотности среды на развитие каллусной ткани. Исследования проводили на этом же наборе генотипов, что и в предыдущем исследовании. Среднее значение выживаемости каллусных линий на контрольной среде с рН 6,0 составило 89,3% при частоте регенерации 28,2%. При снижении рН до 3,7 ед. и ниже в присутствии 20-40 мг/л ионов Аl3+ гибель каллусной ткани достигала 100% (рисунок 3.2). Оптимальным уровнем кислотности среды для проведения отбора устойчивых каллусных культур являлось значение рН 3,8-4,0, при котором выживало от 20 до 57,4 % каллусных линий (в зависимости от концентрации в среде ионов Аl3+), из них 24,7-50 % были способны к морфогенезу. В условиях кислотности среды 4,5 ед. рН выживаемость каллуса достигала 37,2 - 65,2%, однако регенерационный потенциал снижался относительно предыдущего варианта, что привело к снижению эффективности клеточной селекции в этих условиях.
Для более детального изучения реакции каллусной ткани на стресс оценивали параметры развития каллусных культур на селективной среде с ионами Аl3+ в диапазоне 0 - 42 мг/л при выявленном ранее оптимальном уровне кислотности (рН 3,8-4,0). В исследовании использовали шесть генотипов ячменя с различным уровнем алюмоустойчивости в полевых условиях. Согласно построенным графикам (рисунок 3.3) в отсутствие алюминия выживаемость каллуса всех генотипов варьировала незначительно (63 - 71%). Внесение в среды ионов Аl3+ приводило к волнообразному снижению выживаемости по сравнению с контролем, несмотря на генотипические различия. Кривые, отражающие зависимость роста каллуса от концентрации в среде токсиканта, во всех случаях имели конфигурацию, близкую к синусоидальной. При невысоких (10-20 мг/л) дозах ионов Al3+ в среде у генотипов Keystone457-69 и 1357-80SV66905 наблюдали стимуляцию выживаемости каллуса в 1,6-1,9 раза по сравнению с контролем. При повышении селективной нагрузки прослеживалась общая тенденция к снижению доли выжившего каллуса. Для клеток большинства генотипов летальная доза ионов алюминия составила 40-42 мг/л. Доза ионов Аl3+, при которой отмечали 50%-ную гибель каллуса, варьировалаот 0 до 36 мг/л. Каллусные линии алюмоустойчивого in vivo генотипа Keystone457-69 выживали при селективной нагрузке 36 мг/л Al3+. У генотипов 1357-80SV66905, SV66905Икар (алюмоустойчивые) отмечена 50%-ная гибель клеток при 20-24 мг/л Al3+. А у алюмочувствительных генотипов VallettaLulu, LuluConrad и Выбор, даже в контрольных условиях, погибало более половины каллусной ткани. Таким образом, наблюдали совпадение реакции на стресс условий in vivo / in vitro.
Влияние условий культивирования каллусной ткани на селективных средах на биохимические и физиологические показатели растений-регенерантов
Нарушение обмена веществ растений в условиях абиотического стресса, прежде всего ионной токсичности алюминия, тесно связано с избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК) растениями, в т. ч. супероксидным (О2-) и гидроксильным (ОН-) радикалами и перекисью водорода (Н2О2) (Guo et al., 2007). Для уменьшения окислительного повреждения биомолекул, инициированных АФК, у растений разработана комплексная антиоксидантная система защиты, в т. ч. синтез антиоксидантных ферментов, такие как супероксиддисмутаза и пероксидаза, которые восстанавливают активные формы кислорода (АФК) и продукты окислительного метаболизма (Веселов, 2001; Бараненко, 2006; Колупаев и др., 2011; Гарифзянов и др.,2011; Чжан и др., 2008; Ezaki et al., 1996; 2000). Активное участие в антиоксидантной защите принимают низкомолекулярные антиоксиданты, прежде всего представители растительных пигментов -антоцианы из группы флавоноидов и каротиноиды (Запрометов, 1993; Капитанов, Пименов, 1996). По накоплению в листьях каротиноидов и антоцианов возможно оценить антиоксидантный потенциал растений (Креславский и др., 2012).
Образование и аккумуляция в большом количестве пероксида водорода приводит к ряду физиологических эффектов: клеточной гибели при гиперчувствительном ответе; формированию системной приобретенной устойчивости; закрытию устьичных щелей; образованию окислительных сшивок между белками и другими полимерами растительных клеточных стенок, а также лигнификации, в результате чего, повышаются их барьерные свойства (Vranova et al., 2002).
При продолжительном воздействии стресса антиоксидантные системы растений перестают справляться с возрастающим уровнем АФК, что может приводить к серьёзным нарушениям клеточного метаболизма: фотоокислению хлорофилла (Ohki, 1986; Чжан и др., 2008), перекисному окислению липидов (Blokhina et al., 2003), утечке ионов, деградации белков (Heath, 1987). Можно предположить, что генотипы с различной устойчивостью к селективным факторам имеют различный уровень антиоксидантной защиты и, соответственно, испытывают различное воздействие окислительного стресса, вызванного условиями культивирования.
Проводили биохимические исследования на базе лаборатории биомониторинга Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Изучали влияние селективных условий отбора in vitro на биохимические показатели, тестирующие степень проявления окислительного стресса в сочетании с продуктивными признаками растений-регенерантов в поколениях R1-R3. Регенерантные линии, индуцированные различными по устойчивости к стрессу генотипами, 999-93 (неустойчивый) и 917-01 (устойчивый, дважды прошедший отбор in vitro), получены на селективных средах с последовательным внесением ионов Al3+ и ПЭГ. Контрольным вариантом служили регенерантные линии тех же генотипов, но полученные на средах без селективного фактора.
Оценивали степень окислительных повреждений по содержанию в листьях малонового диальдегида (МДА), который является промежуточным продуктом окислительной деградации липидов и служит индикатором интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ). Выявлено, что интенсивность ПОЛ у регенерантов ячменя в результате отбора в селективных условиях может изменяться различным образом, в зависимости от исходного генотипа. У чувствительного к алюмокислому стрессу сорта 999-93 содержание МДА было в 1,8 раза выше, а у толерантного сорта 917-01, наоборот, в 2 раза ниже, чем в листьях растений-регенерантов, полученных в обычных условиях (рисунок 6.1 А).
Индикатором окислительного стресса у растений может служить также накопление в тканях антоцианов - пигментов группы флавоноидов, играющих роль низкомолекулярных антиоксидантов. В результате отбора каллусных линий в селективных условиях содержание антоцианов в листьях растений-регенерантов, индуцированных сортом 999-93 было в 1,4 раза выше, а сортом 917-01, напротив, в 1,9 раза ниже, чем содержание антоцианов в листьях растений-регенерантов, полученных в контрольных условиях (рисунок 6.1 В).
О различиях в барьерных функциях мембран между растениями-регенерантами, полученными в контрольных и селективных условиях, судили на основании определения величины выхода электролитов из ткани листа. Регенерантные линии, подвергнутые на этапе каллуса селективным воздействиям, характеризовались в сравнении с контрольными регенерантами в 1,2 - 1,6 раза большими значениями выхода электролитов (рисунок 6.1 Б), что указывает на повышенную метаболическую активность их клеток в стрессовых условиях.
Сравнительная оценка растений-регенерантов по содержанию в листьях фотосинтетических пигментов выявила у растений, прошедших in vitro отбор на устойчивость к токсичности алюминия и осмотическому стрессу, более высокое содержание хлорофиллов (а и б) и каротиноидов, чем у растений-регенерантов, не подвергнутых селективным воздействиям на этапе каллусной ткани (таблица 6.2).
Доля каротиноидов от суммы пигментов у растений-регенерантов, полученных в селективных условиях, также увеличилась на 2,5-3,7%. Значительное (более чем в два раза) превышение над контролем по содержанию каждого из пластидных пигментов, отмечено у регенерантов, индуцированных чувствительным сортом 999-93. У регенерантов, индуцированных толерантным генотипом 917-01, увеличение содержания каротиноидов (на 34%), хлорофилла б (на 36,6%), хлорофилла а (на 8,7% к контролю) в результате отборов в селективных условиях оценивали, в большинстве случаев, как недостоверное (рисунок 6.2). Несмотря на это, скорость фотосинтеза у них возросла в два раза, тогда как у регенерантов, полученных от сорта 999-93, уровень ассимиляции СО2 повысился в результате отборов каллусных линий только на 26,5% по сравнению с растениями, регенерированными в обычных условиях (рисунок 6.3 А). В целом, полученные в селективных условиях растения-регенеранты, отличались более высоким уровнем ассимиляции СО2 (3,86±0,36 и 6,8±0,46 мкмоль СО2/кв.мс), чем растения, регенерированные в обычных условиях (3,05±0,3 и 3,1±0,24 мкмоль СО2/кв.мс).
Изучение процессов СО2/Н2О - газообмена растений позволило выявить существенные различия между подвергнутыми селективным воздействиям в каллусной культуре и контрольными растениями-регенерантами также по показателям водного обмена. Устьичная проводимость паров воды (данные не приведены) и интенсивность транспирации у регенерантов 999-93 в результате проведения отборов в каллусной культуре не изменились, а у регенерантов 917-01 – возросли на 17,5 и 61% соответственно по сравнению с контрольными растениями (рисунок 6.3 Б). Эффективность использования воды листьями растений-регенерантов, полученных при отборе в селективных условиях (3,21±0,40 и 3,87±0,26 мкмоль СО2/ ммоль Н2О), была на 24-30% выше, чем ЭИВ листьями растений, регенерированных из каллусов, не подвергнутых селективным воздействиям (рисунок 6.3 В).
Наряду с различиями в биохимических и физиологических показателях у растений-регенерантов ячменя выявлены различия в продуктивных признаках. Так, растения-регенеранты из селективных условий характеризовались по сравнению с контролем на 8-10% меньшей высотой, но на 14,5-31,3% большими значениями общей и на 72-77% продуктивной кустистости (таблица 6.4). Число зёрен и масса зерна с растения у регенерантов, полученных в селективных условиях оказались также выше, чем в контроле. Достоверно (на 46% по сравнению с контролем) возросла семенная продуктивность растений-регенерантов, индуцированных толерантным генотипом 917-01.
Таким образом, растения-регененеранты ячменя, прошедшие на этапе каллусной ткани отбор в селективных системах по устойчивости к комплексному абиотическому стрессу - действию алюминия и водному дефициту, имели явное преимущество перед контрольными регенерантными линиями по содержанию фотосинтетических пигментов в листьях, скорости фотосинтеза, эффективности использования воды листьями и общей продуктивности растений. У регенерантных форм, прошедших отбор на селективных средах, проявление симптомов окислительного стресса, тестируемого по интенсивности ПОЛ, выходу электролитов и накоплению в листьях антоцианов, ниже, чем у контрольных растений-регенерантов. Кроме того, симптомы окислительного стресса, вызванного селективными условиями, у растений-регенерантов, инициированных чувствительным сортом 999-93 были выражены в большей степени, чем у растений регенерантов, полученных от толерантного сорта 917-01. Это свидетельствует о целесообразности использования повторного введения в каллусную культуру регенерантных форм ячменя, ранее полученных в селективных условиях. В целом, использование селективных систем с алюминием и ПЭГ для отбора устойчивых к комплексному стрессу генотипов ячменя, позволило одновременно улучшить существующие формы по ряду других показателей интенсивности фотосинтеза, эффективности водного обмена и продуктивности растений.
Результаты клеточной селекции ячменя на устойчивость к токсичности алюминия и засухе
В настоящее время селекционеры ФГБНУ ФАНЦ НИИСХ Северо-Востока располагают достаточным количеством семенного материала ячменя регенерантного происхождения. На базе лаборатории селекции и семеноводства ячменя семенное потомство регенерантных линий (R2- R7 поколение) тестировали в полевых условиях (2000 – 2016 гг.) по стандартной схеме селекционного процесса в сравнении с исходным генотипом и стандартными сортами на различных по стрессовой нагрузке почвенных фонах. Результаты экспериментов носили неоднозначный характер. Сложность работы заключалась в том, что регенеранты зачастую, обладали низкой продуктивностью при высоком уровне адаптационного потенциала. Однако, многие регенерантные линии положительно оценены в лабораторных и вегетационных опытах и среди них выявлены перспективные генотипы для создания сортов, толерантных к эдафическому стрессу.
В результате изучения структурных и физиологических показателей растений ячменя отмечено, что все регенерантные сорта, превосходящие стандарт по урожайности, имели более высокую продуктивную кустистость (в среднем, выше стандарта на 29-67,5 %) и более плотный колос (выше стандарта на 4,5-6,6 %) (таблица В.4, приложение В). Кроме того, регенерантные растения превосходили сорт-стандарт по таким физиологически обусловленным признакам как устойчивость к полеганию, выживаемость и всхожесть. Генотипы, с высоким уровнем этих признаков, в условиях алюмокислого стресса вегетационных опытов проявляли ярко выраженную средообразующую активность корневой системы (линии 917-01 и 496-07). Вместе с тем, отмечена тенденция к снижению (до 15 %) высоты растений регенерантных линий по сравнению со стандартом.
В результате полевых испытаний на кислых дерново-подзолистых почвах отобраны генотипы регенерантного происхождения, стабильно обеспечивающие на 10,0-43,2% более высокую урожайность, чем стандартный сорт, как на благоприятных, так и кислых почвенных фонах (таблица 7.12). По результатам многолетних испытаний эти же генотипы входили в число лучших сортов конкурсных сортоиспытаний, таким образом, представляя перспективу для дальнейшей селекционной работы.
Однако, существенное преимущество регенерантных линий в сравнении со стандартным сортом Биос 1 и исходными генотипами наблюдали, в большинстве случаев в условиях эдафического стресса, например, на провокационном по кислотности фоне (рН 4,2) в условиях аномально жаркого (температурный режим в июле на 5,20С выше нормы) и засушливого (количество осадков за июль составляло 11% от климатической нормы) 2010 года.
В некоторых случаях селекционную ценность представляли несколько регенерантных линий, инициированных одним исходным сортом. Например, генотип 552-98 являлся исходным для пяти регенерантных линий, 999-93 – для 3 линий. Перспективно вовлечение в селекционный процесс «двойных» и «тройных» регенерантов, неоднократно прошедших через отбор в культуре in vitro (через каллусную культуру), например, регенерантные линии от 530-98.
Особый интерес представлял генотип 496-07. В среднем за три (2010-2012) года урожайность 496-07 в конкурсных сортоиспытаниях превысила стандарт Биос 1 на 36% (на 1,72 т/га), что обеспечивалось более высокой продуктивной кустистостью (на 28% выше стандарта) и озерненностью колоса (на 10% выше стандарта) (Щенникова и др., 2013б). На основе регенерантных линий 917-01 и 496-07, созданных путем клеточной селекции и последующего отбора в полевых испытаниях, получены новые сорта ячменя Форвард и Бионик (приложение Г).
Одиннадцать регенерантных линий ячменя с устойчивостью к токсичности алюминия и/или к засухе, включены в коллекцию ФГБНУ ВНИИР им. Н.И. Вавилова (ВИР) в качестве генетических источников толерантности к засухе и повышенному содержанию в почве ионов водорода и алюминия (таблица 7.14).
Регенерантные линии представляют практический интерес как для создания новых сортов непосредственно из регенерантов, так и для их использования в качестве компонентов для скрещивания (таблица 7.15). В настоящее время на всех этапах селекционного процесса изучаются генотипы ячменя, в родословной которых присутствуют регенеранты.
За годы исследований в культуру in vitro введено более 100 генотипов ячменя. На селективных средах получено более полутора тысяч каллусных линий, из которых регенерировано более тысячи регенерантных растений, семенное потомство которых послужило исходным материалом (легло в основу) создания стрессоустойчивых генотипов. Результаты оценки регенерантных линий не всегда носили положительный характер. Это касается регененерантных генотипов, индуцированных алюмоустойчивыми сортами ячменя. Реальный практический интерес представляют применение клеточной селекции по отношению к чувствительным и среднеустойчивым к стрессу сортам. В настоящий момент получено четыре алюмоустойчивых сорта (два из них запатентованы) и более десяти генетических источников стрессоустойчивости (таблица 7.18).
На сортоучастках страны уровень плодородия и агротехники возделывания в несколько раз выше, чем на обычных сельскохозяйственных участках, для которых и создаются кислотоустойчивые сорта. В результате выделяются генотипы с высоким уровнем урожайности, но требующие соответствующего агрофона для его реализации. А генотипы с высокими адаптационными свойствами проигрывают в этом соревновании и выбывают на первых его этапах (Щенникова, 2016). Поэтому необходимо создавать оптимальные условия для объективной оценки регенерантных генотипов, что позволит обеспечить сельскохозяйственное производство сортами, пригодными для успешного возделывания в условиях кислых дерново-подзолистых почв северо-востока Нечерноземной зоны.