Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современные аспекты селекции и биотехнологии представителей рода pelargonium. получение удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской (pelargonium grandiflorum (andrews) willd)
1.1. Морфологические особенности представителей рода Pelargonium 11
1.2 Основные представители рода Pelargonium 13
1.3 Отношение к факторам окружающей среды 21
1.4 Селекции пеларгонии королевской 22
1.5 Использование методов культуры in vitro органов и тканей для селекционно-генетических целей представителей рода Pelargonium 26
1.6 Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур 33
1.7 Влияние ряда факторов на андрогенез in vitro 38
ГЛАВА 2 Условия проведения исследований, исходный материал, схемы и методики проведения опытов
2.1 Цель, задачи и схема исследований 49
2.1.1 Схема исследований 50
2.2 Материал и методика проведения исследований 56
2.2.1 Материал исследований 56
2.3 Условия проведения исследований
2.3.1 Почвенные и агрохимические условия проведения исследований 59
2.3.2 Условия выращивания донорных растений 60
2.4 Методы исследований 63
2.4.1 Методика лабораторных опытов 63
2.4.2 Оценка растений-регенерантов 66
2.4.3 Математическая обработка экспериментальных данных 72
ГЛАВА 3 Разработка элементов технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской в культуре микроспор
3.1 Оптимизация режимов стерилизации первичных эксплантов для введения в культуру in vitro 70
3.2 Влияние температуры на эмбриоидогенез в культуре микроспор.. 73
3.3 Определение стадии развития микроспоры в зависимости от длины бутона 77
3.4 Изучение влияния стадии развития микроспор на интенсивность эмбриоидогенеза 81
3.5 Изучение влияния аскорбиновой кислоты на ингибирование фе-нольных соединений в условиях in vitro 84
3.6 Влияние питательной среды на эмбриоидогенез и каллусогенез пеларгонии королевской в культуре микроспор 88
3.7 Влияние регуляторов роста на эмбриоидо- и каллусогенез пеларгонии королевской в культуре микроспор 90
3.8 Влияние сахарозы на эмбриоидо- и каллусогенез пеларгонии королевской в культуре микроспор 97
3.9 Изучение регенерационной активности каллусных тканей пеларгонии королевской, полученных в культуре микроспор 98
3.10 Клональное размножение и получение растений-регенерантов 103
3.11 Укоренение побегов 104
3.12 Адаптация растений-регенерантов 105
ГЛАВА 4 Оценка растений-регенерантов пеларгонии 108 королевской, полученных в культуре микроспор
4.1 Определение плоидности растений-регенерантов пеларгонии королевской числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и 108 по количеству хромосом
4.2 Характеристика удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской по морфологическим признакам 112
4.3 ПЦР – анализ растений-регенерантов 116
ГЛАВА 5 Технологический регламент и экономическая эффективность получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевский
5.1 Особенности технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской с использованием культуры микроспор 118
5.2 Расчет экономической эффективности технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской 123
Заключение
Выводы
Рекомендации селекционной практике
Список использованных источников
- Отношение к факторам окружающей среды
- Материал и методика проведения исследований
- Влияние питательной среды на эмбриоидогенез и каллусогенез пеларгонии королевской в культуре микроспор
- Характеристика удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской по морфологическим признакам
Введение к работе
Актуальность темы. Представители рода Pelargonium L’Her относятся к одной из самых распространенных цветочных культур. Отсутствие проблем с размножением и нетребовательность к условиям выращивания достаточно быстро сделали ее одним из самых любимых комнатных растений. Сегодня тысячи высокодекоративных сортов пеларгоний (зональных, крупноцветковых, плющелистных, душистых, уникумов, и ангелов) используются в озеленении городов всего мира (Гутиева Н.М., 2011).
Пеларгония королевская (Pelargonium grandiflorum (Andrews) Willd.)
является важнейшей горшечной цветочной культурой в России, на нее
приходится более 15 % рынка декоративных растений (Широкова Н.В., 2006). В этот вид растений входят самые эффектные и изысканные сорта, которые обладают мощным, но не обязательно высоким «кустом» с прямыми, ровными побегами, крупными зазубренными складчатыми листьями и огромными цветками, достигающими размера до 7 см. Окраска яркая, двухцветная или пятнистая (Эсер М., 2003). Пеларгония королевская представлена в основном сортами немецкой и голландской селекции (Гутиева Н.М., 2014).
В нашей стране опубликовано несколько монографий (Эсер М., 2003; Клименко З.К., 2003; Широкова Н.В., 2006) по культуре представителей рода Pelargonium. В основном в них затрагиваются вопросы ассортимента и агротехнических приемов выращивания различных групп пеларгоний в условиях закрытого грунта (Гутиева Н.М., 2010). В последние годы появились публикации (Гутиева Р.М., 2010; 2011; 2014) о начале селекционных работ по созданию гибридов пеларгонии королевской для открытого грунта с целью озеленения садов и парков Черноморского побережья. Таким образом, отсутствие сортов отечественной селекции подтверждает актуальность селекционных исследований данной культуры.
Для получения новых конкурентоспособных отечественных сортов с высокими декоративными качествами, а также устойчивыми к болезням и вредителям необходимо создание нового исходного материала. Использование биотехнологических подходов в селекции пеларгонии королевской позволит значительно уменьшить затраты времени и средств на выведение новых сортов и изменить акценты в селекционном процессе.
К наиболее перспективным методам ускорения селекционного процесса
относится метод гаплоидии, интерес к которому все более возрастает в
последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков
выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих
современным требованиям производства (ВанУнкан Н.Ю., 2014). Применение
гаплоидов в селекции позволяет быстрее найти нужную комбинацию,
обнаружить рецессивные мутации, и как следствие выявить ценные признаки, создавать стабильные гомозиготные линии (Касаева К.А., 1988), для получения которых традиционными методами гибридизации и отбора требуется длительный инбридинг (Lespinasse Y., 1980). С помощью культуры пыльников и микроспор (андрогенез in vitro) от гибридных растений первого поколения, можно получать гомозиготные растения в первой генерации и, таким образом,
сократить селекционный процесс на 3-4 генерации, необходимые для обычной схемы селекции (ВанУнкан Н.Ю., 2014). Мутации, возникающие на уровне гаплоидов - быстродоступны для отбора и диагностики (Поляков А.В. и др., 2007). Полученные удвоенные гаплоиды можно использовать непосредственно для создания сортов, либо в качестве исходного материала для последующей селекции путем вовлечения их в скрещивания.
Однако, несмотря на перспективы метода гаплоидии, использование его на представителях рода Pelargonium достаточно ограничено. Работы по культуре пыльников пеларгонии проводятся в Германии, Польше, Китае, Японии и других странах, но достигнутые результаты весьма ограничены: только у отдельных генотипов получены с небольшой частотой андрогенные новообразования – каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и побеги-регенеранты, среди которых обнаружены удвоенные гаплоиды (AboEl-Nil M.M., 1976; 1983; 1979; Becker Zens R., 1996; Tuleja М., 2014). Это связано с тем, что в настоящее время не достаточно эффективно разработана система получения гаплоидов при культивировании пыльников и микроспор, не решены проблемы состава питательных сред и регуляторов роста для данной культуры, регенерации и других факторов, влияющих на процесс культивирования пыльников и микроспор in vitro (AboEl-Nil M. M.,1976; 1983; 1979; Becker Zens R., 1996; Tuleja М., 2014; Mithila J., 2001; Wojtania A., 2004; Acharjee S., 2012). Недостаточно изученными являются вопросы, связанные с индукцией первичных андрогенных образований (каллусов, эмбриоидов), а также прямого и непрямого эмбриоидогенеза M.M., 1973; Bennici A., 1968; 1974; Li M., 2005; Tuleja М., 2014).
Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований является
разработка технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии
королевской в культуре микроспор для последующего использования в селекционном процессе.
Задачи исследований:
-
Выявить сорта пеларгонии королевской, наиболее подходящие для использования в культуре микроспор.
-
Изучить факторы, влияющие на культивирование микроспор in vitro и получение удвоенных гаплоидов.
-
Изучить особенности морфогенеза в культуре микроспор на питательных средах различного состава и установить оптимальные концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции этого процесса.
-
Получить и оценить растения-регенеранты.
-
Разработать лабораторный технологический регламент получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор пеларгонии королевской. Научная новизна работы. Впервые в России разработана технология,
позволяющая получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды пеларгонии королевской в культуре микроспор. В результате проведённых исследований оптимизированы факторы, влияющие на культивирование микроспор пеларгонии королевской in vitro:
установлена оптимальная длина бутона пеларгонии королевской - 10 мм, содержащая невакуолизированные микроспоры, обладающие морфогенетической активностью;
установлено, что для индукции андрогенеза в культуре пыльников и микроспор пеларгонии королевской не требуется воздействия шоковыми температурами, что позволяет исключить из технологии предварительное выдерживания пыльников при шоковых температурах;
определена оптимальная питательная среда MS, содержащая сахарозу — 120 г/л, аскорбиновую кислоту — 100 мг/л, агар - 5 г/л для эмбриоидогенеза микроспор пеларгонии королевской in vitro;
установлены оптимальные концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции прямого эмбриоидогенеза [0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [4 мг/л BAP + 0,3 мг/л НУК] и непрямого эмбриоидогенеза [2 мг/л BAP + 0,1 мг/л НУК].
Проведена оценка с помощью RAPD-анализа полученных растений-регенерантов, в результате которой установлена их генетическая гетерогенность в сравнении с исходными сортами. С помощью цитологического анализа доказана гаплоидная природа растений-регенерантов пеларгонии королевской, полученных в культуре микроспор. Получены гаплоиды и удвоенные гаплоиды.
Практическая ценность.
-
Разработана технология получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской, которая может быть применена и к другим представителям рода Pelargonium.
-
Элементы технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской в части получения маточных растений и клонального микроразмножения ценного селекционного материала используются в работе тепличного комбината ООО «ПО Егорьевское».
-
Получены удвоенные гаплоиды пеларгонии королевской сортов Лотос, Шоко, Петтикот, которые могут быть использованы в селекционном процессе данной культуры.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации доложены на VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 2-5 октября 2012 г.); XI Международной научно-практической конференции «Становление современной науки -2015» (г. Прага. Чехия, 20-30 сентября 2015 г.).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Определение оптимальной длины бутона, содержащую
невакуолизированные микроспоры;
-
обоснование необходимости предварительного выдерживания пыльников при пониженных и повышенных температурах;
-
разработка состава питательных сред и оптимальных концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции прямого и непрямого эмбриоидо- и каллусогенеза;
-
сорта пеларгонии королевской, характеризующиеся высоким андрогенным потенциалом in vitro;
-
растения-регенеранты (R1) пеларгонии королевской, полученные на основе удвоенных гаплоидов, характеризующиеся высокой выравненностью по декоративным и хозяйственно-ценным признакам.
Публикации результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 23 рисунками и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, приложения и списка использованных источников, содержащего 269 наименований, в том числе 168 иностранных авторов.
Отношение к факторам окружающей среды
Род пеларгонии весьма гетерогенен: в нем встречаются растения, значительно отличающиеся по внешнему виду, условиям обитания, декоративным качествам [20].
В Европу пеларгония впервые была привезена в конце XVI века и считалась редким аристократическим растением. Но с середины XIX века этот цветок приобрел большую популярность и широкое распространение. Садоводы и любители из завезенных пеларгоний и появившихся при культивировании естественных гибридов и мутантных форм отбирали наиболее декоративные виды с яркими цветами и листьями [28].
Пеларгония зональная (P. zonale (L.) L HR.). Пеларгония зональная наиболее широко распространена, ее сорта наиболее многочисленны - этих растений описано свыше 75 тысяч. В культуре пеларгония зональная с 1710 года это гибридная форма. Селекция была направлена на создание более низкорослых форм с крупными соцветиями, и подобные сорта появились в 1844 г. По высоте их делят на растения нормального размера (более 20 см), карликовые (12,5-20 см), миниатюрные (10-12,5 см в высоту) и микроминиатюрные (не более 10 см). Зональные пеларгонии отличаются большим разнообразием формы отдельного цветка, и по этому признаку тоже происходит деление на классы. Эти растения могут иметь простые цветки (не более 5 лепестков), полумахровые (6-8 лепестков), махровые (более 8 лепестков, без скрученной серединки), розовидные (махровые, напоминающие по форме бутон розы), тюльпановидные, кактусовидные, звездчатые и т.д. [265]. Основной отличительной особенностью растений данной группы является наличие на листьях темной полосы, расположение, размеры и окраска которой могут в значительной мере варьироваться, образуя регулярную и нерегулярную, или корончатую зоны.
По окраске листьев пеларгонии делят на следующие группы: bicolor (двухцветные) - листья различных оттенков зеленого цвета с белым или кремовым краем; tricolor (трехцветные) - на листьях наблюдаются сочетания зеленых, желтых и красных тонов; bronze - листья зеленые или желто-зеленые c явным красновато-коричневым оттенком; gold — золотистые листья с явной бронзовой или каштановой центральной зоной, зеленые тона составляют не более 50% и четко отделены от золотисто-желтых; black — листья почти черные или пурпурно-черные с отчетливой большой зоной или центром и слегка маркированы по краю зеленым; butterfly — на листовой пластинке вдоль жилок формируется маркировка в форме стилизованной бабочки, либо другого тона, либо другого цвета [130,222].
Основой для получения практически всех сортов данной группы было растение Пеларгонии зональной - P. zonale. Это вечнозеленый полукустарник, до 30-40 см высотой. Стебель зеленый, плотный, сочный, довольно хрупкий, в нижней части одревесневающий, хорошо облиственный. Листья черешковые, округлые, многолопастные, по краю слабо-дольчатые, опушены в разной степени. На листьях с верхней стороны довольно ясно выделяются концентрические круги переходных цветов - от ярко- до темно-зеленого. Часто имеются коричневые или палевые ободки. Диаметр листа 7-10 см. Цветки до 4 см в диаметре, простые, полумахровые и махровые, разнообразной окраски, представлены практически все тона, за исключением голубого и ярко-желтого. Цветки имеют слабый приятный аромат. Соцветия на длинных цветоносах зонтиковидные, диаметром до 15-20 см, у сортов имеющее эффектное букетное строение. Цветки в зонтике начинают раскрываться от центра.
Растения обладают фитонцидными свойствами, листья имеют своеобраз ный аромат [42]. В народной медицине пеларгония зональная применяется при ожогах, экземе, обморожениях, педикулезе и грибковых заболеваниях кожи, бронхите, ожирении и целлюлите и т.д. [19,130,222]. Такой широкий спектр фармакологической активности делает растение перспективным для более широкого использования [12], т.к. все растение содержит дубильные вещества (максимум в фазе бутонизации). Листья и цветки содержат углево ды (глюкоза, сахароза, рибоза, крахмал и др.), витамины, фенолкарбоновые кислоты, их производные, эллаготаннины, флавоноиды (авикулярин, изокверцетин, рутин, геранин, кверцетин и др.) и их производные, а также эфирное масло, пигменты, кумарины (7-гидроксикумаринн, 8 гидроксикумарин) [24,60]. Эфирное масло применяется для повышения умственной и физической активности, для восстановления психологической гармонии, уравновешивания эмоций, а также в мыловарении и парфюмерной промышленности. В лечебных целях используют листья и корни пеларгонии [12,222].
Пеларгония плющелистная (P. peltatum (Efeu-Pelargonie) (L.) L HR.). Происходит из прибрежных районов Южной Африки. Одна из наиболее популярных балконных ампельных культур. Отличается длительным периодом цветения и неприхотливостью. Растение со стелящимися декоративно-лиственными побегами (до 90 см длиной) и соцветиями розовых или красных тонов. Встречаются также почти белые и двухцветные пеларгонии плюще-листные. Период цветения в течение всего лета и начала осени [269].
Листья у растений этой группы мясистые, кожистые, блестящие (с воско-видным налетом), на длинных черешках, напоминают листья плюща обыкновенного. В пределах группы отмечается значительное разнообразие листьев, у некоторых сортов они очень жесткие и толстые, у других нежные тонкие. Большинство сортов представляют типичные трейлинги - с простертыми или ниспадающими побегами. Среди них встречаются растения с простыми и махровыми цветками. Исходный вид - Пеларгония плющелистная (P. peltatum) - травянистое растение от 40 до 150 см высотой. Стебли стелющиеся. Листья щитовидные, почти округлые, пятиугольные, 5-8 см в диаметре, гладкие, глянцевые, иногда тонко опушенные. Окраска темно-зеленая, изредка с красноватой каймой [197].
Благодаря сильно ветвящимся стеблям из щитовидных пеларгоний создают каскады с многочисленными соцветиями-зонтиками, расположенными на длинных (около 15-18 см) вертикальных цветоносах. Цветки простые или махровые, до 4 см в диаметре, белые, розовые, красные, сиреневые, с пурпурными жилками на двух верхних лепестках. Цветки собраны по 5-8 штук в малоцветкаовые щитковидные или зонтиковидные соцветия.
Сорта и гибриды пеларгонии плющелистной в культуре с 1701 г. Это самые лучшие пеларгонии для подвесных корзин, особенно в районах с сырым, прохладным климатом. Их толстые кожистые листья обеспечивают устойчивость к различным заболеваниям [12].
Пеларгония душистая (P. graveolens L Her). Пеларгония душистая, или сильнопахнущая, - более крупное растение (около 70-100 см в высоту), с разрезными на 5-7 частей листьями, каждая из которых также имеет рассечения, имеющими ощутимый аромат лимона. Растение многолетнее с сильно-разветвленным светло-зеленым стеблем. Листья зеленые, пальчато-лопастные, с неровными волнистыми лопастями; все растение - с легким опушением. Цветки лиловато-розовые, мелкие, собранные в многцветковые зонтиковидные соцветия. Листья и стебли содержат алкалоиды, придающие растению специфический запах [106,145,250].
Материал и методика проведения исследований
Исследования проводили на сортах пеларгонии королевской Шоко, Лотос, Петтикот, Априкотт. Опыты закладывали в трехкратной повторности.
Сравнение регенерационной активности пыльников пеларгонии королевской на питательной среде MS с различным сочетанием и концентрацией регуляторов роста. Нами была использована питательная среда с минеральной основой MS [211] и различными сочетаниями регуляторов роста, подобранными по литературным данным разных авторов.
В качестве эксплантов использовали пыльники и микроспоры пеларгонии королевской. При следующем пассаже (через три недели культивирования) пыльники с эмбриоидами и/или каллусом переносили на свежую питательную среду того же состава. Учет результатов проводили через каждые 14 суток культивирования.
При исследовании влияния температуры на эмбриоидогенез пеларгонии королевской в культуре микроспор использовали бутоны длиной 5-15 мм, изолированные с двухмесячных растений. Проводили ступенчатую стерилизацию эксплантов: бутоны выдерживали в течение 30 секунд в 70%-ном растворе этанола, 10 минут — в водном растворе 1% гипохлорита кальция, затем промывали в стерильной воде три раза по 3 минуты. Стерильные бутоны помещали в чашки Петри на безгормональную среду МS. Согласно схеме опыта, часть чашек ставили в холодильник, где выдерживали при температуре +40С 24 и 48 часов, другие помещали в термостат, где выдерживали при температуре +320С 24 и 48 часов. В качестве контроля был использован вариант, при котором бутоны выдерживали при комнатной температуре (200С) в течение 1 суток. После предобработки из бутонов выделяли пыльники, затем их механически измельчали с помощью скальпеля в жидкой питательной среде МS в чашке Петри. В течение десяти минут содержимое чашки дважды перемешивали при помощи препаровальной иглы или пинцета для более эффективного перехода микроспор из пыльника в питательную среду [35,44]. Затем суспензию микроспор помещали на среду МS, содержащую регуляторы роста в концентрации BAP – 4 мг/л и NAA— 0,3 мг/л, а также сахарозу в концентрации 120 г/л и агар — 5 г/л (рН=5,8). Микроспоры первые двое суток выдерживали в темноте, затем культивировали при температуре 250С и 16-тичасовом фотопериоде. Через каждые семь суток отмечали гибель или дальнейшее развитие эксплантов.
Определение зависимости стадии развития микроспоры от длинны бутона. Для определения зависимости стадии развития микроспоры от длины бутона использовали бутоны размером от 5 до 15 мм. Из бутонов извлекали пыльники, а затем механическим методом из них выделяли микроспоры. Далее производили определение стадии развития микроспор и подсчёт микроспор используя камеру Горяева. Метод количественного учёта с помощью счётных камер может быть использован для относительно крупных объектов, микроскопируемых при объективе 8 – 40x. Каплю взвеси микроспор в питательной среде наносили на сетку камеры и сверху накрывали чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна быть равномерно распределена, не выступая в желобок между стенками. Камеру с исследуемым материалом помещали на предметный столик микроскопа и мик-роскопировали. Подсчитывали количество микроспор в пяти больших квадратах камеры Горяева (т.е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывали все клетки, размещённые внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Вычисляли среднее количество клеток в одном квадратике. Пересчёт на 1 мл производили по формуле: лт а-\000-К N = h-S где N - число клеток в 1 мл суспензии; а - среднее число клеток в малом квадрате; h - глубина камеры, мм; S - площадь малого квадрата, мм2 (1/400 мм2); К - разведение исходной суспензии; 1000 - коэффициент пересчёта мм3 в мл (1 мл = 1000 мм3) [25].
Изучение влияния стадии развития микроспор на интенсивность эм-бриоидогенеза. В качестве эксплантов использовались микроспоры, выделенные из пыльников бутона пеларгонии королевской размером от 5 до 15 мм [101]. Простерилизованные бутоны помещали в стерильные чашки Петри, у бутона скальпелем срезали базальную часть (одна треть длинны бутона). Из бутона извлекали пыльники, которые помещали в жидкую питательную среду MS, содержащую 120 г/л сахарозы, рН=5,8. В питательной среде каждый пыльник разрезали на три части. В течение 10 минут большая часть микроспор выходила в питательную среду. С помощью микропипетки на 0,005 мл жидкую питательную среду с микроспорами дорожками переносили на ага-ризованную питательную среду в чашки Петри. Плотность суспензии микроспор составляла 45 000-50 000 штук в одном мл питательной среды [44,95].
Изучение влияния аскорбиновой кислоты на ингибирование фе-нольных соединений в условиях in vitro. Пыльники и микроспоры сортов Шоко и Петтикот помещали на среду MS с регуляторами роста BAP (2,0 мг/л) и NAA (0,1мг/л), агар -7 г/л, рН=5,8 с добавлением аскорбиновой кислоты (АК) в концентрации: 50, 100, 250 и 500 мг/л. Контролем служила среда без АК. АК вводили в среду после автоклавирования в асептических условиях с помощью стерильных фильтров марки Millex - GS с размером спор 0,22 мкм.
Влияние питательной среды на эмбриоидогенез и каллусогенез пеларгонии королевской в культуре микроспор
Цитологический анализ путей развития микроспор в культивируемых пыльниках показал, что значительная часть микроспор уже на 3 сутки культивирования переключала свой путь развития с гаметофитного на спо-рофитный. При этом были определены следующие варианты развития: - около 70% микроспор претерпевали аномальное симметричное митоти-ческое деление с формированием сначала двуклеточной (на 3-и сутки), и многоклеточной структуры (на 12-е сутки), образование которых связано с параллельным или произвольным положением веретена деления относительно оболочки микроспоры; - около 25% микроспор делилось с образованием двуядерных (на 3-и сутки) и многоядерных (на 6-е сутки) клеток, и далее (на 9-е сутки) - многоклеточных структур (единые клеточные группировки, располагающиеся в пределах растянувшейся оболочки микроспоры), которые к 15-тым суткам имели тройственное происхождение. Дальнейшее развитие таких многоклеточных структур в зависимости от гормонального состава питательной среды было связано с формированием эм-бриоидов (на 21-е сутки) или каллусов (на 28-е сутки); - около 5% микроспор in vitro проходили асимметричное митотическое деление с образованием генеративной и вегетативной клеток (на 3-и сутки) по гаметофитному пути с образованием двуклеточных пыльцевых зерен и останавливались в своем развитии.
По нашему мнению такое разнообразие путей развития микроспор в культивируемых пыльниках пеларгонии королевской обусловлено асин-хронностью прохождения ими клеточного цикла в момент инокуляции на питательную среду. Так, в бутонах длиной 5 мм наблюдались микроспоры в стадии тетрады (75%) и ранней одноядерной пыльцы (25%). В бутонах длиной 10 мм присутствовали три стадии развития микроспор: тетрады (15%), одноядерная пыльца (70%) и двуядерная пыльца (15%). В крупных бутонах длиной 15 мм отмечены двуядерная (80%) и одноядерная (20%) пыльца (Рисунок 6). тетрада одноядерная микроспора двуядерная микроспора
Из полученных данных видно, что в бутонах одного размера большинство микроспор обычно находилось на какой-то одной стадии развития, а меньшее их количество - на стадиях, соседних с этой основной.
Известных данных об оптимальной стадии развития микроспор пеларгонии королевской с целью получения гаплоидных растений нет. Однако есть похожие исследования на других культурах. Так, известно, что растения, развившиеся из пыльников дурмана безвредного и табака, культивируемые на одноядерной стадии, были гаплоидами, в то время как растения, полученные из пыльников на более поздних стадиях, имели различные уровни плоидно-сти [145], а для получения гаплоидов Brassica napus размер бутона вообще не имел значения, поскольку эмбриогенез данной культуры зависел от стадии развития пыльцы, определяемой условиями выращивания донорных растений [26].
Таким образом, для дальнейших исследований было решено использовать пыльники, находящиеся в бутонах длиной 10 мм, т.к. они имеют максимальную долю одноядерных микроспор. Очевидно, что длина бутона может быть использована для первоначального отбора тех из них, которые содержат пыльники с микроспорами, находящимися на стадиях развития, способных к эмбриогенезу in vitro. Однако при работе с новыми генотипами, а так же при использовании донорных растений, выросших в неконтролируемых условиях среды, наряду с применением морфологических показателей, необходимо так же использовать микроскопический контроль исходного материала.
В связи с этим при отборе бутонов, содержащих оптимальную для эмбриогенеза стадию, целесообразно использовать и предварительную микроскопическую оценку исходного материала при помощи дифференцирующего красителя, непосредственно перед культивированием. Его применение не требует предварительной фиксации и позволяет быстро и точно подобрать необходимый размер бутона.
Способность к эмбриоидогенезу напрямую зависит от стадии развития, на которой находится микроспора [40,95]. В связи с этим, очень важно знать на какой стадии развития микроспор следует проводить введение в культуру эксплантов пеларгонии королевской.
Наибольшей способностью к эмбриоидогенезу обладали микроспоры, выделенные из бутонов длиной 10 мм сортов сортов Лотос, Шоко, Петтикот, т.е. находящиеся на стадии одноядерной микроспоры, не переходящие в стадию пыльцевого зерна. При этом, максимальный показатель эмбриоидогенеза наблюдался у сортов Лотос и Петтикот и составил в процентном отношении к общему числу микроспор в бутоне 0,117±0,008% и 0,114±0,008% (р 0.05), а каллусогенеза - 0,012-±0,002% и 0,010±0,002% (р 0.05) соответственно. Наименьшей компетентностью к эмбриоидогенезу и каллусогенезу обладали микроспоры, выделенные из бутонов длинной 5 мм и 15мм (Таблица 7, Рисунок 7). Таблица 7 - Эмбриоидо- и каллусогенез в культуре микроспор пеларгонии королевской в зависимости от длины бутона, 14-е сутки (n 50 000)
Таким образом, морфогенетическая активность микроспор пеларгонии королевской зависит от длины бутона. При длине бутона 10 мм наблюдается компетентность к эмбриоидогенезу и каллусогенезу у всех изучаемых генотипов. Сорта пеларгонии королевской (Лотос, Шоко, Петтикот) характеризовались повышенным андрогенным потенциалом, проявляющемся в су-щесвенной способностью к морфогенезу в культуре микроспор. При этом, способность к эмбриоидо- и каллусогенезу у сортов Лотос и Петтикот была достоверно выше (р 0.05). Отсюда следует, что определение оптимальных размеров бутонов, содержащих отзывчивые микроспоры для индукции эмбриогенеза, является необходимым условием для успешного культивирования.
Характеристика удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской по морфологическим признакам
Оценка селекционного материала по декоративным и хозяйственно-ценным признакам: высота растения, ширина куста, число соцветий на растении, длина цветоноса, диаметр соцветия, число цветков соцветия, продолжительность жизни соцветий, семенная продуктивность по общепринятым методикам для цветочных культур.
Технологическая схема получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской была апробирована на четырех сортах (Лотос, Шоко, Петтикот, Априкотт), отображает последовательность выполнения работ в данном производстве с подразделением их по стадиям и операциям технологического процесса и имеет свои отличительные особенности: - для индукции андрогенеза в культуре пыльников и микроспор пеларгонии королевской не требуется воздействия шоковыми температурами. Следовательно, существующая процедура культивирования упрощается за счет исключения одного из этапов получения гаплоидов - предварительного выдерживания пыльников при пониженных и повышенных положительных температурах; - пыльники в бутонах длиной 10 мм имеют максимальную долю одноядерных микроспор. Вместе с тем при работе с новыми генотипами, а так же при использовании донорных растений, выросших в неконтролируемых условиях среды, наряду с применением морфологических показателей, необходимо использовать микроскопический контроль исходного материала. Поэтому при отборе бутонов, содержащих оптимальную для эмбриогенеза стадию, целесообразно использовать и предварительную микроскопическую оценку исходного материала при помощи дифференцирующего красителя, непосредственно перед культивированием. Его применение не требует предварительной фиксации и позволяет быстро и точно подобрать необходимый размер бутона; оптимальной средой для культивирования пыльников и микроспор пеларгонии королевской была среда, содержащая минеральные соли по прописи MS. В этих условиях микроспоры внутри пыльника сохраняют свою жизнеспособность на протяжении длительного периода выращивания в условиях in vitro и большей частью репрограммированы на эмбриоидо- и каллусо-генез; добавление аскорбиновой кислоты в питательную среду в концентрации 100 мг/л позволяет на 50% снизить выделение фенольных соединений и тем самым способствовать повышению способности к регенерации; добавление в питательную среду сахарозы в концентрации 120 г/л на первых этапах культивирования микроспор, позволяет на 30% повысить эмбриоидо- и каллусогенез; для индукции прямого эмбриоидогенеза наиболее эффективным сочетанием регуляторов роста являются: 0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP; 0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP; 4 мг/л BAP + 0,3 мг/л NАА. для индукции эмбриогенного каллуса оптимальным является сочетание регуляторов роста: 0,5 мг/л 2,4-D + 1,5 мг/л BAP; 3,0 мг/л Kin + 0,1 мг/л NАА; 2 мг/л BAP + 0,05 мг/л NАА; 2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА наблюдается активное образование; для индукции непрямого эмбриоидогенеза наиболее эффективным сочетанием регуляторов роста является 2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА, при этом процесс дифференциации эмбриоидов происходит из эпидермальных клеточных слоев изолированных эксплантов. Перенос эмбриогенных кластеров и каллусов на среду с тидиазуроном (2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА и 0,5 мг/л TDZ) сопровождается перестройкой в процессе пролиферации каллусной ткани с эмбриоген-ного на морфогенный тип развития с геммогенезом и пролонгированной регенерацией побегов; - на этапе размножения для получения максимального количества почек и побегов концентрацию минеральных веществ в питательной среде МS целесообразнее снижать до 50% и 25%. Оптимальное сочетание и концентрация регуляторов роста на этапах микроразмножения составляет: ВАР- 1,0 мг/л; NAA-0,05 мг/л; - адаптация микрорастений пеларгонии королевской в торфяных таблетках позволяет достичь 90% приживаемости за 14 дней.
Разработка лабораторного технологического регламента получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской проводилась на основе ранее проведенных исследований и в соответствии с ОСТ 64-02-003003-2002 (Приложение А).
В процессе разработки лабораторного технологического регламента использовались следующие нормативные документы: ГОСТ 2105-95. ЕСКД. Общие требования к текстовым документам; ГОСТ 12.1.004-91. ССБТ. Пожарная безопасность Общие требования; ГОСТ 12.1.005-88. ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны; ГОСТ 12.1.016-79. ССБТ. Воздух рабочей зоны Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ; ГОСТ 12.1.019-79. ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты; ГОСТ 12.2.003-91. ССБТ. Оборудование производственное. Общие требования безопасности; ГОСТ Р 12.3.047-98. ССБТ. Пожарная безопасность технологических процессов. Методы контроля; ГОСТ 12.4.021-75. ССБТ. Системы вентиляционные. Общие требования; ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения; ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия; ГОСТ 29105.2-91. Микрочеренки укорененные ин витро. Технические условия; ГОСТ 29105.3-91. Микрочеренки укорененные адаптированные.