Содержание к диссертации
Введение
1. Межвидовая гибридизация растений: состояние и перспективы использования 11
1.1. Межвидовая гибридизация растений 11
1.1.1. Механизмы несовместимости растений при межвидовой гибридизации 14
1.1.2. Методы преодоления несовместимости растений 17
1.1.3. Использование эмбриокультуры для преодоления несо вместимости 19
1.2. Межвидовая гибридизация тыквы 24
1.2.1. Характеристика видов тыквы 27
1.2.2. Методы преодоления барьеров несовместимости при скрещивании различных видов тыквы 30
1.2.3. Преодоление несовместимости различных видов тыквы с использованием метода эмбриокультуры 34
2. Условия, исходный материал, схема и методики проведения опытов 41
2.1. Задачи, цели и схема исследований 41
2.2. Условия проведения исследований 42
2.3. Материал и методики проведения исследований 48
Довои гибридизации и характеристика межвидовых
3. Преодоление барьеров несовместимости при межви довой гибридизі гибридов тыквы .
3.1. Характеристика исходного материала по основным морфологическим и хозяйственно-ценным признакам 61
3.2. Жизнеспособность пыльцы тыквы при хранении 62
3.3. Усовершенствование приемов преодоления барьеров несовместимости при гибридизации видов тыквы 65
3.3.1. Оценка эффективности приемов преодоления несовместимости при межвидовой гибридизации тыквы 65
3.3.2. Изучение режимов стерилизации семян и зародышей 74
3.3.3. Выявление оптимального возраста зародышей для введения в культуру in vitro 77
3.3.4. Подбор питательных сред для культивирования эксплан-тов и трансплантов тыквы в условиях in vitro 81
3.4. Оценка полученного в ходе исследований материала по основ ным морфологическим, генетическим, биохимическим и имму нологическим признакам 84
3.4.1. Оценка гибридов Fi и F2 С. maxima х С. moschata по морфологическим признакам 84
3.4.2. Использование ПЦР-анализа для оценки межвидовых гибридов С. maximax С. moschata 89
3.4.3. Оценка гибридов Fi и F2 С. maxima х С. moschata по биохимическим признакам 90
3.4.4. Оценка гибридов F] и F2 С. maxima х С. moschata на устойчивость к пероноспорозу и бактериозу 92
Заключение 95
Выводы 96
Предложения для использования в селекционной практике 98
Список использованной литературы 99
Приложение 117
- Использование эмбриокультуры для преодоления несо вместимости
- Характеристика исходного материала по основным морфологическим и хозяйственно-ценным признакам
- Подбор питательных сред для культивирования эксплан-тов и трансплантов тыквы в условиях in vitro
- Оценка гибридов F] и F2 С. maxima х С. moschata на устойчивость к пероноспорозу и бактериозу
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из главных задач селекции тыквы является выведение новых сортов, обладающих комплексом хозяйственно ценных признаков (богатых каротином, сахарами, крахмалом, с высоким процентом сухого вещества, имеющих кустовой тип роста, с большим количеством женских цветков (Юрина О.В., 1966), холодостойких, устойчивых к болезням и вредителям (Прохоров И.А., Крючков А.В., Комиссаров В.А., 1997). Однако каждый вид тыквы обладает отдельными индивидуальными хозяйственно-ценными признаками, но не всеми в совокупности.
Растения вида С. maxima L. имеют крупные плоды, неприхотливы к температурным и почвенным условиям, но часто малоустойчивы к болезням (мучнистой росе, вирусной мозаике и др.). Растения вида С. реро L. (кабачки и патиссоны) отличаются скороспелостью и меньшей требовательностью к теплу, в ряде случаев характеризуются кустовой формой. У растений вида С. moschata Duch. плоды обладают высокими вкусовыми качествами и высоким содержанием каротина (14-34 мг/100 г). Кроме того, растения этого вида отличаются высокой устойчивостью к болезням и вредителям, но вместе с тем они позднеспелы и теплолюбивы (Мещеров Э.Т., Калягин В.Н.,1977). Тлади-анта (Thladianta dubia Bunge), или красный огурец, - многолетняя лиана семейства тыквенных, обладает повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, слабо поражается болезнями и характеризуется высокой урожайностью. (Прутенская Н., 2002). С. ficifolia Bouche — вьющееся однолетнее растение, устойчивое к низким температурам, произрастает без особого ухода, отличается высокой урожайностью и устойчивостью к болезням и вредителям (Andres Т.С., 1990).
Семена тыквы имеют лечебное и питательное значение. Они содержат масла до 50 %, белок, сахара, минеральные соли, аминокислоты, соли кремниевой и фосфорной кислоты, каротин, витамины (Литвинов С.С., Россошанский А.А., 1998), являются ценным и перспективным фармакологическим сырьем для получения экологически чистых лекарственных препаратов, та ких как "Тыквеол", "Простабин", "Тыквопротеин", "Биол". (Михалев В.Ю., 2003).
Методами обычной селекции добиться оптимального сочетания урожайности, устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды и высокого качества плодов в одном генотипе затруднено (Шевелуха B.C., 2002). В большинстве случаев, при межвидовых скрещиваниях у растений образуются неполноценные семена с недоразвитыми зародышами, которые могут характеризоваться ценным сочетанием признаков и свойств (Бурдасов В.М., 1979).
Культура зародышей в условиях in vitro или эмбриокультура является действенным методом в решении ряда селекционно - генетических задач и, в частности, дает возможность получить ценные гибридные растения из нежизнеспособных при обычных условиях культивирования семян.
Препятствием к широкому использованию эмбриокультуры является отсутствие универсальной питательной среды, трудности выращивания незрелых недоразвитых зародышей (Тюкавин Г.Б., 2007). В связи с этим, актуальными проблемами повышения эффективности эмбриокультуры являются: выявление оптимального возраста изолирования зародышей, режимы их стерилизации и состав питательной среды для их культивирования.
Целью данной работы являлось преодоление барьеров несовместимости и усовершенствование основных этапов технологии получения регене-рантов при межвидовой гибридизации тыквы для создания исходного селекционного материала.
Объект исследований - технология получения межвидовых гибридов тыквы.
Предмет исследований - зародыши, семена, плоды, растения Fb F2 межвидовых гибридов и сортообразцов тыквы.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований предложен усовершенствованный комплексный прием преодоления барьеров несовместимости видов тыквы С. maxima х С. moschata, заключающийся в сочетании использования прививок, опыления бутонов за 1 сутки до цветения и эмбриокультуры. Выявлены питательные среды (Sh-2 и MS) для эффективного культивирования зародышей, изолированных из недоразвитых семян. Впервые установлена высокая эффективность среды Sh-2 в эмбрио-культуре тыквы, выявлен оптимальный возраст (30 суток) для введения семян и зародышей в культуру in vitro, показана высокая эффективность использования гипохлорита натрия в концентрации 1,0% при экспозиции 15 мин для стерилизации зародышей и концентрации 1,5% при экспозиции 10 мин для стерилизации семян тыквы.
Практическая ценность работы состоит в том, что разработаны технологические приемы получения межвидовых гибридов тыквы С. maxima х С. moschata с использованием технологий in vitro. Разработанные и опубликованные методические рекомендации "Получение регенерантов тыквы при использовании метода эмбриокультуры" (2006), позволяют получать растения - регенеранты, межвидовые гибриды Fi, F2 и на их основе формы, сочетающие в себе морфологические и биохимические признаки родительских сортообразцов, характеризующиеся повышенной устойчивостью к перонос-порозу и бактериозу.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Москва, 2003), Международной научно - практической конференции "Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (Москва, 2004), III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), III Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадици онными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва: РАЕН, 2005), Научной конференции, посвященной 75 - летию Всероссийского НИИ овощеводства (Москва, 2006), Международной научно — практической конференции "Бахчеводство юго - востока России в XXI веке. Проблемы адаптации в селекции, сортоиспытании и семеноводстве бахчевых культур и пути решения" (Волгоград, 2007).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- усовершенствованый комплексный прием преодоления барьеров несовместимости видов тыквы;
- режим стерилизации семян и зародышей тыквы;
- оптимальный возраст введения зародышей межвидовых гибридов тыквы in vitro;
- питательные среды для культивирования незрелых зародышей, выделенных из недоразвитых семян тыквы;
- межвидовые гибриды тыквы, полученные в условиях in vitro.
Публикации результатов исследований
По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 7 работ, в т.ч. одна в журнале "Картофель и овощи", рекомендованном ВАК РФ.
1. Федоришина, О.И. Эмбриокультура в селекции тыквы / О.И. Федоришина, А.В. Поляков // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур (Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова). - М.: ВНИИО, 2003. - С. 451-455
2. Федоришина, О.И. Межвидовая гибридизация тыквы: образование семян / О.И. Федоришина, А.В. Поляков // Сб. науч. трудов международной научно-практической конференции "Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (22-25 марта 2004 г.). - М.: ГНУ ВНИИО, 2004.- С. 122-127
3. Федоришина, О.И. Получение регенерантов сельдерейных (Apiaceae), тыквенных (Cucurbitaceae), капустных (Brassicaceae) и ряда цветочных культур in vitro I А.В. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришина, А.А. Ткачева, О.В. Ильченко, Н.Н. Ананьина, Н.Н. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова // III Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва (14 - 18 марта 2005 г.), 2005. - С. 286-287
Fedorishyna, O.I. Obtaining regenerants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassicaceae and some flower crops in vitro I A.V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I. Fedorishyna, A.A. Tkacheva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivanova, T.V. Larionova, I.N. Borovikova II III Moscow International Congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development".- Moscow (March, 14-18, 2005), 2005. - P. 286-287
4. Федоришина, О.И. Эмбриокультура при межвидовой гибридизации тыквы / О.И. Федоришина, А.В. Поляков // III Российская научно-практическая конференция "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов". -Москва: РАЕН, (6-7 июня 2005 г.), 2005. - С. 58-59
5. Ситникова (Федоришина), О.И. Получение межвидовых гибридов тыквы при использовании эмбриокультуры / А.В. Поляков, О.И. Ситникова, О.Ф. Чикризова // Методические рекомендации. - М.: ГНУ ВНИИО, 2006. -24 с.
6. Ситникова, О.И. Использование ПЦР анализа для идентификации межвидовых гибридов тыквы / А.В. Поляков, О.И. Ситникова, О.Ф. Чикризова // Сборник научных трудов ВНИИССОК, вып. 41. - 2007. - С. 199 - 205
7. Ситникова, О.И. Как лучше сохранить жизнеспособность пыльцы разных видов тыквы / О.И. Ситникова // Картофель и овощи. - 2007. - № 6. — С. 31.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 186 наименований, в том числе 59 иностранных авторов, и приложений.
Диссертационная работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 17 таблицами, 16 рисунками и 6 приложениями.
Использование эмбриокультуры для преодоления несо вместимости
При проведении межвидовых скрещиваний у растений часто образуются неполноценные семена с недоразвитыми зародышами (Здруйковская-Рихтер А.И., 1979; Щеглов Н.И., 1979 и др.). И, как уже было отмечено выше, эти зародыши могут характеризоваться ценным сочетанием признаков и свойств. В дальнейшем, в процессе своего развития такие зародыши отторгаются вседствие постгамной несовместимости (Бурдасов В.М., 1979; Юма-гужин М.С, Мардамшин А.Г., Фатхутдинова Р.А., 2001).
Культура изолированных зародышей - один из методов, используемых в современной селекции растений, с помощью которого можно решить проблему несовместимости в постгамной фазе между зародышем и эндоспермом при межвидовой гибридизации (Василенко СИ., Гирко B.C., 2004; Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Кочиева Е.З. и др., 2008).
Одной из первых культур, зародыши которой использовались для культивирования in vitro, был лен (Dietrich К., 1924).
Ф. Лайбах (Laibach F., 1925, 1929) первым успешно преодолел барьеры несовместимости при межвидовых скрещиваниях льна и успешно культивировал полученные гибридные зародыши L. регеппе х L. austriacum.
С использованием метода эмбриокультуры А. Р. Рогаш (1964) получил серию гибридов при скрещивании видов льна L. sibiricum k-4580 и L. регеппе к-2918с видами L. alpinum, L. austriacum, L. narbonense, L. регеппе .
Широко используется культура зародышей, семяпочек и завязей in vitro после отдаленной гибридизации и из плохо прорастающих семян для получения растений и в семействе Brassicaceae. Впервые культуру зародышей использовал после скрещивания В. campestris и В. oleracea С. Ниши (Nishi S., Kawata J., Toda M., 1959). Успешно применения культуру завязи после скрещивания этих видов Н. Иномата (Inomata N., 1977), а также культуру семяпочек в гибридах растений рода Raphanus и рода Brassica М. Такешита с коллегами (Takeshita М., Kato М., Tokumasu S., 1980). Известны результаты успешного применения метода эмбриокультуры при получении межвидовых гибридов культурного и перуанского томата (Святченко Е.А., 1981). Г.А. Воробьева и Н.И. Приходько (1980), путем культивирования 30 - 40 суточных зародышей межвидовых гибридов томата в условиях in vitro, получили растения - регенеран-ты. С использованием метода эмбриокультуры М.С. Юмагужиным с коллегами (2001) были получены растения - регенеранты из незрелых зародышей гибрида гречихи посевной и гречихи татарской. Для создания гибрида F. esculentum х F. tataricum использовали введение в культуру in vitro 14-16 суточных межвидовых гибридных незрелых зародышей. В последующем из ре-генерантов получены цветущие растения. После перекрестного опыления клонированных растений происходило завязывание плодов на межвидовом гибридном растении. Однако у растений не хватало силы для формирования нормальных плодов. Плоды высыхали, не достигнув зрелости.
Гибридные зародыши, полученные от скрещивания пшеницы с элиму-сом, успешно были культивированы на искусственной питательной среде (Ивановская Е.В., 1983).
Межвидовые гибриды пшеницы от скрещивания гексаплоидных форм Т. aestivum L. с перспективными тетраплоидными пленчатыми видами Т. di-соссит Schuebl. и Т. timopheevii Zhuk. были получены путем культивирования зародышей на модифицированных средах. Выделенные хорошо развитые зародыши помещали на безгорональную среду Мурасиге - Скуга, а недифференцированные - на среду с добавлением витаминов по Стаба в половинной концентрации и гидролизата казеина (250 мг/л). В результате было получено 246 растений — регенерантов (Василенко СИ., Гирко B.C., 2004).
При скрещивании 7 сортов озимой, яровой мягкой и твердой пшениц с 3 видами диких пшениц Т. timopheevii Zhuk, Т. zhukovski и Т. dicoccum Schuebl, К.К. Кожахметов, А.Р. Искаков и Б.Ш. Алимгазинова (1997) экс-плантировали гибридные зародыши на 12 - 15 сутки после опыления на питательную среду MS. При культивировании зародышей наблюдалось как их прорастание зародышей с образованием побегов, так и каллусогонез. Частота каллусогенеза колебалась в зависимости от комбинации скрещивания от 25,6 до 85,1%, образование побегов от 4,6 до 54,7%. Всего было получено 108 растений - регенерантов. В.Г. Кызласову с сотрудниками (2003) удалось получить пшенично-эгилопсные линии путем культивирования зародышей пшенично-эгилопсных гибридов среде Мурасиге - Скуга в нескольких ее модификациях (Василенко СИ., Заболотняя В.А., Гирко B.C., 2004).
Р.В. Папихин и С.А. Муратова (2004) применили эмбриокультуру для получения груше-яблоневых гибридов. С гибридных семян удаляли кожуру и извлекали зародыши с семядолями. Стерилизацию проводили 0,1 % раствором сулемы в течение 1 минуты. Для культивирования гибридных зародышей использовали минеральную основу питательных сред MS и QL. На этапах введения и микроразмножения полученных проростков в среду добавляли регуляторы роста растений: 6 - БАЛ в концентрации 1-2 мг/л, ГК в концентрации 0,2-1 мг/л, ИМК в концентрации 0,1-0,2 мг/л или ИУК в концентрации 0,2-0,5 мг/л. На этапе укоренения микрочеренков концентрацию макросолей и сахарозы снижали вдвое. В качестве индуктора ризогенеза применяли ИМК в концентрации 0,5-1 мг/л.
Г.Н. Суворовой и Е.А. Скотниковой (2004) была показана возможность получения межвидовых гибридов культурной чечевицы L. culinaris с дикорастущими видами L. tomentosus и L. lamottei с использованием культуры изолированных семяпочек. Оптимальный возраст введения семяпочек составлял 7-10 суток после гибридизации. Среды, содержащие в качестве цито-кинина 6-бензиламинопурин, обеспечивали развитие зародыша с формированием дополнительных побегов и почек. Среды, имеющие в своем составе зеатин, индуцировали прорастание зародыша с формированием единичного проростка нормальной морфологии.
Характеристика исходного материала по основным морфологическим и хозяйственно-ценным признакам
Оценка исходного материала, проведенная в 2002 - 2005 гг. по основным морфологическим и хозяйственно-ценным признакам, показала, что по типу стебля изученные сортообразцы существенно различались. Так, сорто-образцы Hubbard, Мамонт, Новинка, К 2657, К 4480 характеризовались формированием длинных стеблей, сорт Грибовская кустовая имел кустовую форму, а для тладианты характерен вьющийся тип. Сортообразцы также различались и по опушенности стебля. Жесткая опушенность стебля наблюдалась у сортообразцов Hubbard, Мамонт, К 4480, Грибовская кустовая 189 и тладианты, тогда как у сортообразцов Новинка и К 2657 отмечено наличие мягкой опушенности. Существенные различия наблюдались и по форме, цвету плода. Так, у сортообразца Hubbard плод был сплюснутый желто - красного цвета; у сортообразца Мамонт - округлый, красно — оранжевый; у сортообразцов Новинка и К 2657 плоды были зеленые, вытянутые; у сорта Грибовская кустовая 189 плоды - зеленые, овальной формы; у образца К 4480 - округлые, зеленые с белым рисунком; у тладианты - плоды красные, вытянутые. По массе плода также наблюдались существенные различия. Средняя масса плода сортообразца Hubbard составила 8 кг, Мамонт - 5,2 кг, Новинка - 5,1 кг, К 2657 - 4,6 кг, Грибовская кустовая 189 - 3,5 кг, К 4480 - 2,9 кг, тладианты — 0,02 кг. Число плодов на растении варьировало в зависимости от сортообразца. Так, у сортообразца Hubbard наблюдалось в среднем 2 плода на растении, Мамонт — 3 шт., Новинка - 4шт., К 2657 - 4 шт., Грибовская кустовая 189 — 6 шт., К 4480 - 15 шт., тладианты — 40 шт. (табл. 3).
При межвидовой гибридизации из-за несовпадения сроков цветения различных видов тыквы возникает необходимость сохранения пыльцы. В ходе проведенных исследований изучена возможность сохранения пыльцы при выдерживании цветков тыквы на цветоносах в сосудах с дистиллированной водой или питательной средой MS.
Исследования проведены на сортообразцах, относящихся к видам: С. maxima (Hubbard и Мамонт), С. moschata (Новинка, К 2657) и С. реро (Гри-бовская кустовая 189 и К 4630).
Проведенные исследования показали, что самой высокой жизнеспособностью обладала пыльца сортообразца Новинка вида (С. moschata). Ее жизнеспособность сохранялась в течение четырех суток на уровне 72 - 98% и лишь на пятые сутки снизилась до 11%. Большинство же сортообразцов сохраняло свою жизнеспособность на уровне 29 - 81 % только на протяжении 3 суток.
Более низкой жизнеспособностью обладала пыльца образца К 2657 (С. moschata), что проявилось в резком падении ее жизнеспособности (в 4,5 раза) со вторых (87,6%) на третьи (19,8%) сутки хранения.
Необходимо отметить, что жизнеспособность пыльцы сортообразца Hubbard (С. maxima), при выдерживании цветков в воде, сохранялась только в течение трех суток. Причем, на третьи сутки ее жизнеспособность была в 2 раза ниже (44,7%) по сравнению со вторыми сутками (79,9%), а на 4 и 5 сутки пыльца была полностью стерильна. Однако, при выдерживании цветков в среде MS, жизнеспособность пыльцы на 4 и 5 сутки сохранялась на уровне 5 - 9%. При сравнительном рассмотрении показателей жизнеспособности пыльцы сортообразца Мамонт (С. maxima), было отмечено незначительное снижение ее жизнеспособности в первые трое суток (80 - 97%), которая затем уменьшилась до 31% и 3% на 4 и 5 сутки хранения, соответственно.
Динамика снижения жизнеспособности пыльцы образца К 4630 и сорта Грибовская кустовая 189 (С. реро), в зависимости от длительности хранения, носила промежуточный характер по сравнению с вышеперечисленными сортообразцами. Так, пыльца образца К 4630 могла долго храниться, сохраняя жизнеспособность к пятым суткам на уровне 17,4% . Пыльца сорта Грибовская кустовая 189 сохраняла свою жизнеспособность в течение трех суток на уровне 81 - 90%), на четвертые сутки она резко падала до 24% и к пятым суткам пыльца была полностью стерильной. В случае хранения цветков тыквы на питательной среде MS полная стерильность пыльцы была зафиксирована уже на 4 сутки.
Проведенные исследования показали, что существенной разницы от применения воды или питательной среды MS обнаружено не было. Однако, учитывая стоимость питательных сред, целесообразно использовать воду. В обоих вариантах прослеживалась стойкая закономерность в снижении жизнеспособности пыльцы изучаемых сортообразцов тыквы в зависимости от увеличения длительности выдерживания цветков в разных условиях (рис. 5, 6, прил. В).
Из полученных данных следует, что хранение цветков тыквы в воде при температуре 4С позволяет продлить сохранность пыльцы для большинства сортообразцов на достаточно высоком уровне жизнеспособности в течение 3-х суток.
Подбор питательных сред для культивирования эксплан-тов и трансплантов тыквы в условиях in vitro
Многими авторами подтверждено, что успех культивирования in vitro недоразвитых незрелых зародышей также во многом зависит от питательной среды (Бурдасов В.М., 1979; Щеглов Н.И., 1979; Яковлев СП., Кожин А.В., Луткова Е.Н. и др., 1979). В своей работе мы использовали среды, широко используемые для культуры незрелых зародышей на различных культурах: Sh-О и Sh-2 (2001) - использующиеся в эмбриокультуре льна (Poliakov A.V. at all, 2001), MS (Murashige Т., Scoog F., 1962), White (White P.R., 1963) - в культуре тыквы, Norstog (Norstog К., 1973) - применяется в культуре ячменя, Monnier (Monnier М., 1978) - для получения эмбриоидов из незрелых зиготи ческих зародышей льна, также хорошо зарекомендовали себя такие среды, как Chu (Chu С.С., 1978) и Gamborg В5 (Gamborg O.L., 1984). В качестве контроля была использована среда White - примененная Вячеславом Алексеевичем Лудиловым в его работе с тыквой.
Культивирование зародышей в условиях in vitro, полученных от скрещивания С. maxima х С. moschata, осуществляли на вышеперечисленных питательных средах с добавлением фитогормонов Б АП в концентрации 1 мг/л и а -НУК в концентрации 0,05 мг/л на свету до роста эмбриона или образования морфогенных зон.
В связи с высокой морфогенетической активностью и наибольшим процентом жизнеспособных зародышей в опытах по изучению влияния питательных сред на морфогенез были использованы 30-ти суточные зародыши гибридов С. maxima х С. moschata (рис. 10).
Проведенные исследования показали, что культивирование зародышей на средах MS и Sh-2 позволило получить от 10,5% до 14,2% проростков, в то время как в контроле (среда White) этот показатель составлял 3,7% (табл. 12).
Рисунок 10 - Зародыш в условиях in vitro
В результате проведенной работы получено 55 растений - регенеран-тов.
При культивировании в условиях in vitro 30-ти суточных недоразвитых зародышей на стадии сердечка, полученных от самоопыления сортообразца Hubbard, на средах MS, Sh-2 и Gamborg В5, содержащих БАП в концентрации 1мг/л и а - НУК в концентрации 0,05 мг/л, отмечено, что зародыши развились в полноценные растения с хорошо развитой корневой системой. Таким образом, получение растений-регенерантов из недоразвитых зародышей самоопыленных сортообразцов, изолированных на стадии сердечка, не представляет особой сложности.
В целом, в ходе культивирования in vitro зародышей, полученных от межвидовых скрещиваний С. maxima х С. moschata, было получено 89 растений - регенерантов (рис. 11). Рисунок 11 - Регенерант тыквы С. maxima х С. moschata
Таким образом, использование питательных сред - MS и Sh-2, содержащих 6-бензиламинопурин в концентрации 1 мг/л и а-нафтилуксусную кислоту - 0,05 мг/л приводит к росту и развитию 10,5% и 14,2% зародышей гибрида С. maxima х С. moschata.
3.4. Оценка полученного в ходе исследований материала по основным морфологическим, генетическим, биохимическим и иммунологическим признакам
3.4.1. Оценка гибридов F] и I : С. maxima х С. moschata по морфологическим признакам В результате исследований получены растения F] Hubbard х Новинка (С. maxima х С. moschata) с использованием прививки; Hubbard х К 2657 (С maxima х С. moschata) — при опылении бутона за 1 сутки до цветения;
Hubbard x К 2657 - при декапитации пестиков. Однако семенное потомство было получено только в последней комбинации скрещивания.
Растения Fj этой комбинации по морфологии листа имели признаки, сходеные с отцовским образцом: лист темно — зеленый с аэренхимными полостями, опушенный, тогда как у материнского сортообразца лист светлый, неаэрированный (рис. 12). Стебель гибридных растений имел жесткое опушение, как у материнского и ребристую форму, как у отцовского сортообраз-цов. Плод имел округло — вытянутую форму плода желтого цвета с рисунком на поверхности в виде маленьких белых пятен, плодоножка - граненная с расширением у плода, тонкая, как у отцовской формы (табл. 13, рис. 14). Эти данные свидетельствуют о том, что по форме стебля и плодоножки, по аэри-рованности и опушенности листьев при скрещивании С. maxima х С. то-schata доминируют признаки С. moschata.
Растения гибрида Fi Hubbard х Новинка по морфологии были сходны с материнским сортообразцом. Различия наблюдались лишь по окраске плода. У гибрида она была зеленой, а у материнского сортообразца - желто - красной (табл. 13).
Сравнительная оценка морфологических и хозяйственно - ценных признаков показала, что полученные растения Fi развивались более мощными, чем родительские формы и в пределах одной комбинации скрещивания были сходными друг с другом.
Оценка гибридов F] и F2 С. maxima х С. moschata на устойчивость к пероноспорозу и бактериозу
Метод ПНР позволяет проводить амплификацию - множественную наработку любого фрагмента ДНК с использованием специфических термостабильных ДНК-полимераз (Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Кочиева Е.З. и др., 2008).
Применение методов молекулярной биологии, основанных на полиме-разной цепной реакции в сочетании с другими биотехнологическими подходами, в настоящее время приобретает все большее значение для решения различных селекционных задач. Высокая автоматизация ПЦР-анализов и минимальная навеска исследуемых образцов позволяют быстро и эффективно проводить идентификацию ценных генотипов.
Для установления генетической природы межвидового гибрида Fi Hubbard х К 2657 проводено изучение наследования продуктов амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции в сравнении с родительскими сортообразцами.
При анализе материала, полученного с использованием пяти различных праймеров, установлено, что праймеры Paw S6, Paw SI 1, Paw S17 не позволяют выявить полиморфизм между исследуемыми образцами. Наиболее информативными по числу и разнообразию амплифицированных продуктов явились праймеры Paw S5 и Paw S16.
Полученные результаты позволили выявить фрагменты, специфичные для обоих родительских сортообразцов (с Paw S16 450, 550, 650 п.н. у С. moschata и 400, 950 п.н. у С. maxima; с Paw S5 360, 420, 510, 890, 950 п.н. у С. moschata и 610 п.н. у С. maxima). При сравнении ДНК-спектров, полученных в результате амплификации с праймером Paw SI6, ДНК-профиль гибрида (треки 4-6) содержал три полосы (450, 550, 650 п.н.), присутствующих в спектре отцовского образца и две полосы (400, 950 п.н.), соответствующих таковым в спектре материнского сортообразца. ДНК-спектр гибрида (треки 4-6), полученный при использовании праймера Paw S5, содержал пять полос (360, 420, 510, 890, 950 п.н.), соответствующих С. moschata и одну полосу (610 п.н.), присутствующую в спектре С. maxima (рис. 15).
Таким образом, в результате детекции продуктов амплификации, было установлено, что гибрид F С. maxima х С. moschata имел в своем геноме все указанные фрагменты, заимствованные от обоих родительских сортообраз-цов, что подтвердило его межвидовое происхождение. Показана эффективность использования ПЦР-анализа в оценке исходного и гибридного селекционного материала по установлению уровня генетического родства.
3.4.3. Оценка гибридов F] и ї\ С. maxima х С. moschata по биохимическим признакам
Данные биохимического анализа листьев выявили, что по содержанию /?- каротина гибрид F, Hubbard х К 2657 соответствовал отцовскому образцу, по содержанию аскорбиновой кислоты наблюдался гетерозисный эффект (15%). Содержание /?- каротина в листьях гибрида составило 2,2 мг/ЮОг, аскорбиновой кислоты - 16,4 мг/100 г, в то время как у отцовского образца эти показатели составляли 2,4 мг/100г и 14,3 мг/100г, соответственно, и у материнского сортообразца - 1,6 мг/ЮОг и 11,4 мг/100г (табл. 14).
Биохимический анализ мякоти плодов тыквы показал, что гибрид по содержанию сухого вещества, глюкозы, /3 — каротина приближался к отцовскому образцу, а ксантофилла - к материнскому. Содержание сухого вещества в плоде гибрида составляло 4,81 г/100г, глюкозы - 1,21 г/100г, /3- каротина - 0,33 мг/ЮОг, ксантофилла - 0,10 мг/ЮОг (рис. 16). У отцовского образца К 2657 содержание сухого вещества составляло 4,55 г/ЮОг, глюкозы - 1,25 г/ЮОг, /3- каротина - 0,31 мг/ЮОг, ксантофилла - 0,05 мг/ЮОг, у материнского сортообразца Hubbard содержание сухого вещества составляло 3,68 г/ЮОг, глюкозы - 1,05 г/ЮОг, /3- каротина - 0,11 мг/ЮОг, ксантофилла - 0,12 мг/ЮОг (табл. 15).
Была проведена сравнительная оценка исходных сортообразцов и полученных гибридов F], F2 на естественном фоне к пероноспорозу и бактериозу.
У гибрида Fi Hubbard х К 2657 была отмечена устойчивость к пероноспорозу (97,3%) на уровне отцовского образца К 2657 (93,3%), в то время как у материнского сортообразца Hubbard этот показатель составлял 58,0%. Вы сокой устойчивостью отличались также сортообразцы К 4480 - 100% и Новинка - 92,6% (табл. 16, прил. Д).
