Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Общие сведения о культурных представителях рода Avena L 9
1.2. Морфологические и биологические особенности овса 15
1.3. Селекция овса 19
1.4. Биохимические маркеры в изучении генетического разнообразия растений 23
1.5. Общая характеристика проламинов 27
1.6. Полиморфизм, характер наследования и генетический контроль авенина 31
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 37
2.1. Растительный материал 37
2.2. Методы исследований
2.2.1. Электрофоретический анализ авенина 41
2.2.2. RAPD-анализ молекулярных маркеров овса 43
2.3. Статистические методы обработки результатов 45
ГЛАВА 3. Генетическое разнообразие культурных видов рода avena l. по компонентному составу авенина 50
3.1. Общая характеристика компонентного состава проламина культурных видов рода Avena L. 50
3.2. Аллельный состав авенин-кодирующих локусов коллекции рода Avena L. 57
3.3. Классификация образцов овса по компонентному составу проламина 60
3.3.1. Выявление образцов с идентичными спектрами авенина 60
3.3.2. Дифференциация образцов коллекции рода Avena L. по компонентному составу проламинов методом кластерного анализа 66
3.3.3. Дифференциация образцов коллекции рода Avena L. по компонентному составу проламинов методом главных компонент 74
3.4. Заключение 76
ГЛАВА 4. Генетическое разнообразие гексаплоидных культрурных видов овса по авенин-кодирующим локусам 79
4.1. Полиморфизм авенина, контролируемого локусами Avn A, Avn B и Avn C у гексаплоидных образцов рода Avena L. 79
4.2. Оценка генетического разнообразия видов A. sativa L., A. byzantina C. Koch. и их межвидовых гибридов 86
ГЛАВА 5. Распределение аллелей авенин-кодирующих локусов овса посевного в зависимости от природно климатических условий 90
5.1. Полиморфизм и закономерности распределения аллелей авенин-кодирующих локусов у образцов овса посевного российской селекции 90
5.2. Особенности полиморфизма авенин-кодирующих локусов сортов овса, включённых в государственный реестр по тюменской области 106
Выводы 113
Библиографический список 115
- Общая характеристика проламинов
- RAPD-анализ молекулярных маркеров овса
- Дифференциация образцов коллекции рода Avena L. по компонентному составу проламинов методом кластерного анализа
- Оценка генетического разнообразия видов A. sativa L., A. byzantina C. Koch. и их межвидовых гибридов
Введение к работе
Актуальность темы. Овёс это одна из основных культур, возделываемых на зернофуражные и кормовые цели, а также ценная продовольственная культура (Шеленга и др., 2006; Белкина и др., 2008; Лоскутов, 2008; Козлова и др., 2009). Лидирующее место в мире по производству овса занимает Россия. По данным продовольственной и сельскохозяйственной организации в 2013 г. на долю Российской Федерации приходился 21% валового производства зерна овса, далее следовали Канада – 16%, Финляндия – 5%, Польша – 5% и Австралия – 5% (FAO Statistical Pocketbook, 2015).
Основное направление селекции овса – увеличение урожайности и улучшение качественных характеристик сортов, а также повышение их устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды (Лоскутов, 2007; Поморцев, 2008). В настоящее время для этих целей широко применяются биотехнологические методы, позволяющие осуществлять маркирование геномов и генетических систем, с которыми связаны хозяйственно-ценные и адаптивно значимые признаки, а также поиск источников этих признаков в мировой коллекции культурных и диких растений. Весьма эффективно для решения этих задач используются разнообразные полиморфные белковые маркерные системы (Конарев В., 1980, 1983; Созинов, 1985; Поморцев, 2008, 2009). Для анализа генетического разнообразия овса успешно применяются высокополиморфные спирторастворимые запасные белки зерна – авенины (Портянко, 1987; Зеленская, 2006; Kim et al, 1978). В мире существует несколько подходов для интерпретации и регистрации электрофоретических спектров авенина (Портянко и др., 1987a; Поморцев и др., 2004; Souza, Sorrells, 1990). Это приводит к значительным затруднениям при сопоставлении результатов различных исследований, посвящённых оценке компонентного состава авенина и полиморфизма авенин-кодирующих локусов (АКЛ). Также в литературе практически отсутствуют сведения о степени сопряжённости аллелей авенин-кодирующих локусов овса с природно-климатическими факторами (Портянко, 1987; Souza, Sorrells, 1990).
Цель исследований: изучение генетического разнообразия культурных видов рода Avena L. по компонентному составу авенина и авенин-кодирующим локусам, зависимости распределения аллелей авенин-кодирующих локусов от природно-климатических факторов.
Задачи исследований:
1) изучить полиморфизм авенина образцов овса, относящихся к культурным
видам различного уровня плоидности;
2) оценить генетическое разнообразие культурных видов рода Avena L.,
выявить степень генетической дифференциации образцов;
-
исследовать аллельное разнообразие авенин-кодирующих локусов гексаплоидных культурных видов овса; составить каталог генетических формул авенина проанализированных образцов;
-
выявить особенности аллельного состава сортов овса российской селекции, выведенных в разных природно-климатических условиях;
5) изучить полиморфизм авенин-кодирующих локусов сортов овса посевного, включенных в Государственный реестр по Тюменской области, выявить аллели, характерные для местного региона.
Научная новизна работы: исследована генетическая дифференциация образцов овса разных групп плоидности. Впервые установлено, что группировка образцов определяется в первую очередь компонентами авенина, синтез которых контролируется локусом Avn C. Впервые исследован полиморфизм авенин-кодирующих локусов коллекции культурных гексаплоидных видов овса, оценено среднее генное разнообразие проанализированных видов по АКЛ. Впервые установлено, что распределение аллелей авенин-кодирующих локусов у овса посевного зависит от ряда природно-климатических факторов региона происхождения. Выявлено, что наибольшая селективность при воздействии этих факторов характерна для локуса Avn C.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты,
полученные в настоящей работе, имеют теоретическое значение в исследованиях
полиморфизма АКЛ овса. Проведённый электрофоретический анализ проламина
культурных видов рода Avena L. и составленный каталог генетических формул
авенина исследованных образцов позволит поддерживать постоянство их
биотипного состава. Выделены образцы с крайне редкими, а также идентичными
спектрами авенина, что может представлять ценность при отборе исходного
материала для селекции овса. Выявлены аллели АКЛ, сопряжённые с
показателями влаго- и теплообеспеченности региона происхождения. Такие
аллели могут быть использованы в селекции для маркирования генотипов,
обладающих адаптивным потенциалом в конкретных природно-климатических
условиях. В результате позернового анализа овса посевного сорта Отрада
(ФГБНУ «НИИСХ Северного Зауралья») выявлена гетерогенность спектров
авенина. Семьи I и II биотипов использованы для последующего размножения.
Сведения о соотношении биотипов позволят осуществлять контроль за
биотипным составом сорта методом электрофореза проламинов при
семеноводстве.
Объект и предмет исследований. Объектом исследований послужила коллекция образцов культурных видов рода Avena L., а также гибридов между A. sativa L. и A. byzantina C. Koch. Предмет исследований – запасные спирторастворимые белки зерна овса – авенины.
Методология и методы исследования. Научная работа проводилась общепринятыми методиками с использованием методов анализа и синтеза, лабораторных наблюдений, анализа литературных источников, математической обработки данных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Спектры проламинов культурных видов овса позволяют выявлять ценные
генотипы.
2. Полиморфизм авенин-кодирующих локусов Avn А, Avn В и Avn С
характеризует генетическое разнообразие рода Avena L.
3. Аллели авенин-кодирующих локусов маркируют генотипы, обладающие
адаптивным потенциалом в конкретных природно-климатических условиях.
Степень достоверности результатов исследований обеспечивается постановкой необходимого количества экспериментов, значительным объёмом исследованного материала. Анализы проводились согласно общепринятым методикам. Достоверность выводов основывается на методах математической обработки данных.
Апробация работы. Основные результаты исследований были
представлены на: заседаниях кафедры Технологии производства, хранения и
переработки продукции растениеводства ФГБОУ ВО ГАУ Северного Зауралья
(2012-2015), Международных конференциях (Тамбов, 2013; С.-Петербург, 2013;
Алматы, 2014; Челябинск, 2014; Курган, 2014; Тюмень, 2014, 2016; Красноярск,
2014; Екатеринбург, 2015, 2016; Новосибирск, 2015) региональной научно-
практической конференции (Тюмень, 2014), Всероссийском конкурсе У.М.Н.И.К.
(Тюмень, 2013), научно-методическом семинаре летней школы молодых учёных
при ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева «Биотехнология в сельском
хозяйстве, AgroBioTech – 2014» (Москва, 2014), Координационном совещании по
селекции, семеноводству, технологии возделывания и переработке
зернофуражных культур «Селекция, семеноводство и производство
зернофуражных культур для обеспечения импортозамещения» (Тюмень, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 229 источников, в том числе 57 иностранных авторов. Работа изложена на 175 страницах и содержит 18 таблиц, 21 рисунок, 8 приложений.
Личный вклад соискателя состоял в выполнении лабораторных исследований, анализе и интерпретации полученных экспериментальных данных, математической и статистической обработке результатов, подготовке и оформлении рукописи диссертации, материалов основных публикаций.
Общая характеристика проламинов
Овёс – однолетнее, реже многолетнее растение, состоящее из корня, стебля, метёлки и листьев.
Корень овса мочковатый. Стебель – соломина из 3-5 междоузлий, заканчивающаяся соцветием – метёлкой. Высота стебля варьирует от 40 до 200 см и зависит от сортовых особенностей и условий возделывания.
Лист многолинейный. Листовая пластинка чаще всего голая, опушение встречается по краям и на листовом влагалище. Количество листьев обычно составляет 4-5.
Метёлка состоит из главного стержня и боковых веточек, собранных в мутовки по 5-7 шт. Выделяются два основных типа метёлки: сжатая (одногривая) и раскидистая. Среди раскидистых метёлок выделяют полусжатую и раскидистую формы. На концах разветвленной метёлки расположены колоски, окруженные двумя колосковыми чешуями. В колосках плёнчатых форм овса количество цветков варьирует от одного до трёх, у голозёрных овсов колоски многоцветковые (4-6 шт.). Цветы обоеполые, имеют нижнюю и верхнюю цветковые чешуи, одностержневой перистый столбик и три пыльника.
Зерновка овса состоит из зародыша, эндосперма и сросшихся с ним оболочек. До 85% массы зерновки занимает эндосперм. Клетки его наружного (алейронового) слоя богаты белком и жирами. В остальной части эндосперма концентрируется весь крахмал зерновки (до 70%) и часть белков (до 13%). Наибольшее количество жира и белков содержится в зародыше (Смиловенко, 2004; Баталова, 2008). Плодовые и семенные оболочки зерна содержат много целлюлозы и пентозанов (Смиловенко, 2004).
Виды овса морфологически различаются по нескольким константным признакам. Так, к видовым особенностям относится характер основания цветковой чешуи нижнего зерна. У диких видов нижнее зерно имеет вырост в виде подковки, что обеспечивает осыпание зерна. У культурного овса цветковые чешуи зёрен подковки не имеют, при этом основание зерна у A. sativa прямое, у A. byzantina – слегка скошенное, у песчаного овса нижнее зерно в колоске расположено на ножке. Существует мнение, что в ходе селекции шёл отбор неосыпающихся форм с менее выраженной подковкой. Ещё одна видовая особенность – строение верхушки нижней цветковой чешуи. У посевного и византийского овса цветковая чешуя на верхушке имеет маленькие зубцы, а у песчаного заканчивается двумя остевидными заострениями – стригами длиной 3-6 мм. Посевной и византийский овсы различаются по характеру распадения зёрен в колоске при обмолоте. У посевного овса верхнее (второе) зерно отделяется вверху от несущего его стерженька, который целиком остается при нижнем зерне. У византийского овса стерженёк ломается посередине: часть остаётся при верхнем, а часть при нижнем зерне. Дикие и культурные формы различаются по наличию и числу остей в колоске. Овсюги и сорно-полевые овсы имеют не менее двух остей, посевной и византийский виды могут быть безостыми, иметь одну или две ости. Основное биологическое отличие диких форм от культурных – наличие длительного периода покоя семян диких видов (Родионова и др., 1994; Шмараев и др., 1988).
В процессе роста и развития растения овса проходят следующие фенологические фазы: набухание и прорастание семян, всходы, кущение, выход в трубку, колошение, цветение, молочная, восковая и полная спелость зерна. С начала набухания семян у овса начинается стадия яровизации, для нормального протекания которой необходима температура не ниже 5-10оС, достаточная влажность почвы и наличие кислорода. Минимальная температура для прорастания семян овса 1-2оС, а оптимальная – 20-25оС. В условиях Сибири, в оптимальные сроки посева температура почвы составляет 10-15оС, при этом всходы появляются на 8-10 сутки после посева (Шуравенкова, 1972; Хомяков, 1978; Мальцев, 1984; Богачков, 1986).
В фазу полного кущения в условиях Сибири растения овса вступают через 14-20 суток после появления всходов. Продолжительность её в Сибири – 10-13 суток. К концу фазы кущения заканчивается стадия яровизации и растения переходят к световой стадии.
Период от кущения до фазы выхода в трубку в лесостепных зонах Западной Сибири продолжается 15-17 суток, период «выход в трубку-колошение» – 9-20 суток. Повышенные температуры и длинный световой день сокращают его.
Цветение овса начинается в тёплое и влажное время, когда метёлка выходит из влагалища листа на 1/4-1/3 своей длины. Первыми зацветают нижние цветки верхушечных колосков, затем – цветки, расположенные в нижних полумутовках 2-го порядка и т.д. Продолжительность цветения мётелки составляет 5-8 суток (Ржанова и др., 1969; Богачков, 1986). В условиях Северного Зауралья – от 7 до 13 суток. Цветение в колоске идет от нижнего к верхнему цветку. Наиболее эффективно этот процесс протекает во второй половине дня – с 14 до 16 ч, а в жаркую погоду – с 12 ч (Солдатов и др., 1990; Баталова, 2008).
RAPD-анализ молекулярных маркеров овса
Сорта овса посевного Перона и Талисман, включённые в Государственный реестр по Тюменской области и имеющие идентичные спектры авенина были исследованы с использованием RAPD-анализа молекулярных маркеров. Также с применением этого метода был проанализирован сорт овса Тюменский голозёрный. Работу по изучению молекулярных маркеров с использованием RAPD-анализа у образцов овса проводили на базе лаборатории молекулярной и экологической генетики (МЭГ) ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (ВИР).
В качестве материала для выделения ДНК использовали 5-ти дневные проростки. Минимальный объём выборки составлял 25 зёрен.
Пробу листьев весом 300 мг растирали пестиком в буфере и переносили в 2,0 мл пластиковые, стерильные пробирки Eppendorf. В пробирки вносили экстракционный буфер до 800 мл и 15 мкл Потеиназы-К. Экстракцию проводили при комнатной температуре в течение часа, перемешивая осторожным переворачиванием каждые 10 мин. Центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин, при tо =20оC. Отбирали верхнюю фракцию (супернатант), добавляли к ней хлороформ (24:1) в соотношении 1:1 по объему и перемешивали качанием до получения устойчивой эмульсии. Центрифугировали пробирки при 13000 об/мин 10 мин при температуре 20оC. Отбирали супернатант в новые, чистые, стерильные пробирки объемом от 1,5 до 2,0 мл, вносили 30 мкл 3М Na-ацетата и ледяной (-20оC) изопропанол в соотношении 1:1. Центрифугировали при 14000 об/мин 15 мин (tо= +4оC). Сливали супернатант, в пробирку с осадком добавляли 500 мкл ледяного 70% этанола, снимали осадок со дна и промывали в течение 1-2 мин. Центрифугировали пробирки при 12000 об/мин 5 мин. при температуре на фильтровальную бумагу и сушили в течение 30 мин. Вносили в пробы по 100 мкл ТЕ буфера и оставляли на ночь в холодильнике при температуре +4оC. Амплификация ДНК при RAPD анализе. Для амплификации ДНК были использованы 6 десятимерных олигонуклеотидных праймеров серии OPA (OPA 1-OPA 6) для RAPD анализа. Состав праймеров: OPA 1: 5 -CAG GCC CTT C-3 OPA 2: 5 GC CGA GCT G-3 OPA 3: 5 -AGT CAG CCA C-3 OPA 4: 5 -AAT CGG GCT G-3 OPA 5: 5 -AGG GGT CTT G-3 OPA 6: 5 -GGT CCC TGA C-3 Сортоспецифичные продукты амплификации были получены при использовании праймеров OPA 2 и OPA 6. Полимеразную +4оC, вновь сливали супернатант, оставляя осадок. Пробирки переворачивали цепную реакцию проводили в смеси объёмом 25 мкл. Состав смеси: 10х инкубационный буфер (2,5 мкл), MgCl2 (1,5 мкл), смесь dNTP (2 мкл), праймер (1,2 мкл), Taq-полимераза (0,2 мкл), вода (15,6) и 2 мкл ДНК. Для амплификации использовали амплификатор С1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Амплификацию проводили при следующих условиях: первичная денатурация проходила при 94оC в течение 3мин. Далее в течение 45 циклов денатурация шла при 94оC 30 сек, отжиг праймера – при 36оC 1 мин, элонгация – при 72оC 2 мин.
Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (1,8 г агарозы на 100 мл 1хТВЕ буфера) с добавлением этидиумбромида. Разделение шло в течение 90 мин при постоянном напряжении 75В. Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицировали как чётко выявляемые компоненты в проходящем ультрафиолетовом свете.
На основе полученных электрофоретических спектров авенина и RAPD-полос были составлены компьютерные матрицы исходных данных, в которых присутствие компонента обозначали 1, а отсутствие – 0. Фракции белков и RAPD-полосы различали между собой, основываясь на скорости их движения в гелевом носителе.
В случае электрофореза запасных белков, обработку полученных данных проводили двумя независимыми методами многомерной статистики - кластерным анализом и методом главных компонент. Результаты RAPD анализа обрабатывали только методом кластерного анализа.
При проведении кластерного анализа важен выбор расчёта коэффициента подобия, который влияет на результаты кластеризации (Silva Meyer et al, 2004). Некоторые из алгоритмов расчёта генетической дистанции базируются на сравнении между совместным проявлением компонентов в каждой аллельной паре (значение 1 в матрице данных) и различиями между аллелями (варианты «0 1 » и «1 0» в матрице). Одним из наиболее часто используемых индексов подобия в этом случае является коэффициент Dice, который также известен как коэффициент Nei-Li: S = - -, (1) па+пь где па и щ - это число компонентов, присутствующих в спектрах А и В, соответственно, а паЬ - это количество компонентов, общих для двух спектров. S может приобрести любое значение от 0 до 1, где 0 означает отсутствие общих компонентов, а 1 говорит о том, что спектры идентичны (Nei, Li, 1979). Другие алгоритмы учитывают показатель отсутствия фрагмента у аллельной пары. Так, коэффициент Simple matching рассчитывается по формуле: Ssm = ПаЬ+ ЛВ , (2) где паЬ - это число общих компонентов у образцов, а пАВ - общее число компонентов, которые отсутствуют в обоих спектрах (но присутствуют в некоторых других), N - общее число отличающихся компонентов (Sokal, Michener, 1958). Высказывается мнение, что учёт взаимного отсутствия компонентов неадекватен для расчёта сходства, так как отсутствие может быть вызвано различными причинами (Weising et al, 2005). Тем не менее, коэффициент Simple matching используется в некоторых случаях. Так, его предложено применять при работе с кодоминантными маркерными системами (Артемьева и др. 2009; Silva Meyer et al, 2004). Для того чтобы оценить, какой из способов определения дистанции имеет преимущество при работе со спектрами авенина, нами были произведены расчёты с применением обоих методов.
Дифференциация образцов коллекции рода Avena L. по компонентному составу проламинов методом кластерного анализа
В результате прямой классификации изученных образцов методом главных компонент (Q-техника) большая часть образцов (по их основным биотипам) разделились на 24 группы, соответствующие 24 значимым главным компонентам с абсолютным значением факторных нагрузок от 0,99 до 0,51 (приложение 4). Наиболее многочисленными были группы 1, 2, 3, 4, 5 и 11, включающие от 12 до 60 образцов. В состав групп №6, 16-20, 23, 24 входило по одному образцу овса. Данные, полученные в ходе классификации методом ГК, во многом соответствовали результатам кластерного анализа.
Группа №1 включала 38 образцов и по своему составу полностью соответствовала группе 7а дендрограммы (приложение 4).
В группу №2 объединилось 60 образцов, вошедших в подкластер 3 дендрограммы, а также один образец песчаного овса (К-4914) со значением факторной нагрузки 0,82. Группа №3 содержала 36 образцов, входивших в состав подкластера 2 дендрограммы. По локусу Avn C образцы этой группы имели аллели 6 , 6b или 4 . Исключением были образцы К-14616 с аллелем 6а по этому локусу, и К-15136 с не идентифицированным аллелем локуса Avn C. В состав группы 4 вошли 12 образцов гексаплоидных видов овса со значениями факторных нагрузок от 0,75 до 0,51. На дендрограмме они входили в состав подкластеров 2, 3, 5 и 7б. Образцы, вошедшие в эту группу, отличались по аллельному составу локуса Avn C, однако почти у всех из них был аллель 4 по локусу Avn А и не идентифицированный аллель по локусу Avn В.
Группа 5 включала 59 образцов, при кластеризации образовавших группу 7б. Исключение составил образец К-14938 с величиной факторной нагрузки 0,51 – на дендрограмме этот образец входил в подкластер 6. К группе 6 относился 1 образец – К-15157, входивший в подкластер 5 дендрограммы.
Седьмая группа включала образцы, сформировавшие подкластер 6 дендрограммы и образец К-1766, входивший в подкластер 2. Все образцы этой группы имели аллель 1 по локусу Avn A и аллель 5 по локусу Avn В (кроме образцов К-1766 и К-1931, для которых аллели по локусу Avn В не были идентифицированы).
Группа 8 объединила 6 образцов овса посевного, входивших в подкластер 2 дендрограммы. Почти все образцы этой группы имели аллели В3 и С6а по АКЛ. Группа 9 включала четыре образца овса из подкластера 2. Все они имели аллель 2 по локусу Avn В. Аллель по локусу Avn С был определён только для образца К-14847 (С7), а по локусу Avn А – для К-15015 (А4). В 10 группу (соответствует подкластеру 1) вошли все исследованные образцы абиссинского овса. Группа 11 включала в себя образцы с аллелем 5 по локусу Avn С и по своему составу полностью соответствовала подкластеру 4 дендрограммы. Группы 12 и 13 объединили образцы песчаного овса из кластера I. Группа 14 включала 3 образца, два из них входили в подкластер 2 дендрограммы. По локусу Avn А у всех образцов этой группы был идентифицирован аллель 5. Четыре образца происхождением из Китая, входившие в состав подкластера 3 и имеющие идентичные типы спектров, объединились в группу 15.
В группы 16-20, 23 и 24 вошло по одному образцу. Образцы песчаного овса К-11447 и К-14944 вошли в группы 16 и 18, соответственно. Группы 17, 19, 20 и 24 были образованы образцами посевного овса (К-7439, К-15090, К-1769 и Гаврош, соответственно). В группу 23 вошёл гибрид посевного и византийского овса К-14850. Все эти образцы, за исключением сорта Гаврош, имели максимум один идентифицированный аллель по АКЛ, а на дендрограмме также занимали отдельное положение, не образуя кластеров. Следовательно, можно предположить, что эти образцы являются носителями крайне редких аллельных вариантов по авенин-кодирующим локусам.
Анализ спектров авенина методами кластерного анализа и Q-техники позволил объединить исследованные образцы в группы по степени их генетического сходства. Наиболее чётко выделились группы образцов абиссинского овса и гексаплоидных видов, имеющих аллели 1, 2, 3, 5 или 7 по локусу Avn С, а также группа образцов посевного овса с не идентифицированными аллелями по этому локусу, сформировавшая подкластер 5 дендрограммы. Образцы, сгруппировавшиеся в кластер 2 дендрограммы, не образовали самостоятельной группы по результатам анализа методом главных компонент и вошли в состав 8-ми разных групп. При этом образцы, объединившиеся в эти группы, часто имели совпадающие аллели по локусам Avn A и Avn B. Образцы происхождением из Китая, имеющие аллель 3 по локусу Avn С, в одном случае вошли в кластер 3, а в другом образовали самостоятельную группу (приложение 2, 4). Образцы песчаного овса по результатам анализа методом ГК образовали четыре отдельные группы, за исключением сорта К-4914, вошедшего в одну группу с гексаплоидными видами. Отдельного внимания заслуживает группа 4 по данным метода главных компонент. Её сформировали образцы, на дендрограмме вошедшие в состав четырёх различных кластеров. Эти образцы отличались по аллельным вариантам локуса Avn С, но практически все они имели аллель 4 локуса Avn А в спектрах.
Стоит отметить, что при исследовании полиморфизма глиадинов коллекции пшеницы спельта (Романова и др., 2001) методом Q-техники и кластерным анализом, выделенные группы во многом соответствовали систематическому и эколого-географическому делению вида. Однако Я.Г. Зеленская (2006), применив упомянутые методы для классификации староместных форм овса посевного по спектрам авенина, отмечает слабую связь между распределением образцов на группы и их принадлежностью к определённым систематическим, эколого-географическим и другим группам.
Нами не установлено чёткой связи между составом групп, выделенных методами кластерного анализа и главных компонент, и разновидностями формирующих их образцов либо их географическим происхождением. Однако распределение образцов на кластеры в целом соответствовало геномному составу входящих в них видов.
В результате кластерного анализа и применения метода главных компонент нами были выделены как группы образцов с идентичными спектрами, так и образцы с крайне редкими аллельными вариантами по авенин-кодирующим локусам. Эти группы образцов могут представлять собой ценный исходный материал для селекции.
Установлено, что при кластеризации группировка образцов в подкластеры определяется в первую очередь компонентами авенина, синтез которых контролируется локусом Avn C. Возможно, этот локус эволюционно более древний. На это указывает также наличие в спектрах песчаного и абиссинского овса компонентов авенина, совпадающих по скорости движения в ПААГ с компонентами, контролируемыми локусом Avn C у гексаплоидных видов. Вероятно, гены, детерминирующие синтез этих компонентов у видов A. strigosa и A. abyssinica были исходными для последующего формирования авенин-кодирующих кластеров гексаплоидных видов.
Оценка генетического разнообразия видов A. sativa L., A. byzantina C. Koch. и их межвидовых гибридов
Для сорта Тюменский голозёрный были определены аллельные варианты локусов Avn А и Avn С. Генетическая формула сорта имела вид Avn А2 Вned С3.
При анализе электрофореграмм сорта Мегион нами выявлено два типа спектров, находившихся в популяции в соотношении 2:1. При определении аллелей авенин-кодирующих локусов, идентифицированы варианты локуса Avn C, одинаковые у обоих биотипов и аллель локуса Avn A для I биотипа. Генетическая формула сорта Мегион: Avn А2+ned Вned С5 (рисунок 20).
Сорт Отрада также состоял из двух биотипов соотношением 2:1. При анализе спектров этого образца определены аллельные варианты локусов Avn C и Avn В, а также аллель локуса Avn А для II биотипа. Таким образом, гетерогенность сорта определялась наличием двух аллельных вариантов локуса Avn А. Генетическая формула сорта Отрада: Avn Aned+4В4C1.
Схемы электрофоретических спектров и блоков компонентов гетерогенных сортов овса посевного, включённых в Государственный реестр по Тюменской области. St – Astor (стандарт); 1 – Отрада (а – I биотип, б – II биотип); 2 – Мегион (а – I биотип, б – II биотип). На основе данных о компонентном составе авенина проанализированных сортов была проведена кластеризация методом UPGMA. Генетические дистанции между образцами рассчитывали с использованием индекса подобия Dice (рисунок 21). Биотипы гетерогенных сортов рассматривались как отдельные образцы.
В результате кластеризации все образцы разделились на два кластера. Первый кластер образовали сорт Тюменский голозёрный и биотипы сорта Мегион. При этом генетическая дистанция между этими сортами составила 0,9 единиц, что может быть связано с происхождением сорта Тюменский голозёрный. В отличие от остальных образцов, селекционная работа с этим сортом велась одновременно в Тюменской области и Казахстане, что повлияло на комплекс хозяйственно-ценных и адаптивных признаков этого сорта, а вместе с этим и на состав сцепленных с ними аллелей авенин-кодирующих локусов. Так, только в спектре этого сорта выявлен аллель С3, который, согласно таблице 15, имеет прямую умеренную связь со значением среднегодовой температуры.
UPGMA-дендрограмма филогенетических взаимоотношений образцов овса посевного, возделываемых в Тюменской области. А – по компонентному составу авенина; Б – по результатам RAPD анализа. Шкала показывает значение генетической дистанции по Dice. На ветвях указаны значения бутстреп-индексов.
Оставшиеся образцы сформировали второй кластер. Из всех образцов, сгруппировавшихся в этот кластер, наиболее удалены друг от друга оказались два биотипа сорта Отрада, генетическая дистанция между которыми составила 0,5. Наиболее близок генетически ко второму биотипу сорта Отрада сорт Фома (генетическая дистанция 0,2). Эти два образца образовали одну группу во втором кластере. Такая генетическая близость этих образцов, вероятно, вызвана тем, что они являются сибсами, т.е. потомками одних и тех же родителей.
Отдельного внимания заслуживают сорта Перона и Талисман, образовавшие одну группу. Генетическая дистанция между этими сортами равнялась нулю. К причинам идентичности спектров авенина относятся общность происхождения сортов, а также отбор в процессе селекции генотипов с хозяйственно-ценными ассоциациями генов, которым соответствуют определённые аллели АКЛ. Однако сорта Перона и Талисман выведены в разных странах и не имеют одинаковых родителей. Также нельзя исключать возможность механического засорения одного сорта семенным материалом другого, особенно с учётом того, что первичное семеноводство с сортом Перона в настоящее время не ведётся.
Как известно, в случае совпадения электрофоретических спектров проламинов, отличия между сортами могут быть выявлены благодаря использованию других генетически полиморфных маркерных систем (Конарев А., 2002; Поморцев, 2008).
Для оценки различий между сортами Перона и Талисман нами был применён RAPD анализ молекулярных маркеров. Также этим методом был исследован сорт Тюменский голозёрный. RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) – полимеразная цепная реакция (ПЦР) со случайной амплификацией полиморфной ДНК. Применяется в тех случаях, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (10-20 пар нуклеотидов) с произвольно выбранными последовательностями, который будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза. Сайты связывания праймеров распределены по геному случайным образом, а полиморфизм выражается в присутствии или отсутствии соответствующих фрагментов в геле. Подбирая оптимальные условия (длину праймера, его состав, температуру и т.д.), удаётся получить удовлетворительную картину отличий для двух организмов. Для RAPD-маркеров характерно менделевское наследование, как правило, доминантного типа (Алтухов, Салменкова, 2002).
Результаты кластеризации образцов по данным RAPD анализа представлены на рисунке 21 Б. Согласно полученной дендрограмме, значение генетической дистанции по Dice между сортами Перона и Талисман составило 0,3, а между сортами Перона и Тюменский голозёрный – 0,14. Таким образом, результаты RAPD анализа показали, что все три исследованных сорта генетически отличаются друг от друга.
Идентичность спектров проламина сортов Перона и Талисман, вероятно, обусловлена тем, что данная комбинация аллельных вариантов является типичной для Тюменской области. Следует отметить, что аллели А4 и В4, выявленные в спектрах сортов Перона и Талисман, преобладают по частоте встречаемости в спектрах авенина сортов овса посевного, включенных в Государственный реестр по Тюменской области (таблица 18). По локусу Avn C преобладали в спектрах исследованных сортов входящие в состав одного семейства варианты С1 и С2.