Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Род Pelargonium L Herit. – морфологические особенности 11
1.2. Основные представители рода Pelargonium L Herit. 13
1.3. Отношение пеларгонии к факторам окружающей среды 22
1.4. Клональное микроразмножение растений 24
1.5. Зависимость морфогенеза от генотипа, типа экспланта, состава питательной среды и регуляторов роста 29
1.6. Клональное микроразмножение представителей рода Pelargonium L Herit. 34
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 42
2.1. Исходный растительный материал 42
2.2. Условия возделывания донорных растений 46
2.3. Схема проведения опытов 49
2.4. Методика проведения исследований
2.4.1. Методика лабораторных опытов 54
2.4.2. Оценка растений-регенерантов 58
2.4.3. Статистическая обработка данных 62
Глава 3. Результаты исследований 64
3.1. Оптимизация физиологических факторов, влияющих на морфогенез эксплантов 64
3.1.1. Выбор типа экспланта пеларгонии королевской для введения в культуру in vitro 64
3.1.2. Влияние срока изоляции эксплантов на их морфогенетическую активность
3.2. Выбор режима стерилизации для введения эксплантов в культуру in vitro 67
3.3. Подбор питательных сред для введения эксплантов пеларгонии королевской в культуру in vitro 69
3.4. Оптимизация концентрации и соотношения регуляторов роста для эффективного получения регенерантов пеларгонии королевской 72
3.4.1. Определение концентрации регуляторов роста на этапе введения эксплантов пеларгонии в культуру in vitro 73
3.4.2. Определение оптимальной концентрации регуляторов роста на этапе микроразмножения трансплантов пеларгонии королевской 79
3.4.3. Влияние кинетина на индукцию морфогенеза эксплантами пеларгонии королевской
3.5. Изучение влияния аскорбиновой кислоты на морфогенез эксплантов и трансплантов пеларгонии королевской 85
3.6. Укоренение побегов и адаптация регенерантов пеларгонии королевской к условиям in vivo 92
3.7. Влияние длительности культивирования in vitro трансплантов пеларгонии королевской на пролиферацию пазушных почек 94
Глава 4. Оценка растений-регенерантов r0 пеларгонии королевской 97
4.1. Характеристика регенерантов по морфологическим признакам 98
4.2. Сроки наступления основных фенофаз растений-регенерантов 101
4.3. Оценка растений-регенерантов по хозяйственно-ценным признакам 102
Глава 5. Экономическая эффективность производства оздоровленного посадочного материала пеларгонии королевской в условиях in vitro 106
Заключение 109
Выводы 110
Предложения для использования при производстве посадочного материала пеларгонии королевской 111
Список использованной литературы 112
Приложения 139
- Основные представители рода Pelargonium L Herit.
- Методика проведения исследований
- Оптимизация концентрации и соотношения регуляторов роста для эффективного получения регенерантов пеларгонии королевской
- Сроки наступления основных фенофаз растений-регенерантов
Введение к работе
Актуальность темы. Представители рода Pelargonium L’Herit. издавна имеют большое значение для озеленения. Пеларгонии используются повсеместно в цветниках, в виде горшечных культур в открытом грунте и как комнатные растения в зимний период (Слободчикова Е.С., 2004).
Среди всех видов пеларгоний наиболее изысканной и распространенной считается пеларгония крупноцветковая, которую также именуют королевской (P. grandiflorum или regal) благодаря её крупным цветкам яркой насыщенной окраски (Van der Walt. J.J.A., 1984; Мохно, В.С., 2014). Ценность пеларгонии королевской обуславливается не только ее богатыми пышными соцветиями с яркими цветками, расположенными на компактном густооблиственном кусте, но и способностью сохранять свои декоративные качества в течение длительного времени (Гончарова Е.Ю., 2006, Гутиева Н.М., 2010).
В промышленных масштабах P. grandiflorum размножают зеленым черенкованием (Abо El-Nil M.M., 1990). При видимых плюсах данного метода существует ряд недостатков. И в первую очередь, это передача инфекции от материнского растения к дочерней особи, а также низкая доля приживаемости черенков и подвержен-ность заболеваниям на стадии укоренения (Cassells A.C., 1992; Rajeswara Rao B.R., 2003).
В связи со сложностями, возникающими при традиционном вегетативном размножении пеларгонии, все большую актуальность приобретает клональное микроразмножение данной культуры (Lewu F.B., 2007; Arrigoni-Blank M.F., 2011). Благодаря тщательному отбору и подготовке эксплантов, а в последующем – их культивированию в стерильных условиях in vitro, возможно получить оздоровленный посадочный материал, свободный от бактериальных, грибных и вирусных инфекций, а также увеличить выход высококачественной продукции с единицы площади (Charlwood B.V., 2003). Особенно применение метода in vitro неоценимо для получения элитных маточников ценных сортов пеларгонии (Wojtania A., 2004).
В Российской Федерации и за рубежом по теме размножения Pelargonium grandiflorum в культуре in vitro крайне мало разработок, по большей степени они затрагивают получение регенерантов из каллусной ткани (Dunbar K.B., 1991; Yasugi S., Mochiyama Y., 1996).
Также имеются исследования по культуре тканей других
представителей этого рода, в основном эфироносных пеларгоний, выращиваемых в промышленных масштабах для получения гераниевого масла (Satyakala G., 1995; Rajeswara Rao B.R., 2000; Viateur U., 2012; Егорова Н.А., 2013).
В связи с недостаточной информацией по клональному
микроразмножению пеларгонии королевской и отсутствием
протоколов для выращивания ее in vitro, тема оптимизации условий клонального микроразмножения P.grandiflorum является востребованной и актуальной.
Целью исследования являлась оптимизация условий клонального
микроразмножения пеларгонии королевской (Pelargonium grandiflorum
(Andrews) Willd.) для ускоренного размножения эксплантов
апикального происхождения с целью получения оздоровленного посадочного материала.
Задачи исследования:
-
Определить оптимальные сроки изолирования почек с донорных растений, отработать режимы стерилизации.
-
Подобрать оптимальный состав питательных сред для культивирования эксплантов и трансплантов in vitro, а также состав и соотношение регуляторов роста на каждом этапе возделывания микроклонов для индукции морфогенеза и пролиферации пазушных почек.
-
Изучить влияние аскорбиновой кислоты на образование фенолов, а также на морфогенез эксплантов пеларгонии королевской.
-
Определить влияние длительности культивирования трансплантов in vitro на величину коэффициента размножения.
-
Провести оценку полученных регенерантов пеларгонии королевской по основным признакам (морфологическим, фенологическим, хозяйственно-ценным).
Научная новизна работы. Впервые оптимизированы факторы,
влияющие на эффективность in vitro культивирования пеларгонии
королевской на всех этапах биотехнологического процесса.
Установлено, что культивирование in vitro апексов на среде MS с содержанием БАП в концентрации от 1,5 до 2,0 мг/л и НУК – 0,1 мг/л способствует индукции морфогенеза и позволяет получить 88-96% морфогенных эксплантов в зависимости от сорта. Определено, что для пролиферации пазушных почек эффективной является концентрация БАП 1,0 мг/л и НУК – 0,1 мг/л, позволяющая получить от 3,4 до 4,1
побегов на один трансплант. Показано, что применение раствора аскорбиновой кислоты увеличивает долю эксплантов без видимого проявления фенолов до 95%, а также увеличивает способность побегов к росту в 1,3 раза по сравнению с эксплантами без обработки. Полученные растения-регенеранты соответствуют исследуемым сортам по морфологическим и фенологическим признакам и менее подвержены вертициллёзному увяданию и серой гнили, чем растения, полученные методом черенкования.
Теоретическая и практическая ценность. Оптимизированы условия для размножения пеларгонии королевской in vitro. Усовершенствованные элементы технологии производства ценного посадочного материала являются экономически эффективными. Их применение позволяет получить в год до 1 млн.руб. чистой прибыли при реализации регенерантов P.grandiflorum, выращенных в условиях in vitro из одного экспланта. Полученные оздоровленные растения-регенеранты пеларгонии королевской используются в качестве маточников в тепличном комбинате ООО «ПО Егорьевское».
Степень достоверности результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается экспериментальными исследованиями, выбором необходимого количества повторностей и объема выборки в процессе закладки опытов, а также статистической обработкой полученных данных.
Основные положения, выносимые на защиту:
повышенная концентрация БАП и умеренная - НУК позволяют индуцировать морфогенез на этапе введения эксплантов в культуру in vitro;
снижение концентрации БАП на этапе размножения трансплантов способствует пролиферации пазушных почек и увеличению коэффициента размножения;
использование аскорбиновой кислоты в качестве предобработки почек или наличие её в среде позволяет снизить долю эксплантов с образованием фенольных веществ и увеличить способность эксплантов к морфогенезу;
применение безгормональной среды способствует эффективному укоренению побегов сортов Шоко, Петтикот и Лотос; добавление в среду ИУК увеличивает выход укорененных растений сорта Лавендер;
полученные in vitro регенераты пеларгонии королевской обладают признаками, характерными для исходных сортов, и меньше
поражаются вертициллёзным увяданием и серой гнилью, чем укорененные черенки.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации были доложены на VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 2–5 октября 2012 г.), а также на заседаниях методической комиссии по селекции, семеноводству и биотехнологии ФГБНУ ВНИИО (2009–2012 гг.).
Публикации результатов исследований. По материалам исследований по теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа
состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов
исследований, результатов исследований и их обсуждения,
Основные представители рода Pelargonium L Herit.
Род Pelargonium L Herit. – крупнейший в семействе Гераниевых (Geraniaceae). Он является одним из пяти родов данного семейства и включает в себя около 280 видов растений, многие из которых представляют большой интерес как эфиромасличные и декоративные культуры (Van der Walt J.J.A., 1984; Bakker F.T., 2004; Jacqueline Y.Y., 2006).
Родина большинства видов пеларгоний – Южная Африка, где они входят в состав своеобразной Капской флоры. Многие из них являются эндемиками и произрастают только в определенных частях Капской провинции. Также в диком виде пеларгония произрастает в Северной Африке, Австралии, Новой Гвинее и островах Тихого и Атлантического океанов (Hollingsworth P.M., 1999). Представители рода Pelargonium в основном встречаются в саваннах, где растут на каменистых или песчаных почвах или же на выходах горных пород. Значительная их часть – ксерофиты, приспособившиеся к жизни в засушливых условиях и запасающие значительные количества влаги в утолщенных стеблях (Van der Walt J.J.A., P.J. Vorster, 1983; Albers F., Becker M., 2012).
Среди представителей рода Pelargonium имеются растения с различными жизненными формами: травы, полукустарники, кустарники. В декоративном озеленении наибольшее распространение получила травянистая форма пеларгоний (Гончарова Е.Ю., 2006). По продолжительности жизненного цикла пеларгонии бывают однолетними, двулетними и многолетними (Lis-Balchin M., 2002).
В естественной среде обитания у представителей рода Pelargonium прямые или ползучие стебли, склонные к ветвлению. Листья красивые, простые, пальчатые или пальчато-рассеченные, с прилистниками, часто с опушением; расположены поочередно или супротивно (Bakker F.T., 2004). Некоторые виды пеларгоний (P. sidoides) имеют клубни на корнях, которые используются в медицинских целях (Lis-Balchin M., 2002; Brendler T., 2008).
Наличие простых или эфироносных волосков является характерным признаком всех представителей рода Pelargonium. Внешне железистые эфироносные образования проявляют себя как опушение практически всех частей растения. Волоски имеют на кончике вздутие, в котором собираются эфирные масла, придающие характерный аромат многим представителям семейства, в первую очередь из группы душистых пеларгоний (Lalli J.Y.Y., 2006).
Цветок у пеларгонии обоеполый, пятичленный, зигоморфный. В зависимости от вида растения, цветки пеларгоний могут иметь различную форму, от звезды до воронки, а также различную окраску: от белого и оранжевого до темно-фиолетового (Хертли Б., 2002; Гончарова Е.Ю., 2006). Цветки собраны в зонтиковидные соцветия на верхушках побегов.
Чашечка пятираздельная, состоит из свободных, иногда сросшихся до середины чашелистиков. Венчик двугубый, пятилепестковый; тычинок 10 (из них обычно 3 без пыльников), расположенных в 2 круга. Завязь пестика верхняя, он возвышается над остальными частями цветка (Hollingsworth P.M., 1999; Комарова Г.В., 2007).
В естественных условиях произрастания пеларгония – перекрестно-опыляемое растение. Для нее характерно опыление с помощью пчел, шмелей, бабочек. У некоторых видов возможно самоопыление. В процессе созревания плода верхняя часть завязи значительно удлиняется (Struck M., 1996).
Плод пеларгонии – коробочка с остающимися чашелистиками, она вскрывается путем отделения гнезд снизу вверх. Плод распадается на 5 односемянных плодиков (Тахтаджан А.Л.,1982).
Анатомия вегетативных органов большинства видов пеларгоний и их гибридов однотипна. Стебель покрыт эпидермой с незначительно утолщённой наружной тангенциальной стенкой. В комплекс эпидермы входят многочисленные кроющие и железистые трихомы. Первичная кора представлена пластинчатой колленхимой, хлоренхимой и крахмалоносным влагалищем. Хорошо выражено склеренхимное кольцо перициклического происхождения. Центральный цилиндр представлен открытыми коллатеральными пучками. Мезофилл листа дифференцирован на столбчатый и губчатый. Жилка укреплена уголковой колленхимой и склеренхимными тяжами вдоль проводящих тканей. Имеются два типа железистых образований (волосков) в эпидерме вегетативных органов: мелкие железистые трихомы с одноклеточной головкой и одноклеточной ножкой, крупные железистые трихомы с одноклеточной и длинной многоклеточной ножкой (Лысякова Н.Ю., 2010).
Методика проведения исследований
Опыт 1. Изучение влияния срока изоляции эксплантов на их морфогенетическую активность.
Оптимальные сроки изоляции почек из донорных растений определяли путем оценки морфогенетической способности эксплантов, извлеченных из почек в период активного роста растений, в фазу обильного цветения и окончания цветения, в фазу покоя (4 варианта); трехкратная повторность. Экспланты сортов Шоко, Петтикот, Лотос, Лавендер культивировали на среде MS (сахароза 30 г/л, агар 6 г/л; БАП 2,0 мг/л, НУК 0,1 мг/л). Морфогенетическую активность оценивали по количеству эксплантов, из которых к моменту наблюдения (17–21 сутки) происходил рост побега.
В опыте участвовали растения сорта Лотос. В качестве стерилизующего агента использовали раствор гипохлорита кальция в концентрации 0,5, 1,0 и 2,0% и экспозиции от 5 до 15 минут. Контроль – экспланты без обработки гипохлоритом кальция. 10 вариантов, трехкратная повторность. Определяли влияние стерилизующего вещества на жизнеспособность (доля от общего числа) и инфицированность эксплантов (%). Опыт 3. Подбор питательных сред и регуляторов роста для введения эксплантов пеларгонии королевской в культуру in vitro. 1. На первом этапе культивирования in vitro использовали среды MS (Murashige T., Skoog F., 1962) и BM (Debergh P., Maene L., 1977) и регуляторы роста в двух различных соотношениях, всего 4 варианта опыта. 2. В каждом варианте было использовано по 50 эксплантов, три повторности. В опыте участвовали сорта Шоко, Петтикот, Лавендер и Лотос. Проводили учёт жизнеспособности (%) эксплантов и их морфогенетической активности (%), а также степень витрификации (доля витрифицированных эксплантов от общего числа изученных). Таблица 3 – Питательные среды и концентрация регуляторов роста для культивирования эксплантов пеларгонии королевской Опыт был проведен на сортах Шоко, Петтикот и Лавендер. При анализе влияния БАП и НУК оценивали жизнеспособность (%), морфогенетический потенциал (% морфогенных эксплантов от общего числа культивируемых эксплантов), а также способность к пролиферации пазушных почек (число почек/побегов на один эксплант). 5. Влияние кинетина на этапе введения эксплантов в культуру in vitro. Применяли питательную среду MS, содержащую БАП, НУК и кинетин в различных концентрациях. Было заложено 6 вариантов опыта, 3 повторности.
Анализировали способность эксплантов к морфогенезу путем определения доли морфогенных эксплантов от общего числа культивируемых эксплантов (%), их длины (мм) и количества листьев (шт.).
Опыт 4. Подбор регуляторов роста для культивирования трансплантов пеларгонии королевской in vitro.
На этапе непосредственно размножения трансплантов пеларгонии королевской закладывали опыт с тремя вариантами соотношения регуляторов роста на среде MS для сортов Шоко, Лотос, Лавендер и Петтикот.
В ходе опыта вели учет показателей: доля морфогенных конгломератов (%), из них – витрифицированных (%), а также коэффициент размножения (число побегов, готовых к пересадке, на один трансплант). Таблица 6 – Концентрации регуляторов роста для трансплантов пеларгонии королевской Опыт 5. Влияние аскорбиновой кислоты на образование фенолов в питательной среде, а также на морфогенез эксплантов пеларгонии королевской. Для нивелирования негативного воздействия фенольных соединений, образующихся в культивируемом материале и часто проявляющихся в среде в виде фиолетовых зон вокруг экспланта или транспланта, применяли раствор аскорбиновой кислоты двумя различными способами.
1. Погружение сегментов стебля с почкой в раствор, содержащий аскорбиновую кислоту в концентрации 0,4, 0,8 г/л с экспозицией 1, 3 и 5 мин. Изучено 7 вариантов опыта, включая контроль (без применения раствора аскорбиновой кислоты), трехкратная повторность. В опыте участвовали сорта Шоко и Петтикот. Анализировали жизнеспособность эксплантов (%), выявляли долю эксплантов с видимым проявлением фенолов в среде (%), оценивали способность побегов к росту (длина побега в мм и количество листьев в шт.).
2. Добавление раствора аскорбиновой кислоты в готовую про-автоклавированную среду в стерильных условиях бокса. В ходе данного эксперимента изучалось влияние четырех различных концентраций аскорбиновой кислоты в среде на экспланты пеларгонии сортов Шоко и Петтикот. В качестве контроля был вариант с предобработкой сегментов стебля перед введением эксплантов в культуру in vitro. 5 вариантов: контроль, 50, 100, 150 и 200 мг/л аскорбиновой кислоты в среде, трехкратная повторность. В ходе опыта исследовали жизнеспособность эксплантов (%), выявляли экспланты с видимым проявлением фенолов (%), а также наблюдали за динамикой роста побегов из почки, измеряя длину побега раз в 7 суток до достижения побегами возраста 28 суток.
Для выявления изменчивости морфогенетического потенциала транс-плантов пеларгонии королевской при длительном культивировании микроклоны сортов Шоко, Петтикот и Лавендер возделывали в течение 7 пассажей (циклов) на среде MS с различным содержанием БАП и НУК. Цикл длился от 27 до 35 суток. Гормональный состав среды в первом пассаже: 1,0 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК; в последующих – 0,5 мг/л БАП и 0,01 мг/л НУК. В конце каждого цикла оценивали способность к пролиферации побегов из пазушных почек, что выражалось в количестве побегов, образовавшихся на одном транспланте (коэффициент размножения).
Полученные растения-регенеранты сортов Шоко, Петтикот, Лотос, Лавендер оценивали по основным признакам для подтверждения их однородности и идентичности исходным сортам. В качестве контроля были взяты растения этих же сортов, полученные традиционным способом – зеленым черенкованием с маточников.
Оценку регенерантов проводили по трем группам признаков: 1. Морфологические. Высота и диаметр куста (см), диаметр цветка (см), число соцветий на растении (шт.) и цветков в соцветии (шт.), окраска околоцветника и пыльников. 2. Фенологические. Сроки наступления и продолжительность основных фенофаз: яровизация, бутонизация, цветение (начало, массовое цветение, конец), покой. Сравнивали длительность и сроки прихода фенологических фаз у контроля и растений, полученных методом клонального микроразмножения.
Оптимизация концентрации и соотношения регуляторов роста для эффективного получения регенерантов пеларгонии королевской
Максимальная частота индукции морфогенеза (до 90,0–98,0%, в зависимости от сорта) была на средах MS2 и ВМ2, дополненных БАП в концентрации 2,0 мг/л и НУК – 0,1 мг/л. При анализе сформировавшихся на этих средах новообразований было отмечено, что на них развивались наиболее мощные и здоровые побеги высотой до 2 см с 2–3-мя листьями (рис. 9). При этом гибель от некрозов либо отсутствовала, либо наблюдалась в единичных случаях (табл. 10).
В то же время большее количество побегов, образовавшихся на средах MS1 и ВМ1 с концентрацией НУК 0,02 мг/л и высоким содержанием кинетина – 10,0 мг/л, была слабая, хлоротичная (рис. 8), иногда с выраженной витрификацией (до 26,0% витрифицированных побегов); высота побегов не превышала 8 мм, и они имели не более 2-х листьев (табл. 11).
В результате данного опыта выяснено, что на средах MS1 и ВМ1 морфогенетическая активность существенно ниже, чем на MS2 и ВМ2. Это связано с высокой концентрацией кинетина в данных средах. На основании этого было принято решение об уменьшении концентрации цитокининов.
В целом же сравнение влияния сред MS и BM на морфогенетическую активность эксплантов пеларгонии при использовании оценки существенности разности между выборочными долями при качественной изменчивости (приложение А) показало, что во всех восьми исследованных парах разность между выборками была несущественна, поскольку tфакт t05. На основании расчетов можно сделать вывод о том, что существенной разницы между применением сред MS и BM для морфогенеза эксплантов пеларгонии нет. В связи с этим было решено в дальнейших опытах использовать среду MS.
При разработке технологии получения оздоровленного посадочного материала пеларгонии королевской путем культивирования ее в условиях in vitro первостепенная роль отводится грамотному выбору регуляторов роста, их оптимальному сочетанию в питательной среде для получения жизнеспособных морфогенных регенерантов. Для каждого этапа культивиро вания эксплантов необходимо подобрать оптимальную концентрацию регуляторов роста, чтобы стимулировать индукцию морфогенеза, развитие почек, рост побегов и листьев. В то же время важно избежать негативных последствий, наблюдающихся при избыточном содержании регуляторов роста в питательной среде, таких как витрификация, некроз и гибель эксплантов уже на начальных этапах введения в культуру (Benazir J.F., 2013).
Поскольку данных по гормональному составу питательной среды для индукции прямого морфогенеза меристематическими тканями P. grandiflorum не обнаружено, было решено опираться на имеющуюся информацию по пеларгониям других видов, а также исследовать различные концентрации наиболее распространенных регуляторов роста.
На этапе введения эксплантов в культуру in vitro предпочтительны повышенные концентрации цитокининов в среде и умеренные – ауксинов. Преобладание цитокининов необходимо для стимуляции закладки и развития почек у экспланта путем активации морфогенетической активности апикальной меристемы (Кулаева О.Н., 1973).
В качестве ауксинов для активации морфогенеза эксплантов представителей рода Pelargonium себя зарекомендовали НУК в концентрации от 0,01 мг/л до 0,1 мг/л и ИУК – от 0,1 мг/л до 1 мг/л. Цитокинины в виде БАП или бензиладенина в концентрации от 0,25 мг/л до 2 мг/л, а также кинетина до 10 мг/л (Debergh P. , Maene L., 1978 Reuther G., 1983; Satyakala G. et. al., 1995; Viateur U., 2012).
Для получения морфогенетически активных трансплантов, готовых к дальнейшему размножению, в наших опытах в питательную среду были добавлены БАП концентрации 2–6 мг/л и НУК – 0,01–0,2 мг/л (табл. 12). В качестве эксплантов использовали пазушные и верхушечные почки пеларгонии королевской, изолированные с донорных растений в фазу наращивания вегетативной массы.
Исследования показали, что оптимальным соотношением регуляторов роста явилось использование 2 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК для всех сортов. При таких концентрациях доля жизнеспособных эксплантов была до 94,0% при этом морфогенетическая активность в виде роста побега из почки наблюдалась в 88,0–92,0% случаев (рис. 10, А).
На основании данного опыта можно сделать вывод о благоприятном влиянии БАП, содержащегося в питательной среде в концентрации 2 мг/л, и НУК – 0,1 мг/л, на морфогенез эксплантов пеларгонии королевской.
Для выявления оптимальной концентрации регуляторов роста был заложен детальный опыт с меньшим шагом концентраций ауксинов и цитокининов (табл. 13). В результате культивирования эксплантов пеларгонии королевской сортов Шоко и Петтикот на среде MS с содержанием БАП 1,5 мг/л и НУК 0,1 мг/л наблюдалось наибольшее число жизнеспособных эксплантов по сравнению с остальными вариантами: до 96,0% у Шоко и 92,0% у Петтикот (табл. 13). Также высока доля морфогенных эксплантов при данном соотношении регуляторов роста у сорта Петтикота – до 88,0%. Для сортов Шоко и Лавендер наилучшей концентрацией для индукции морфогенеза была концентрация БАП 2,0 мг/л и НУК 0,1 мг/л, что подтверждает данные предыдущего опыта (табл. 12).
Основываясь на результатах двух исследований, можно сделать вывод о том, что оптимальная концентрация НУК для введения эксплантов пеларгонии королевской в условия in vitro составляет 0,1 мг/л, а концентрация БАП находится в диапазоне от 1,5 до 2,0 мг/л.
Сроки наступления основных фенофаз растений-регенерантов
К хозяйственно-ценным относятся признаки, влияющие на ценность декоративного растения с промышленной точки зрения. В первую очередь это продуктивность цветения, сроки достижения декоративности, устойчивость к болезням и вредителям.
Продуктивность цветения характеризуется такими показателями как число соцветий на растении и длительность цветения каждого отдельно взятого соцветия в процессе вегетации культуры. Эти показатели оказывают значительное влияние на декоративную ценность растения, от них зависит восприятие растения в целом, его внешний вид и декоративные качества.
Полученные регенеранты в ряде случаев превосходили контрольные растения по продуктивности цветения. Среди них можно выделить клоны сорта Лотос, имеющие в среднем на 1,9 соцветий больше, чем контроль. Однако при статистической обработке данных по числу соцветий на кусте существенной разницы между регенерантами и контролем не наблюдалось (табл. 26).
Длительность цветения одного соцветия как для контрольных образцов, так и для полученных in vitro клонов, составила в среднем 14–21 сутки и колебалась внутри сорта незначительно (табл. 26).
Сроки достижения декоративности (начало массового цветения) у большинства регенерантов пеларгонии королевской были короче, чем у растений, полученных традиционным способом вегетативного размножения, и составили в среднем 10 недель от момента окончания яровизации. В то же время у контрольных образцов массовое цветение начиналось через 11–12 недель после прохождения периода яровизации.
Одной из основных целей клонального микроразмножения является получение оздоровленного посадочного материала, свободного от вирусных, грибных и бактериальных заболеваний, а также растений более устойчивых к воздействию фитопатогенов.
Одним из самых пагубных заболеваний пеларгонии королевской в защищенном грунте является вертициллёзное увядание, вызываемое грибом рода Verticillium. Также значительный ущерб наносит серая гниль (Botrytis cinerea). Развитию этих болезней способствуют тепличные условия (Dunbar K.B., 1990).
Возделывание декоративных растений в условиях защищенного грунта предполагает наличие повышенного инфекционного фона вследствие высоких влажности и температуры. В связи с этим, во избежание инфицирования продукции, проводят частую обработку пестицидами. То есть в условиях защищенного грунта невозможно отследить подверженность пеларгонии заболеваниям при естественном инфекционном фоне. И всё же на фоне обработки химическими препаратами была проведена оценка подверженности растений заболеваниям, а также развития болезни в течение времени.
Во время исследования было выявлено, что доля растений-регенерантов, заразившихся вертициллёзным увяданием, колебалась в пределах 5,4–18,9% в зависимости от сорта; в то время как у контроля подверженность данному заболеванию была выше и составила 16,2–45,9% (табл. 29).
При сравнении пораженности пеларгонии королевской серой гнилью и вертициллёзом – и регенеранты, и контроль были менее подвержены грибам рода Botrytis, чем грибу Verticillium dahliae. Внутри каждого сорта доля зараженных серой гнилью растений-регенерантов была ниже (до 8,1%) доли зараженных контрольных растений (до 18,9%), как и в случае с вертициллёзным увяданием.
В зависимости от сорта пеларгонии королевской изменялась степень восприимчивости растений к фитопатогенам. Наименее восприимчивыми к болезням оказались образцы сорта Шоко – подверженность регенерантов вертициллезному увяданию составила 5,4%, серой гнилью регенеранты данного сорта не поражались. Растения сорта Лотос ввиду своих морфологических особенностей были наиболее восприимчивы к болезням: доля регенерантов, зараженных вертициллёзом составила 18,9%, серой гнилью – 5,4%.
Анализируя вышеизложенные данные, пришли к выводу о том, что растения пеларгонии королевской, полученные из апексов почек методом клонального микроразмножения, меньше поражались фитопатогенами по сравнению с образцами, выращенными традиционным способом.
Таким образом, при оценке растений-регенерантов по основным морфологическим, фенологическим и хозяйственно-ценным признакам выявлено их соответствие исходным образцам. Растения, сформировавшиеся в культуре in vitro, обладали характерными для данного конкретного сорта морфологическими признаками, в ряде случаев превосходя контроль по количественным показателям. Также отмечено более раннее наступление фенофаз и более высокая продуктивность цветения у регенерантов. Посадочный материал, полученный методом клонального микроразмножения, является оздоровленным в связи с меньшей степенью поражения растений-регенерантов вертициллёзным увяданием и серой гнилью.