Введение к работе
Актуальность проблемы. Роль ДНК-технологий в современных сельскохозяйственных науках трудно переоценить. Несомненно, в значительной мере эта роль касается селекции, изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов. Но кроме обозначенных вопросов с помощью ДНК-технологий можно решать и прикладные задачи, такие как определение подвидовой принадлежности и генетической близости различных сортообраз-цов. Даже агротехнические проблемы могут быть решаемы с помощью ДНК-технологий, которые посредством изучения фундаментальных вопросов могут повысить эффективность агротехнических приёмов.
В частности, ввиду высокой актуальности проблемы засоренности производственных посевов риса краснозерными формами для ее решения необходим комплексный научно-производственный подход, который предполагает глубокое знание генетических причин возникновения краснозерности. Особое значение здесь приобретает технология молекулярного маркирования.
Разработка методики идентификации гена окраски перикарпа риса Re позволит проводить скрининг генетической плазмы для выявления краснозерных растений на любом этапе селекционно-семеноводческой программы вне зависимости от фазы онтогенеза растений.
Разделение растений риса на подвиды indica и japonica является, несомненно, важным, но не всегда однозначным вопросом для селекционеров. Споры о подвидовой принадлежности некоторых сортов риса ведутся давно. Этот вопрос усложняется наличием растений, относящихся к промежуточной группе. Распространенные методы идентификации подвидов риса indica и japonica весьма сложны, комплексны и результаты их не всегда однозначны. В ряде работ можно найти расхождение в результатах при дифференциации сортообраз-цов на подвид indica или japonica различными методами, связанными только с фенотипическим проявлением признака.
Информативные для подвидовой идентификации молекулярные маркеры могут позволить быстро и эффективно ранжировать родительские формы риса и гибридное потомство на подвиды indica или japonica.
Цель и задачи исследований.
Целью данного исследования являлась разработка методологических подходов использования молекулярно-генетических методов для идентификации краснозёрных форм и дифференциации генотипов риса на подвиды indica/japonica.
В проводимых исследованиях были поставлены следующие задачи.
Выявить полиморфизм гена красной окраски перикарпа риса Re и разработать праймерные пары, выявляющие аллельный полиморфизм при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определить порог чувствительности созданных аллельспецифичных праймеров к гену Re при проведении ПЦР-анализа при различном соотношении ДНК образцов красно- и белозёрного риса в одной пробирке.
Провести изучение аллельного состояния гена Re с помощью разработанной маркерной системы у растений трёх сортов риса в питомнике испытания потомств первого года (первичные звенья семеноводства).
Провести попарное сравнение аллельного состояния микросателлит-ных локусов ДНК растений белозёрных сортов риса и их краснозёрных форм (КФ) и определить степень генетической близости изученных образцов.
Изучить генетическое разнообразие референсных сортообразцов подвидов indica и japonica коллекции ВНИИ риса, используя микросател-литный анализ и определить корреляцию между аллельным состоянием микросателлитных локусов ДНК и подвидовой принадлежностью изученных сортообразцов.
Научная новизна исследований.
— Разработан кодоминантный молекулярный маркер к гену красной окраски перикарпа риса Re и сопряжённая с ним методика упредительного выявления краснозёрной примеси в посевах риса.
Впервые изучен феномен появления краснозёрных форм белозёрных сортов в семеноводстве и при производственном выращивании риса на основе молекулярно-генетического подхода. Молекулярными методами продемонстрировано, что переопыление белозёрных растений краснозёрными сорно-полевыми формами риса следует считать основной причиной возникновения краснозёрных форм.
Впервые проведён поиск приоритетных для подвидовой идентификации риса аллелей 30 микросателлитных локусов ДНК среди образцов коллекции ВНИИ риса. Выявлены аллели, приоритетные для подвидов indica и japoni-са, соответственно.
Научно-практическая ценность работы.
— На основе созданного в рамках исследования ПЦР-маркера гена
красной окраски перикарпа зерновки риса Re разработана упредительная
методика выявления краснозёрной примеси в посевах первичных звеньев
семеноводства риса до фенотипического проявления признака краснозёрно-
сти, позволяющая элиминировать нежелательные генотипы из дальнейшего
размножения на ранних стадиях онтогенеза растений.
В ходе молекулярно-генетического анализа выявлена основная причина возникновения краснозёрных форм белозёрных сортов в производственных посевах риса - переопыление сорно-полевыми краснозёрными формами, а не мутации, смещающие рамку считывания гена окраски перикарпа, как предполагалось ранее. В этой связи агротехнические приёмы удаления с рисовых полей сорняков следует считать приоритетными в борьбе с сорно-полевыми формами риса.
С помощью выявленных в ходе исследования приоритетных для подвидов indica и japonica аллелей микросателлитных локусов ДНК представляется возможным проводить ранжирование сортообразцов на подвиды indica и japonica в селекционном процессе, основываясь не только на данных морфотипа.
Положения, выносимые на защиту.
Молекулярный маркер для идентификации аллельного состояния гена красной окраски перикарпа риса Re.
Методика ранней диагностики краснозёрной примеси в посевах риса, основанная на применении созданного молекулярного маркера.
Обоснование причин возникновения краснозёрных форм белозёрных сортов риса на основе молекулярно-генетического подхода.
Микросателлитные молекулярные маркеры, информативные для идентификации indica/japonica сортообразцов растений рода Oryza.
Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования были доложены и одобрены на заседаниях методического совета ВНИИ риса в 2007 - 2010 гг., а также были представлены на международной научно-практической конференции «Селекция сортов риса, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, для стран умеренного климата и Центральной Азии» (Краснодар, 27-29 августа 2008 г.); XVII международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция. Охрана природы. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 13-21 сентября 2008 г.); IX молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2009 г.); V московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2009 г.); конкурсе молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу (Москва, 16-20 марта 2009 г.); 14 международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); 15 международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 г).
Публикации результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, рекомендаций селекционной практике и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включающих 17 таблиц и 31 рисунок. Список использованной литературы включает 171 источник, в том числе 151 - иностранных авторов.
