Электрофизический анализ и физиолого-биохимические особенности клеточных повреждений ионами тяжелых металлов Хасанова, Лилия Анасовна

Введение к работе

Актуальность темы. Среди антропогенных воздействий,

оказывающих давление на экологическую структуру Земли особое место занимают тяжелые металлы, техногенное накопление которых в окружающей среде идет высокими темпами. В следовых количествах тяжелые металлы - микроэлементы необходимы для всех форм жизни. Их большая физиологическая значимость не только научно доказана, но и повсеместно используется в практике сельского хозяйства. С увеличением концентрации тяжелые металлы становятся высокотоксичными, поскольку обладая большим сродством к физиологически важным органическим соединениям, нарушают процессы метаболизма, нормального роста и развития живых организмов (Альберт, 1989; Ершов, Плетнева, 1989; Литвин, Чубуков, 1989; Ильин, 1991; Littlfield, Poirier, 1994;Corbellaetal, 1996).

На появление избыточного количества тяжелых металлов наиболее
чутко реагирует почвенная биота и прежде всего микроорганизмы.
Микробные сообщества в ряду быстро сменяющихся поколений
реактивно отвечают на повышенные концентрации тяжелых металлов
количественными и качественными перестройками в своей структурно-
функциональной организации (от деструкции отдельных элементов до
элиминации сообщества в целом) (Щеповских и др., 1995). Высокая
чувствительность почвенных микроорганизмов к тяжелым металлам,
особенности клеточной организации, разнообразие биосинтетических и
катаболических реакций, а также широкое участие этой группы
педобионтов в поддержании естественного статуса и плодородия почвы
посредством осуществления процессов, связанных с накоплением
органического вещества и его трансформации, делает микробные клетки
незаменимыми для изучения механизмов повреждающего действия
тяжелых металлов, использования их в качестве индикаторных систем в
нормировании техногенного поступления соединений тяжелых

металлов, а также для разработки надежных методов детоксикации этого класса веществ.

К настоящему времени накоплен обширный фактический материал, посвященный изучению реакций микроорганизмов на действие тяжелых металлов, который касается как отдельных показателей, определяющих их токсические эффекты, так и процессов жизнедеятельности микробных клеток (различных сторон метаболизма, структурной организации и адаптивных ответов) в присутствии этого класса токсикантов. Однако не нашли своего отражения вопросы кратковременных сублетальных повреждений (токсический шок) ионами тяжелых металлов и, в этой связи, соотношения специфичности и неспецифичности реакций микробных клеток на данный экстремальный фактор, механизмов изменения первичной устойчивости клеточных функций и репарации

сублетальных повреждений, как часть общей проблемы возникновения клеточных повреждений в результате различных экстремальных воздействий.

Необходимо отметить, что современные концепции механизмов клеточных повреждений недооценивают эффекты, связанные с изменениями электрических свойств клеток, хотя эти изменения, выходящие за пределы эволюционно сложившихся физиологических норм, могут приводить к существенному снижению функциональной активности и нарушению структурной организации микроорганизмов, в частности, к изменению клеточной поверхности, целостности мембран, отдельных белковых комплексов, при этом часто игнорируется интегральный многофакторный анализ, привлекающий приемы и методы смежных научных дисциплин. На сегодня при решении теоретических вопросов наметилась тенденция к переходу от биохимических подходов (изучение строения и состава клеток на молекулярном уровне) к биофизическому - построению моделей клеток с учетом параметров среды (Мирошников и др., 1986). В настоящей работе впервые предпринята попытка объединения этих подходов и проведения исследований клеточных повреждений ионами тяжелых металлов посредством совместного изучения электрофизических характеристик и физиолого-биохимических процессов у различных в систематическом отношении групп микроорганизмов: цианобактерий, пурпурных бактерий, псевдомонад и микобактерий, принимающих активное участие в почвообразовании, минерализации органических соединений и утилизации антропогенных загрязнений. Сопоставление реакций этих микроорганизмов с общим индикатором загрязнения -гетеротрофной грамотрицательной бактерией Escherichia coli на действие тяжелых металлов, как весьма опасных, наряду с пестицидами и радионуклидами, экотоксикантов, имеет принципиальное значение в экологическом прогнозировании поведения данной группы поллютантов в системе почва- агро- и биоценоз.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов повреждающего действия Ag⁺, Cd⁺², Со⁺², Cu⁺², Fe+², Mg+², Ni+², Pb⁺², Zn+², A1+³, Cr⁺³, Fe⁺³, Ga+³, Gd⁺³, La⁺³ на клетки цианобактерий Anacysiis nidulans, Synechocystis aquatilis, несерных пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, грамотрицательных гетеротрофных бактерий Escherichia coli, Pseudomonas fluorantice, грамположительных гетеротрофных бактерий Bacillus sublilis, Mycobacterium phlei в связи с исследованиями специфики структурной и физиолого-биохимической интеграции микробной клетки в экстремальных условиях окружающей среды.

Для этого были сформулированы следующие задачи:

1. Проведение системного анализа и обобщение фактического материала по изучаемому вопросу;

1. Определение параметров и критериев оценки повреждения микробных клеток ионами тяжелых металлов в повышенных концентрациях при их кратковременном сублетальном воздействии (токсический шок); изучение условий репарации возникших повреждений, установление специфичности токсического шока ионами тяжелых металлов; выявление устойчивости клегок к последующим экстремальным воздействиям.

2. Исследование электроповерхностных характеристик и свойств цнтоплазматической мембраны микробных клеток при обработке ионами тяжелых металлов в зависимости от физико-химических показателей (рН, осмотическая реакция, наличие конкурирующих катионов, вид аниона, зарядность), а также систематического положения микроорганизмов.

4. Изучение физиолого-биохимических характеристик
(фотосинтетическая активность, дыхание, скорость роста, синтез
стрессовых белков), морфологии и ультраструктуры, поврежденных
ионами тяжелых металлов клеток.

Проведение сопоставительного электрофизического и биохимического анализа повреждений микробных клеток одно-, двух-, трехзарядными катионами тяжелых металлов.

5. Поиск и разработка методов экспресс-анализа и биологической
индикации загрязнения окружающей среды соединениями тяжелых
металлов.

Научная новизна. Впервые применен комплексный

электрофизический анализ (изучение электрофоретической подвижности,
электроориентационных и электрооптических эффектов клеток) и
физиолого-биохимическое исследование кратковременного

сублетального повреждающего действия широкого спектра ионов
тяжелых металлов для представителей различных систематических групп
микроорганизмов (цианобактерии, кесерные пурпурные бактерии,
гетеротрофные грамположительные и грамотрицательные

микроорганизмы) при вариации физико-химических параметров среды и учета изменяющихся при этом свойств тяжелых металлов.

Впервые показана корреляция между экстремальными изменениями электроповерхностных свойств клеток и повреждениями цнтоплазматической мембраны, зависящая от значения рН, присутствия гидролизованных форм металлоионов и исходных электрических свойств бактерий. В случае рН образования однозарядных гидролизованных форм металлоионов обнаружена их поверхностная адсорбция и проникновение к цнтоплазматической мембране клеток. Впервые проведен анализ электрических свойств фототрофных бактерий (цианобактерии и пурпурные бактерии) и установлена зависимость ответных реакций микробных клеток на повреждающее действие ионов тяжелых металлов от систематического положения микроорганизмов.

Показано изменение в составе растворимой фракции полипептидов микроорганизмов в процессе повреждения металлоионами, при этом обнаружен синтез новых полипептидов (стрессовых белков) - белков токсического шока. На основе полученных экспериментальных данных и обобщения теоретического материала предложен один из возможных механизмов повреждающего действия ионов тяжелых металлов на микроорганизмы, обусловленный как физико-химической природой ионов тяжелых металлов и параметрами среды, в которых они находятся, так и особенностями биологической организации изученных микробных клеток.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований дополняют сведения о физиологии почвенных микроорганизмов. Полученные данные могут быть использованы в системе долгосрочного контроля (мониторинга) за процессами, происходящими в почвенных биоценозах, подверженных токсическому влиянию тяжелых металлов, при экологическом нормировании, индикации и прогнозировании поведения этой группы токсикантов, биологической деструкции соединений тяжелых металлов, а также биологической рекультивации загрязненных ими почв.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на V Межвузовской конференции молодых ученых "Современные проблемы молекулярной и клеточной биологии" (Ленинград, 1987), Всесоюзной конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1987), рабочем совещании по систематике и биологии цианобактерий (Ленинград, 1988), заседании кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ЛГУ (Ленинград, 1988), научно-практической Региональной конференции "Электрофорез клетки" (Уфа, 1989), заседании кафедры ФЧЖ Башкирского государственного университета (Уфа, 1991), на Межвузовском научном семинаре "Принципы адаптации живых систем" (Уфа, 1992), VI координационном семинаре-совещании преподавателей физиологии растений (Смоленск, 1993), семинаре научного факультета Реймского университета (Reims, France, 1993), III Международном симпозиуме "Металлоионы в биологии и медицине (Montreal, Canada, 1994), V Международном Comtox-симпозиуме по токсикологии и клинической химии металлов (Vancouver, Canada, 1995), IX Международном NC1-EORTC симпозиуме (Amsterdam,: The Netherlands, 1996), IV Международном симпозиуме "Металлоионы в биологии и медицине" {Barcelona, Spain, 1996).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 34-х печатных работах, из них 4 монографии.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы по современному состоянию проблемы (глава I), описания методики исследования (глава II), результатов и