Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Значение яблони как плодовой культуры, основные задачи и направления в современной селекции яблони 10
1.2. Парша яблони 11
1.3 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем 17
1.4 Молекулярно-генетические методы в изучении устойчивости яблони к парше 23
1.5 Изучение генетического разнообразия яблони 30
1.6 Молекулярно-генетический полиморфизм гена самонесовместимости в пределах вида Malus domestica 35
2 Условия, материал и методика проведения исследований 41
2.1 Условия проведения и материал исследований 41
2.2 Молекулярные маркеры, использованные в работе 42
2.3 Методы исследований 44
2.4 Статистическая обработка данных 48
3 Экспериментальная часть 49
3. 1 Апробация методов экстракции ДНК 49
3.2 Идентификация генов Vf и Vm у отечественных сортов и селекционных форм яблони 52
3.3 Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена Vf иммунитета яблони к парше 59
3.4 Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости в сортах яблони 63
3.5 Исследование полиморфизма микросателлитных локусов сортов яблони отечественной селекции 82
Заключение 106
- Парша яблони
- Изучение генетического разнообразия яблони
- Молекулярные маркеры, использованные в работе
- Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена Vf иммунитета яблони к парше
Введение к работе
Актуальность темы исследований. Применение ДНК-технологий в селекции и генетике сельскохозяйственных культур позволяет значительно расширить область научных исследований: от изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов до защиты авторских прав селекционеров и продукции растениеводства от фальсификации, а также определение её качества и генетической чистоты.
Возможности ДНК-маркеров превосходят потенциал изоферментов
и запасных белков. В связи с тем, что применение молекулярных
маркеров не зависит от фенотипа растения, этапа вегетационного
периода, и их использование позволяет напрямую характеризовать
генотип, они приобретают все большую ценность при оценке степени
генетического разнообразия, а также в исследованиях, направленных на
идентификацию генов, участвующих в детерминации хозяйственно-
ценных признаков. Особенно актуально использование ДНК-маркеров
при идентификации генов устойчивости к заболеваниям, т. к. оно
отменяет необходимость проведения фитопатологической оценки
образцов.
Ввиду высокой вредоносности парши яблони, вызываемой грибным
патогеном Venturia inaequalis (Cooke)G. Winter, актуально ускоренное
создание сортов, иммунных к данному заболеванию. Решение этой задачи
невозможно без глубоких знаний генетических основ устойчивости к
парше. Особое значение здесь приобретает технология ДНК-
маркирования, позволяющая проводить скрининг генетической плазмы яблони на наличие генов устойчивости на любом этапе селекционного процесса вне зависимости от фазы онтогенеза растений.
ДНК-маркеры могут быть использованы как для идентификации целевых генов, так и при изучении генетического разнообразия культурных растений. В этих целях могут быть эффективно использованы микросателлитные маркеры, что обусловлено их локусспецифичностью и значительной аллельной изменчивостью. Чаще всего микросателлитные маркеры используют для дифференцировки растений внутри вида, идентификации сортов, составлении генетических карт и в маркерной селекции, а также в работах по изучению генетического разнообразия и паспортизации сортов культурных растений.
Молекулярные ДНК-маркеры открывают большие перспективы для генетической паспортизации сортов яблони, детального картирования хромосом, изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне и идентификации генов хозяйственно-ценных признаков в селекционном материале.
Цель и задачи исследования. Цель исследований:
совершенствование молекулярно-генетических методов оценки и отбора
исходного материала яблони в селекционном процессе и комплексное изучение генофонда яблони коллекции генетических ресурсов ФГБНУ СКЗНИИСиВ с применением ДНК-маркерного анализа.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Изучить генетическое разнообразие сортов яблони коллекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием полиморфизма микросателлитных локусов ДНК в качестве маркерной системы.
-
На основании данных анализа микросателлитных локусов ДНК составить молекулярно-генетические паспорта сортов яблони отечественной селекции с оценкой уровня общего генетического полиморфизма и степени их генетического родства.
-
Провести скрининг селекционного материала яблони, предоставляемого центром селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием ДНК-маркерного анализа для выявления образцов, несущих гены устойчивости к парше Vf и Vm.
-
Разработать ДНК-маркер для гена устойчивости яблони к парше Vf с целью получения ПЦР-продукта, специфичного для его доминантного аллеля размером 100-150 пар нуклеотидов (п. н.).
5. Выполнить молекулярно-генетическую идентификацию аллелей S2,
S3, S7, S10 гена самонесовместимости у отечественных сортов яблони с
применением ДНК-маркерного анализа.
Научная новизна работы. Выполнена оценка генетического родства сортов яблони отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров. На основании данных, полученных по результатам анализа полиморфизма микросателлитных локусов, составлены ДНК-паспорта изученных сортов яблони.
Идентифицированы гены устойчивости к парше Vf и Vm с применением ДНК-маркерных технологий в сортах и селекционных формах яблони ФГБНУ СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК.
Разработан молекулярный маркер к гену Vf на основании данных о его нуклеотидной последовательности, показана перспективность применения.
Впервые проведена молекулярно-генетическая идентификация аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости в отечественных районированных и перспективных сортах яблони.
На основании данных об аллельных комбинациях гена
самонесовместимости определены группы совместимых и не совместимых при опылении сортов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные с применением микросателлитного анализа данные о степени генетического родства сортов яблони отечественной селекции позволяют повысить качество гибридизации, обеспечить максимальный спектр изменчивости в гибридном потомстве.
Показана перспективность использования ДНК-маркирования для идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm, а также аллелей гена самонесовместимости у сортов и форм яблони отечественной и мировой
селекции. Идентифицированы доминантные аллели генов устойчивости яблони к парше Vf и Vm у сортов и элитных форм яблони селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК. Усовершенствованный ДНК-маркер гена Vf позволяет расширить возможность применения мультиплексной ПЦР при идентификации данного гена устойчивости к парше в сочетании с другими генами хозяйственно-ценных признаков.
Информация об аллельном составе гена самонесовместимости позволит прогнозировать совместимость сортов при опылении, что даст возможность более эффективно формировать сортовые схемы садовых насаждений.
Методология и методы исследований. При планировании и проведении исследований в виде источников информации использовались научные статьи, доклады, книги производственной тематики, электронные ресурсы и другие материалы. При проведении исследований применялся системный подход. Теоретико-методологическую основу исследований составили методы планирования и проведения опытов, лабораторные исследования с применением системного подхода.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Обоснование актуальности формирования ДНК-паспортов сортов
яблони отечественной селекции с применением микросателлитного анализа.
-
Новые данные о степени генетического родства изученных сортов яблони.
-
Методические аспекты идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm. Выявление образцов, несущих доминантные аллели генов устойчивости к парше Vf и Vm.
4. Обоснование данных об аллельных комбинациях гена
самонесовместимости у сортов яблони отечественной селекции и
установление степени совместимости сортов согласно выявленному
аллельному составу S-гена.
5. Усовершенствование ДНК-маркера гена Vf устойчивости к парше,
дополняющего методическую базу и позволяющего расширить область
применения мультиплексной ПЦР в идентификации генов хозяйственно-
ценных признаков яблони.
Апробация результатов исследования. Результаты исследований доложены на ежегодных заседаниях Ученого совета ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии в 2009-2011 гг., III и IV Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2009-2010 гг.), Расширенном заседании Учёного совета по проблемам интенсивного садоводства посвященного 100-летию со дня рождения Гавриила Владимировича Трусевича (Краснодар, 2010 г.).
Публикации результатов исследований. По материалам
исследований опубликовано 17 печатных работ, в том числе (8) из них в изданиях из Перечня, рекомендованного ВАК Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включающих 12 таблиц и 26 рисунков. Состоит из введения, трех глав, выводов, рекомендаций для практической селекции и двух приложений. Список использованной литературы включает 202 источника, в том числе 127 – зарубежных авторов.
Парша яблони
Одной из главных проблем современной селекции яблони считается создание сортов, обладающих наряду с комплексом ценных хозяйственно биологических признаков устойчивостью к патогенам. Самым распространенным на юге России и вредоносным заболеванием яблони является парша [Ефимова И.Л. и др., 2010]. Снижение урожая яблок в нашей стране от поражения паршой составляет не менее 40 %, а в годы массового распространения теряется почти весь урожай [Седов Е.Н. и др., 1983]. Применение химических методов защиты в садах против этой болезни способствует постепенному возникновению резистентности патогенов к используемым препаратам. Возникает необходимость использования новых фунгицидов широкого спектра действия, что приводит не только к загрязнению окружающей среды, уничтожению полезной энтомофауны, но и возникновению угрозы здоровью людей [Смольякова В.М. и др., 2005]. Возделывание устойчивых к парше сортов яблони в комплексе с интегрированной защитой против других вредителей и болезней позволяет снизить затраты на фунгициды почти на 70 % и получать относительно чистую и безопасную для здоровья человека продукцию [Седов Е.Н., 1992].
Одним из первых селекцию иммунных к парше сортов яблони начал американский ученый L.F. Hough в сороковых годах двадцатого века. В штате Иллинойс была скрещена форма яблони M. Floribunda 821 (с геном Vf иммунитета к парше) с сортом Ром Бьюти. Среди полученных сеянцев было равное количество иммунных и восприимчивых к парше. Среди иммунных сеянцев было отобрано два, ставших исходным материалом для широкомасштабной селекционной программы (PRI), развернутой в США, Канаде, Франции и Великобритании [Седов Е.Н., 2007]. В настоящее время в мире создано более 155 сортов с моногенной устойчивостью к парше, которые почти не требуют применения фунгицидов [Савельев Н.И., 2008; Савельева Н.Н. и др., 2008].
В России селекция на олигогенную устойчивость к парше начата в начале 70-х годов на основе использования главных генов устойчивости Vf, Vm и Vr [Ищенко Л.А., 1987]. С 1975 г. во ВНИИСПК под руководством академика Е.Н. Седова проводится работа по селекции сортов яблони, обладающих иммунитетом к парше, с использованием как метода раннего отбора на искусственных инфекционных фонах и приемов ускорения плодоношения гибридных сеянцев, так и новых методик селекции [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. Особый интерес представляет совмещение олигогенной и полигенной устойчивости к парше, а также двух и более главных генов устойчивости в одном генотипе яблони [Седов Е.Н. и др., 1987].
В настоящее время во ВНИИСПК и ФГБНУ СКЗНИИСиВ ведется совместная селекционная программа по созданию сортов яблони с более стабильной, долговременной устойчивостью яблони к парше с применением молекулярно-генетических методов ДНК-маркирования, позволяющих проводить исследования на высоком научно-методическом уровне [Супрун И.И. и др., 2009, 2011; Ульяновская Е.В. и др., 2011, 2012]. Постоянное наблюдение за многообразием форм и непрерывной изменчивостью возбудителя парши яблони является необходимым условием для продуктивной селекции устойчивых к данному заболеванию сортов яблони [Ефимова И.Л. и др., 2012]. Возбудитель парши яблони Venturia inaequalis (Cooke) G. Winter относится к классу Сумчатые грибы (Ascomycetes), подклассу Локулоаскомицеты (Loculoascomycetidae), порядку Дотидеальные (Dothideales), семейству Вентуриевые (Venturiaceae), роду Venturia [Барсукова О.Н., 1985].
С помощью стандартных сортов-дифференциаторов яблони выявлено 19 генных пар (локусов), контролирующих патогенность клонов гриба [Williams E.B. et al., 1969]. Каждая пара состоит из аллели вирулентности Р+ (Р1+ , Р2+ и т. д.), вызывающий на том или ином сорте (или группе сортов) обильное спороношение гриба (реакция «поражение») и аллели авирулентности Р (Р1, Р2 и т. д.), вызывающей на том же сорте (сортах) хлоротические и некротические пятна без спороношения или с очень слабым спороношением патогенна (реакция «пятно»). Каждый клон (физиологическая раса, биотип) гриба отличается своим, только ему присущим набором аллелей вирулентности и авирулентности [Бондарь Л.В., 1981]. Частота встречаемости тех или иных генов вирулентности и определяет различия по вирулентности популяций и биотипов гриба [Седов Е.Н. и др., 1983].
Изучение генетического разнообразия яблони
Для экстракции ДНК использовали ЦТАБ-метод, придерживаясь следующей схемы: образцы растительной ткани яблони вносили в микропробирки и растирали с прогретым до 60 С 2-кратным ЦТАБ-буфером, содержащим 2 % ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид), 1,4 M хлористого натрия, 0,1 M Трис-гидрохлорид, 20 мМ ЭДТА (этилендиаминотетраацетат). При этом соблюдали соотношение 500 мкл буфера на 0,1 г ткани. Образцы инкубировали 3 часа при 60 С, после чего вносили равный объем хлороформа и инкубировали при перемешивании в течение 20 минут. На следующем этапе образцы центрифугировали 10 минут при 5000 об-1, отбирали супернатант, добавляли к нему 0,2 объема 5-кратного ЦТАБ-буфера, содержащего 5 % ЦТАБ и 350 мМ ЭДТА и инкубировали 10 минут при 60 С. После инкубации в пробирки с образцами вносили равный объем хлороформа и инкубировали при перемешивании 20 минут, центрифугировали 10 минут при 5000 об-1, в чистую пробирку отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объем буфера для преципитации (1 % ЦТАБ, 50мМ Трис-гидрохлорид, 10мМ ЭДТА) и оставляли на ночь при комнатной температуре. После преципитации ДНК, осадок растворяли в 500 мкл солевого буфера (1 М хлористый натрий, 10 мМ Трис-гидрохлорид, 1 мМ ЭДТА), добавляли 1 см3 этилового спирта (96 %) и оставляли при -20 С на 2-3 часа. По истечении этого времени, центрифугировали образцы 10 минут при 13000 об-1, затем промывали осадок этиловым спиртом (70 %), высушивали и растворяли в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Экстракцию проводили согласно методике, а также в модификации, включающей дополнительную очистку проб [Doyle J.J. et al., 1987; Murray M.G. et al., 1980; Rogers S.O. et al., 1985].
Для экстракции ДНК с применением сорбентного метода использовали коммерческие наборы «Diatom mini prep 200» согласно инструкции, производимые ООО «БИОКОМ», г. Москва.
ПЦР проводили по стандартным методикам с выполнением предварительной оптимизации ряда параметров, таких как температура отжига праймеров, длительность циклов отжига праймеров и элонгации, общее количество циклов, концентрация дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймеров.
Амплификацию осуществляли наборами для проведения ПЦР (Сибэнзим, г. Новосибирск, Россия) в реакционном объеме 25 мкл. Параметры ПЦР смеси: в 25 мкл смеси содержится 40-50 нг ДНК, 0,25 мкM dNTPs (дезоксинуклеотидтрифосфат), 0,2 мM каждого праймера; 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 2,5 мM MgCl2, 1 единица Taq-полимеразы. ПЦР-программу проводили по следующим схемам:
1. Идентификация гена Vf: 3 минуты при 94 С – начальная денатурация, далее 35 циклов: 1 минута денатурация при 94 С, 1 минута отжиг праймеров при 56 С, 1 минута синтез при 72 С; последний цикл синтеза 5 минут при 72 С (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM).
2. Идентификация гена Vm: 3 минуты при 94 С – начальная денатурация, далее 35 циклов: 1 минута денатурация при 94 С, 1 минута отжиг праймеров при 58 С, 1 минута синтез при 72 С; последний цикл синтеза 5 минут при 72 С (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM).
3. Идентификация аллелей S-гена: 5 минут при 94 С – начальная денатурация, далее 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94 С, 40 секунд отжиг праймеров при 60 С, 30 секунд синтез при 72 С; последний цикл синтеза 5 минут при 72 С (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM).
4. Амплификация с SSR-маркерами: 5 минут при 94 С – начальная денатурация, далее 30-33 цикла в зависимости от маркера: 30 секунд денатурация при 94 С, 30 секунд отжиг праймеров при 60 С (температуру отжига праймеров подбирали индивидуально для праймерных комбинаций), 30 секунд синтез при 72 С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72 С (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM).
ДНК-амплификацию проводили в амплификаторе Терцик производства НПО ДНК-технологии (Россия) и Eppendorf Mastercycler gradient (Германия).
Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР, полученных с ДНК-маркером гена Vf использовали 8%-ный акриламидный гель, а также 2%-ный агарозный гель на основе 0,5-кратного Трис-боратного буфера (0,045 M Трис, 0,045 M Борной кислоты, 1 мM ЭДТА, рН=8,2). Для анализа полиморфизма маркера гена Vm и при микросателлитном анализе использовали 8%-ный полиакриламидный гель на основе 1-кратного Трис-боратного буфера (0,09 M Трис, 0,09 M Борной кислоты, 2 мM ЭДТА, рН=8,2). Полимеризацию геля проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. В качестве катализаторов полимеризации использовали ТЕМЕД и аммония персульфат, из расчета 40 мкл ТЕМЕДа (100% раствор) и 350 мкл аммония персульфата 10%-ного на 40 см3 раствора геля. Электрофорез проходил при напряжении 120 V в течение 30 минут в камерах для горизонтального электрофореза SE-2 и SE-3, а также при напряжении 220 V в течение 240 минут в камерах для вертикального электрофореза VE-3 фирмы Хеликон (Москва).
После окончания полимеризации лунки геля промывали электродным буфером (1-кратный Трис-боратный буфер) и проводили предварительный электрофорез без внесенных образцов, для удаления из геля остатков катализаторов и незаполимеризовавшегося акриламида, при напряжении 150 V, в течение 1 часа.
Для электрофореза использовали 12 мкл реакционной смеси, которую смешивали с 1 мкл неденатурирующего буфера нанесения (40 % сахароза, 0,025 % бромфеноловый синий, 0,025 % ксилен цианол) и наносили в лунки геля под слой электродного буфера.
После проведения электрофореза гелевые пластины помещали на 20 минут в раствор бромистого этидия (5 мкг/см3), и фотографировали в УФ-спектре.
Для предварительной проверки концентрации ДНК в выделенных пробах использовали метод разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 2%-ном агарозном геле, содержащем 1 мкг/см3 бромистого этидия и визуализацией в УФ-спектре. При этом исходили из того, что порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК [Остерман Л.А., 1981]. При постановке ПЦР на одну реакцию оптимальным было определено количество ДНК 40-50 нг. Размер аллелей определяли путем сравнения со стандартным образцом – pBR322/BsuR I (Хеликон, Россия).
Фрагментный анализ SSR-маркеров проводили на автоматическом генетическом анализаторе-секвенаторе ABI Prism 3110. 2.4 Статистическая обработка данных
При оценке результатов микросателлитного анализа матрица генетических дистанций была построена с использованием коэффициентов (индексов) подобия по M. Nei и W. Li (1979) [Nei M. et al., 1979]. Кластерный анализ выполнен методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPGMA) и методом ближайших соседей (NJ), с использованием FreeTree Application 0.9.1.50 (ZDAT v.o.s.). Графическое построение дендрограммы проведено в программе TreeView (Win32) 1.6.6. Фактическая (Ho) и ожидаемая (He) гетерозиготность, эффективное число аллелей (Na) рассчитаны в соответствии с Martines et al. (2006) с использованием программы GenAlEx 6.3 [Martinez L.E. et al., 2006].
Молекулярные маркеры, использованные в работе
Одно из наиболее перспективных направлений применения микросателлитных маркеров при работе с генетическими ресурсами растений – это определение структуры коллекций и степени генетического сходства, а также идентификация и ДНК-паспортизация образцов коллекции и решение спорных вопросов авторства сортов растений. На сегодняшний день микросателлитные ДНК-маркеры являются наиболее распространенным типом ДНК-маркерных систем, используемых в данных исследованиях.
Идентификация и паспортизация сортов может выполняться на основании информации об аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого сорта.
В связи с высокой степенью полиморфизма SSR-маркеров был использован относительно небольшой набор микросателлитных маркеров – 12, являющийся достаточным для оценки уровня полиморфизма в исследуемой выборке генотипов согласно данным, полученным в иностранных работах по изучению генетического разнообразия яблони.
Немаловажными критериями при отборе микросателлитных маркеров для изучения обширного генофонда, являются уровень аллельного полиморфизма, выявляемого по каждому из локусов при анализе целевой генплазмы, и высокое «качество» амплификации, позволяющее наиболее эффективно и достоверно проводить анализ их полиморфизма. Кроме того, при первоначальном отборе маркеров учитывается уровень полиморфизма, идентифицированный у них при анализе мирового генофонда, а также позиция на генетической карте вида – наиболее оптимально использовать набор SSR-маркеров, равномерно распределенных по геному.
При апробации отобранных 12 микросателлитных маркеров был оптимизирован ряд экспериментальных параметров. В результате проведенных лабораторных исследований была определена следующая схема полимеразной цепной реакции: 5 минут при 94 С – начальная денатурация, следующих 30-33 цикла в зависимости от маркера: 30 секунд денатурация при 94 С, 30 секунд отжиг праймеров при 60 С, 30 секунд синтез при 72 С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72 С. Температуру отжига праймеров подбирали индивидуально для праймерных комбинаций [Супрун И.И. и др, 2011]. В качестве стандарта при отработке экспериментальных параметров ПЦР использовали ДНК сорта яблони Прима и Голден Делишес в связи с наличием литературных данных о размере фрагментов по SSR-локусам, использованным в работе.
В ходе апробации SSR-маркеров выявили, что для некоторых маркеров при указанных выше параметрах ПЦР, наблюдался более высокий уровень синтеза целевых фрагментов по отношению к другим маркерам. Примером могут служить SSR-маркеры CH02с06 и CH01F03b – рисунки 12 и 13 соответственно. Очевиден более высокий уровень синтеза целевых продуктов по маркеру CH02с06 в сравнении с маркером CH01F03b, который характеризуется оптимальным уровнем синтеза целевых фрагментов. Однако, данное обстоятельство в дальнейшем не создавало затруднений при интерпретации результатов фрагментного анализа на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 3130 как по указанным, так и по остальным SSR-маркерам. Следует отметить, что сорта-триплоиды Родничок, Союз, Зефир использовали на этапе апробации маркеров. В выборку сортов для SSR-генотипирования, в дальнейшем были включены сорта только с диплоидным геномом.
Микросателлитные ДНК-маркеры были сгруппированы в мультиплексные наборы (3-4 маркера в наборе) для одновременного анализа по нескольким локусам. При этом диапазон размеров амплифицируемых фрагментов SSR-маркеров не перекрывался, что необходимо для их эффективной идентификации. При этом для каждого из маркеров применяли разные флуоресцентные красители (FAM, TAMRA, R6G, ROX).
В результате выполнения фрагментного анализа на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 были получены четкие, воспроизводимые результаты. Следует отметить, что такой тип анализа полиморфизма микросателлитных локусов позволяет получить данные об их размере с точностью до одного нуклеотида. Полученная информация является наиболее точной для составления ДНК-паспортов генотипов (сортов, клонов, селекционных форм).
На рисунке 14 в качестве примера проиллюстрированы результаты электрофоретического анализа с использованием метода капиллярного электрофореза на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 (результаты представлены в рабочем окне программы GeneMapper 4.0).
Фрагментный электрофоретический анализ ДНК сорта яблони Красный Янтарь по мультиплексному набору, включающему SSR-маркеры CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06. Согласно рисунку 14, в рабочем окне программы GeneMapper 4.0 показаны результаты электрофоретического анализа для четырех микросателлитных маркеров: CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06. Два пика представлены для маркеров, по локусам которых выявлено два продукта – следовательно, локусы гетерозиготны. В данном случае это маркеры CH01h01, CH01f03b и CH02c06. По локусу CH01h10 идентифицирован один пик на электрофореграмме, что говорит о его гомозиготности.
На рисунках 15-16 представлены результаты электрофоретического анализа ДНК четырех сортов яблони отечественной селекции: Золотая корона, Имрус, Старт и Болотовское по мультиплексному набору, включающему SSR-маркеры CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06, на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 в двух рабочих окнах программы GeneMapper.
Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена Vf иммунитета яблони к парше
Результаты кластеризации в целом отражают генетическую разнородность и происхождение сортов из изученной выборки. Это выражается в одновременном присутствии как явно выделяющихся кластеров и наличии кластеров, включающих всего два генотипа или выделение отдельных генотипов в отдельную ветвь кластера (сорт Свежесть), так и кластеров второго порядка со сложной структурой, которые состоят из последовательно включаемых в кластер отдельных генотипов. В такой кластер входят сорта Персиковое, Маяк станичный, Ноктюрн, Любава, Василиса, Кубань спур, Кармен, Болотовское, Юнона. Данные сорта входят в один кластер с сортами Талида, КВ Зарево, Золотая корона. При этом объединение их идет на таких же дистанциях генетического сходства, как и разделение ряда некоторых кластеров сортов – около 0,1. Это соответствует информации о происхождении данных сортов (таблица 12).
Сорт Свежесть (Антоновка краснобочка PR12T67 (Уэлси F2 M. floribunda), расположенный на отдельной ветви кластера, как и выделенные в отдельный кластер, хотя и со значительной генетической дистанцией между ними, сорта Имрус (Антоновка обыкновенная OR18T13) и Зимнее утро (Либерти Скарлет Стаймаред) имеют происхождение от сортов, не представленных в родительских формах ни у одного из изученной выборки.
Также достоверность данных, полученных при кластеризации, подтверждается объединением в один кластер сортов Афродита, Старт, Солнышко, Юбилей Москвы и Строевское, которые имеют общую материнскую форму 814 (M. floribunda Голден Делишес). Кроме того, видно, что в один кластер были объединены сорта Талисман, Амулет, Красный янтарь, Фортуна, Рассвет, из которых все, за исключением сорта Фортуна, происходят из гибридной комбинации Редфри Папировка тетраплоидная.
Как видно из результатов кластеризации (рисунок 26, таблица 12) затруднительным представляется определение несколько крупных кластеров, объединяющих все изученные генотипы. Очевидной причиной этого могут являться следующие факторы: – присутствие нескольких небольших групп сортов (по 5-6), имеющих общие родительские формы (как одну из родительских форм, так и обе, в ряде случаев); – разное генетическое происхождение родительских форм сортов из изученной выборки; – наличие ряда сортов (КВ Зарево, Имрус, Зимнее утро, Свежесть), имеющих в качестве родительских форм уникальные сорта, не повторяющиеся в генеалогии ни у одного из остальных сортов изученной выборки; – родительские формы некоторых изученных сортов имеют в своем происхождении сорта, являющиеся прямыми родителями других сортов из изученной выборки.
Такая сложная структура дендрита и невозможность однозначного распределения сортов яблони на несколько крупных кластеров было отмечено и ранее в ряде работ, посвященных изучению генетического разнообразия яблони [Шамшин И.Н. и др., 2013; Hokanson S.C. et al., 1998; Silfverberg Dilworth E. et al., 2006]. Есть предположение, что формирование кластеров с высокой достоверностью затруднено в связи с наличием большого количества уникальных и редких аллелей среди изучаемых генотипов яблони, а также наблюдаемым высоким полиморфизмом анализируемых SSR-локусов [Шамшин И.Н. и др., 2013].
Факт того, что сорта с одной родословной в большинстве своем объединены в общие кластеры, говорит об объективной оценке и эффективности использования SSR-маркеров в этих целях. Возможность различать генетически близкие сорта, полученные в результате гибридизации одной родительской пары, также подтверждает перспективность использования микросателлитов в идентификации сортов, в том числе и с одинаковым происхождением.
В связи с вышесказанным, рекомендуем учитывать результаты кластеризации при планировании селекционной работы. Для получения наибольшей изменчивости в гибридных популяциях не следует использовать сорта, вошедшие в один кластер, в качестве родительских пар при гибридизации. Наряду с этим, данные SSR-генотипирования могут быть использованы в дальнейшем для подтверждения генеалогии сортов и гибридов при возникновении спорных вопросов, в случае если одна или обе их родительские формы входят в перечень изученных нами сортов яблони.
Результаты выполненных исследований нашли отражение в научно исследовательской деятельности Функционального научного центра «Садоводство», что подтверждено соответствующе й справкой о внедрении результатов диссертационной работы.