Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Классическое и молекулярно-генетическое изучение наследования устойчивости капусты к киле (возбудитель - plasmodiophora brassicae WOR.) Подглава
1.1. Общее введение в 23 1
1. P.brassicae Wo г.
1.1.1. Вредоносность и распространение килы в 23
.1.2. Симптомы болезни 24
1.3. Биологическая характеристика P.brassicae 24
1.4. Жизненный цикл патогена в 25
1.5. Защитная реакция растений в 27
расовая дифференциация 1.6. Взаимодействие растение-патоген,
1.1.7. Генетика и селекция на устойчивость к киле капустных культур. 29
1.1.7.1. Генетика и селекция на устойчивость к киле В.гара 29
1.1.7.2. Генетика и селекция на устойчивость к киле B.oleracea 36
1.1.7.3. Генетика и селекция на устойчивость к киле B.napus 39
1.1.7.4. Генетика и селекция на устойчивость к киле Raphanus генов l. и маркеров молекулярных подглава
1.2. Селекционная устойчивости к киле линий эффективность ценность brassica rapa картированных локусов в 43
1.2.1. Введение в 43
1.2.2. Материалы и методы в 45
1.2.2.1. Генетический анализ устойчивости в 45
1.2.2.3. Молекулярный анализ в 47
1.2.3. Результаты и обсуждение 49
1.2.3.1. Гибридологический анализ устойчивости к киле турнепса 49
1.2.3.2. Гибридологический анализ устойчивости к киле капусты
пекинской 52
1.2.3.3. Эффективность маркеров картированных локусов устойчивости
к киле на селекционных популяциях 54
1.2.4. Заключение в 56
1.3. Молекулярное маркирование и генетическое картирование нового локуса устойчивости к киле капусты пекинской brassica rapa L.
1.3.1. Введение в 58
1.3.2. Материалы и методы
1.3.2.1. Растительный материал для генетических исследований 59
1.3.2.2. Выделение ДНК из растений в 60
1.3.2.3. Условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 60
1.3.2.4. Клонирование, секвенирование и анализ продуктов
амплификации ДНК 61
1.3.2.5. Создание молекулярного маркера гена устойчивости к киле... 61
1.3.2.7. Статистический анализ в 62
1.3.3. Результаты и обсуждение 62
1.3.3.2. Конвертация RAPD-маркера 394RAPD430 в SCAR-маркер 64
1.3.3.3. Картирование гена устойчивости в 66
1.3.3.4. Скрининг коллекции образцов капусты пекинской в 67
1.3.4. Заключение в 68
1.4. Библиографический список в 69
1.5. Приложения в 82
ГЛАВА 2. Селекция капусты (brassica oleracea l.) на устойчивость к киле с применением отдаленной гибридизации и in vitro технологии спасения зародышей (embryo rescue) в подглава
2.1. Общее введение в 89
2.1.1. Скрещиваемость видов Brassicaceae 90
2.1.2. Технологии спасения зародышей («embryo rescue») в 92
2.1.3. Соматическая гибридизация в 93
2.1.4.1. Производство стабильных искусственно синтезированных амфидиплоидов 94
2.2.1. Введение в 99
2.2.2. Материалы и методы
2.2.2.1. Растительный материал в 100
2.2.2.2. Посев и выращивание растений в 102
2.2.2.3. Гибридизация в 102
2.2.2.4. Оценка межвидового происхождения гибридов в 102
2.2.2.5. Определение числа хромосом в 102
2.2.2.6. Определение жизнеспособности пыльцы в 103
2.2.2.7. Оценка устойчивости к киле в 104
2.2.2.8. Получение гаплоидов и удвоенных гаплоидов в 104
2.2.2.9. Молекулярное генотипирование в 104
2.2.2.10. Статистический анализ 105
2.2.3. Результаты и обсуждение 105
2.2.3.1. Репо-брюквенный гибрид (B.rapa х B.napus, 2п = 29, ААС) 105
2.2.3.2. Рапс-репо-брюквенный гибрид ((B.napus) х (B.rapa х B.napus)) -РРБ 107
2.2.3.3. Fl-гибридное потомство (РРБ х B.oleracea) 108
2.2.3.4. Беккроссные поколения ВСІ - ВС2 108
2.2.3.5. Беккроссное поколение ВСЗ в 110
2.2.3.6. Беккроссное поколение ВС4 в 113
2.2.3.7. Беккроссное поколение ВС5 в 115 2.2.4. Заключение 119
ПОДГЛАВА 2.3. Интродукция доминантной моногенной устойчивости к киле из r.sativus l. в b.oleracea l 120
2.3.1. Введение в 120
2.3.2. Материалы и методы
2.3.2.1. Растительный материал в 121
2.3.2.2. Культура семяпочек и зародышей в 122
2.3.2.3. Удвоение числа хромосом в 123
2.3.3. Результаты и обсуждение 123
2.3.3.1. Схема передачи гена устойчивости к киле из дайкона в капусту белокочанную 123
2.3.3.2. Морфологические признаки и жизнеспособность пыльцы отдаленных гибридов 125
2.3.3.3. Удвоение числа хромосом в 127
2.3.3.4. Первое беккроссное поколение, ВСІ 127
2.3.3.5. Второе беккроссное поколение, ВС2 в 130
2.3.4. Заключение 131
2.4. Библиографический список в 132
2.5. Приложения в 145
ГЛАВА 3. Проведение исследований и усовершенствование технологии создания линий удвоенных гаплоидов brassica в культуре изолированных микроспор подглава
3.1. Общее введение в 152
3.1.1. Технологии производства удвоенных гаплоидов Brassica 152
3.1.2. Генотипическая зависимость эмбриогенной способности микроспор 154
3.1.3. Генетика эмбриогенной отзывчивости растений Brassica 156
3.1.4. Гибридизация как способ управления отзывчивостью генотипов к культуре микроспор 158
3.1.5. Влияние условий роста донорного растения на эмбриогенную
способность микроспор 158
3.1.6. Повышение эмбриогенной способности микроспор в 159
3.1.8.1. Оптимальная стадия развития эмбриоида в 161
3.1.8.2. Модификация питательных сред в 162
3.1.8.3. Снижение доступности влаги и питательных элементов 162
3.1.8.4. Стимулирующее воздействие на эмбриоиды в 163
3.1.9. Частота диплоидизации в 164
3.1.10. Укоренение и адаптация в 166
ПОДГЛАВА 3.2. Оптимизация элементов технологии культуры изолированных микроспор brassica: повышение эмбриогенной способности микроспор овощных и масличных культур b.rapa 167
3.2.1. Введение в 167
3.2.2. Материалы и методы
3.2.2.1. Растительный материал, условия роста и ухода в 168
3.2.2.2. Изоляция и культивирование микроспор в 170
3.2.2.3. Регенерация растений 171
3.2.2.4. Цитологический анализ в 172
3.2.3. Результаты и обсуждение 172
3.2.3.1. Влияние генотипа донорного растения на формирование и выход эмбриоидов в культуре изолированных микроспор B.rapa ssp 172
3.2.3.2. Стадия развития микроспор и их эмбриогенная способность в зависимости от длины бутона 175
3.2.3.3. Влияние активированного угля на выход эмбриоидов в культуре изолированных микроспор 175
3.2.3.4. Влияние условий подготовки донорных растений на число
микроспор и их эмбриогенную способность 178
3.2.4. Заключение 179
Подглава 3.3. Оптимизация элементов технологии культуры изолированных микроспор brassica: изучение и повышение частоты проращивания/регенерации эмбриоидов в.rap а 183
3.3.1. Введение в 183
3.3.2. Материалы и методы в
3.3.2.1. Растительный материал в 183
3.3.2.2. Условия роста и ухода за растениями в 184
3.3.2.3. Изоляция и культивирование микроспор в 184
3.3.2.4. Регенерация растений 184
3.3.2.5. Статистический анализ в 185
3.3.3. Результаты и обсуждение 185
3.3.3.1. Влияние температуры культивирования эмбриоидов in vitro на частоту регенерации 185
3.3.3.2. Влияние размера бутона на частоту регенерации при культивировании эмбриоидов in vitro 186
3.3.3.3. Влияние продолжительности культивирования эмбриоидов in vitro на частоту регенерации сеянцев 189
3.3.3.4. Влияние питательной среды на регенерационную способность эмбриоидов 191
3.3.3.5. Влияние плотности размещения эмбриоидов in vitro на регенерационную способность 192
3.3.3.6. Влияние генотипа донорного растения на регенерационную способность эмбриоидов 193
3.3.4. Заключение 194
ПОДГЛАВА 3.4. Связь уровня плоидности с числом хлоропластов замыкающих клеток устьиц диплоидных и амфидиплоидных видов brassica 196
3.4.1. Введение 196
3.4.2. Материалы и методы
3.4.2.1. Растительный материал и условия его выращивания 198
3.4.2.2. Оценка влияния температуры на ЧХЗКУ 199
3.4.2.3. Оценка влияния возраста растения на ЧХЗКУ 200
подсчет числа хлоропластов в
200
3.4.2.4. Цитологический анализ
замыкающих клетках устьиц
3.4.2.5. Цитологический анализ - подсчет числа хромосом 200
3.4.2.6. Статистический анализ данных 201
3.4.3. Результаты 201
3.4.3.1. Связь уровня плоидности с ЧХЗКУ у растений В.гара и B.napus 201
3.4.3.2. Связь уровня плоидности с ЧХЗКУ у растений B.oleracea 205
3.4.3.3. Влияние температуры и возраста растения на ЧХЗКУ 209
3.4.4. Заключение 210
3.5. Библиографический список 212
ГЛАВА 4. Проведение исследований и разработка схемы селекции fl-гибридов капустных культур (brassica) на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов 225
4.1. Введение 225
4.2. Продолжительность и сроки подготовки донорных растений капусты пекинской и белокочанной для культуры изолированных микроспор в условиях открытого грунта и теплицы 228
4.2.1. Капуста пекинская (B.rapa ssp. pekinensis) 228
4.2.2. Капуста белокочанная {B.oleracea var. capitatd) 230
4.3. Продолжительность технологии культуры изолированных микроспор
капусты пекинской 231
4.4. Особенности роста и развития растений-регенерантов капусты пекинской при осенней высадке маточников донорных растений 231
4.5. Особенности роста и развития растений-регенерантов капусты пекинской при весеннем посеве донорных растений 232
4.6. Продолжительность технологии культуры изолированных микроспор капусты белокочанной 233
4.7. Особенности роста и развития растений-регенерантов капусты белокочанной при осенней высадке маточников 234
4.8. Схема селекции и семеноводства Fl-гибридов капустных культур на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов 235
4.8.1. I этап - изучение исходного материала, отбор донорных растений 236
4.8.2. II этап - производство линий - удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор 237
4.8.3. III этап - размножение ЛУГ, оценка проявления самонесовместимости, гибридизация в системе топ-кросс и/или диаллельных скрещиваний, испытание 237
4.8.4. IV этап - поддержание и размножение родительских линий, производство семян коммерческого Fl-гибрида 238
4.9. Продолжительность селекционного процесса и последовательность технологических операций 238
4.9.1. Продолжительность селекционного процесса от посева исходного материала до реализации семян Fl-гибрида для двулетней культуры капусты белокочанной на основе самонесовместимости 238
4.9.2. Продолжительность селекционного процесса от посева исходного материала до реализации семян Fl-гибрида на двулетней культуре капусты белокочанной на основе цитоплазматической мужской стерильности 2 4.10. Результаты практической реализации схемы селекции Fl-гибридов капустных культур на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов 240
4.11. Описание Fl-гибридов капусты пекинской и белокочанной 242
4.11.1. Капуста пекинская F1 Мохито в 242 4.11.2. Капуста пекинская F1 Бирюза в 242
4.11.3. Капуста пекинская F1 Маркет в 243
4.11.4. Капуста белокочанная F1 Краут в 2 4.12. Заключение в 244
4.13. Библиографический список в 246
ГЛАВА 5. Проведение исследований и разработка схемы селекции fl-гибридов лука репчатого (allium сера l.) на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов 247
5.1. Введение в 247
5.1.1. Мужская стерильность 248
5.1.2. Гибридное семеноводство на основе мужской стерильности 249
5.1.3. Технология производства удвоенных гаплоидов лука (А.сера L.) гиногинезом 250
5.2. Материалы и методы 252
5.2.1. Растительный материал в 252
5.2.2. Подготовка донорных растений в 253
5.2.3. Сбор и стерилизация цветковых бутонов в 253
5.2.4. Условия культивирования in vitro в 254
5.2.5. Удвоения числа хромосом эмбриоидов в 254
5.2.6. Проращивание и адаптация в 254
5.2.7. Статистический анализ в 254
5.3. Результаты в 255
5.3.1. Реакция генотипа и влияние условий культивирования цветковых бутонов лука на частоту эмбриогенеза 255
5.3.2. Продолжительность периода сбора бутонов в 257
5.3.3. Период формирования эмбриоидов в культуре in vitro 258
5.3.4. Влияние образования каллуса на частоту эмбриогенеза 262
5.3.5. Влияние антимитотических агентов на жизнеспособность эмбриоидов лука в 263
5.4. Схема селекции и семеноводства fl-гибридов лука репчатого (а. сера l.) на основе создания линий удвоенных гаплоидов 265
5.4.1. Первый этап - оценка и отбор образцов из исходной коллекции265
5.4.4. Четвертый этап - оценка комбинационной способности ЛУГ... 268
5.4.5. Пятый этап - создание изогенной пары 268
5.4.6. Шестой этап - оценка комбинаци..нн...й .п...н...ти и вы...ние перспективных гибридных комбинаций ... 269
5.4.7. Седьмой этап - организация промышленного семеноводства и производство семян коммерческого Fl-гибрида 269
5.5. Заключение 269
5.6. Библиографический список 271
5.7. Приложения 274
глава 6. Проведение исследований и разработка схемы селекции fl-гибридов моркови столовой (daucus carota l.) на основе самонесовместимости с интеграцией методов культуры тканей 278
6.1. Введение 278
6.1.1. Мужская стерильность 278
6.1.2. Самонесовместимость 280
6.1.3. Инбредная депрессия 281
6.1.4. Культура тканей в селекции моркови 281
6.1.5. Недостатки селекции и гибридного семеноводства моркови на основе ЯЦМС 282
6.2. Материалы и методы 284
6.2.1. Получение удвоенных гаплоидов в культуре пыльников моркови 284
6.2.2. Микроклональное размножение моркови 286
6.3. Результаты 287
6.3.1. Влияние температурной предобработки на эффективность эмбриогенеза в культуре пыльников моркови столовой (Daucus carota L.) 287
6.3.2. Изучение и оптимизация технологии микроклонального размножения in vitro самонесовместимых линий - удвоенных гаплоидов моркови 290
6.3.3. Генетико-селекционная схема создания fl-гибридов моркови с использованием самонесовместимости на основе интеграции классических и биотехнологических методов селекции 296
6.4. Заключение 299
6.5. Библиографический список 302
ГЛАВА 7. Подходы интегрирования и комбинирования в построении генетических карт на основе молекулярного генотипирования трех популяций линии - удвоенных гаплоидов 305
7.1. Введение 305
7.2. Материалы и методы 309
7.2.1. Растительный материал 309
7.2.2. Молекулярные анализы 309
7.2.3. Построение генетической карты 312
7.3. Результаты и обсуждение 313
7.3.1. Анализ сцепления и построение генетических карт 313
7.3.2. Маркеры с отклоняющимся расщеплением 319
7.3.3. Пропущенные данные молекулярного генотипирования 320
7.4. Заключение 321
7.5. Библиографический список 322
7.6. Приложения 327
Заключение
- Симптомы болезни
- Производство стабильных искусственно синтезированных амфидиплоидов
- Схема передачи гена устойчивости к киле из дайкона в капусту белокочанную
- Продолжительность и сроки подготовки донорных растений капусты пекинской и белокочанной для культуры изолированных микроспор в условиях открытого грунта и теплицы
Симптомы болезни
P.brassicae - облигатный биотроф. Жизненный цикл патогена состоит из двух фаз (рис. 1.1.2): первая проходит в корневых волосках пораженного растения, а вторая - в коре корня и в стеле гипокотиля (Ingram, Tommerup, 1972). С прорастанием гаплоидных покоящихся в почве спор в первичные зооспоры начинается первая стадия. Зооспора соприкасается с корневым волоском и вводит в цитоплазму свой протопласт. В инфицированном корневом волоске повторяющимися митотическими делениями ядра патоген образует многоядерный плазмодий, который впоследствии развивается в зооспорангий с десятками и сотнями обособленных ядер.
Plasmodiophora brassicae Wo г. Первая фаза неспецифична и может проходить у устойчивых Капустных растений (Dekhuijzen, 1979; Ludwig-Muller et al., 1997) и даже у растений других семейств (Webb, 1949; MacFarlane, 1952; Kole, Philipsen, 1956).
Из зооспорангия освобождаются вторичные зооспоры либо в ризосферу откуда они заражают кору корня или, что более вероятно, инфицируют соседние клетки коры напрямую из корневых волосков (Aist, 1977).
Вторичные зооспоры сливаются и образуют двуядерные зооспоры (Ingram, Tommerap, 1972). Вторая стадия инфицирования инициируется вторичной зооспорой в коре корня. Вторичный плазмодий распространяется в корне и индуцирует неорганизованный рост тканей, нарушающий проводящую систему корня. В результате формируется характерная корневая опухоль («желваки»), проявляется недостаток питания и увядание растения. Распространение плазмодия внутри ткани корня после инфицирования коры происходит несколькими способами: пассивно одновременно с делением клеток хозяина (Dekhuijzen, 1981; Buczacki, 1983); активно, лизируя клеточные стенки клеток растения-хозяина (Ikegami et al, 1978; Mithen, Macrath, 1992). Затем гаплоидные ядра многоядерного плазмодия попарно объединяются в диплоидные, которые мейотически делятся с последующим образованием гаплоидных покоящихся спор. Разложение корневых опухолей приводит к высвобождению покоящихся спор в почву.
Установленная продолжительность сохранения жизнеспособности и пато-генности покоящихся спор Р.brassicae в почве составляет, по крайней мере, 15 -17 лет, а период естественного снижения инфекционной нагрузки почвы - 3,6 года (Wallenhammar, 1996).
Агротехнические приемы, такие как внесение кальций и бор содержащих удобрений, известкование для снижения кислотности почвы, севооборот могут снизить поражение болезнью, но их недостаточно для полной защиты растений от патогена. Применение химических средств защиты ограничено либо отсутствием эффективных разрешенных препаратов, либо высокой стоимостью препаратов (Donald, Porter, 2009). В связи с этим, создание сортов и гибридов растений семейства Крестоцветные с надежной устойчивостью к киле селекционными методами является основой интегрированной защиты капустных культур.
Как было указано выше, первая фаза жизненного цикла является неспецифичной, однако прохождение второй фазы различается у восприимчивых и устойчивых генотипов. Распространение вторичного плазмодия P.brassicae в тканях устойчивых растений ограниченно, при этом его развитие останавливается полностью у высоко устойчивых и существенно замедляется у частично устойчивых сортов (Kroll et al, 1983; Kobelt et al., 2000).
Патоген P.brassicae отличается высокой степенью генетической изменчивости и гетерогенности. Для оценки вирулентности и определения расового состава полевых популяций разработаны несколько систем дифференциации (Buczacki et al., 1975; Williams, 1966; Some et al., 1996; Kuginuki et al., 1999).
В целях однозначной дифференциации рас, европейскими группами исследователей принята единая европейская система дифференциаторов (ЕСД), состоящая из 15 генотипов, по 5 из трех видов В. гара, В.napus и В.oleracea (табл. 1.1.1) (Buczacki et al., 1975). Предложенная система идентификации позволяет определить наличие генов вирулентности как у отдельного изолята, так и у всей популяции, что особенно важно для практической работы. Дифференциаторы 01- 04 - линии турнепса, устойчивость которых контролируется тремя независимыми доминантными генами (Toxopeus, Janssen, 1975). Дифференциатор 05 - сорт пекинской капусты «Granaat» восприимчивый ко всем расам возбудителя, служит контролем восприимчивости (Buczacki et al., 1975).
Растения-дифференциаторы 06 - 09 представлены сортами и линиями рапса «Nevin», «Commercial Giant», «Clubroot Resistant» и отбором из сорта «Commercial Giant». Растение-хозяин 10 - сорт брюквы «Wilhelmsburger», у ко торого устойчивость к киле, контролируется двумя независимыми доминантными генами. Генотипы 11-15 принадлежат виду B.oleracea и представлены сортами «Badger Shipper», «Jersei Queen», «Bindsachsener», «Septa» белокочанной капусты и «Verheul» листовой. Анализ результатов более 200 тестов подтверждает расоспецифичную реакцию растений-дифференциаторов В.гара и B.napus, при этом устойчивость растений B.oleracea является не дифференцирующей (Crute et al, 1983). Номенклатура идентифицированных рас осуществляется с помощью ЕСД-кода, получаемого при сложении цифровых значений пораженных генотипов в каждой хромосомной группе (Buczacki et al., 1975).
Производство стабильных искусственно синтезированных амфидиплоидов
С целью создания устойчивых к киле сортов и гибридов культур B.oleracea в мире проведено множество работ по поиску источников устойчивости среди представителей вида B.oleracea и изучения ее генетики (Crute et al., 1980; Dixon, Robinson, 1986). Однако было показано, что у вида B.oleracea отсутствуют образцы с высокой устойчивостью к P.brassicae, а устойчивость наследуется поли-генно и преимущественно рецессивно (Chiang, Crete, 1970; Seaman et al., 1963; Proudfoot, 1976; Toxopeus, 1978a; Voorrips et al., 1997). Найденная устойчивость B.oleracea проявляется независимо от рас (Buczacki et al., 1983) и не действует против высоких концентраций инокулюма патогена. Toxopeus с соавт. (1978b) показали, что устойчивость B.oleracea определяется 6-ю рецессивными генами. По данным Монахос и Ушанов (1998), устойчивость кормовой капусты контролируется одним рецессивным или двумя рецессивными дупликатно действующими генами.
При использовании QTL-анализа в изучении генетики устойчивости B.oleracea к киле авторы также приходят к заключению о ее количественном и полигенном контроле, демонстрируя один - два локуса количественных признаков основного действия и несколько QTLs минорного действия (Landry et al., 1992; Figdore et al., 1993; Grandclement, Thomas, 1996; Voorrips et al., 1997; Moriguchi et al., 1999; Rocherieux et al., 2004; Nomura et al., 2005). По меньшей мере двадцать семь локусов количественных признаков (QTLs) устойчивости к киле картированы в группах сцепления B.oleracea.
Landry с соавт. (1992) идентифицировал два QTLs, CR2a и CR2b, обеспечивающих 58 % и 15 % фенотипического варьирования устойчивости к расе 2 P.brassicae, используя брюкву сорт «Wilhelmsburger» в качестве донора устойчивости. Три QTLs, обеспечивающие устойчивость к 7 расе, были обнаружены Figdore с соавт. (1993) с использованием брокколи. Voorrips с соавт. (1997) идентифицировал два локуса устойчивости, pb-3 npb-4, а также несколько минорных QTLs в популяции линий - удвоенных гаплоидов полученной из F1-гибридных растений от скрещивания устойчивого сорта капусты белокочанной «Bindsachsener» и брокколи «Greenia». Один QTL устойчивости к киле был обнаружен в 3-й группе сцепления при использовании кормовой капусты (К269 -сорт «Вологодская мозговая» из коллекции ВИР) в условиях естественного инфекционного фона (Moriguchi et al., 1999). Rocherieux с соавт. (2004) представили от 2-х до 5 различных QTLs в зависимости от патотипа P.brassicae и установили, что один QTL, pb-Bo, имеет действие основного гена против трех изолятов. Nomura et al. (2005) обнаружил три QTLs устойчивости к киле, QTL1, QTL3 и QTL9 в популяции от скрещивания капусты белокочанной и кормовой (линия К269). При этом было показано, что генотипы Т2-потомства с тремя QTLs проявляют высокую устойчивость сравнимую с устойчивостью линии К269, в то время как генотипы с одним QTL имеют промежуточное проявление устойчивости. Nagaoka с соавт. (2010) идентифицировал 2 QTLs основного действия pb-Bo(Anju)1, pb-Bo(GC)1 и три QTLs минорного действия генетическим и феноти-пическим анализом потомства F2 от скрещивания линий - удвоенных гаплоидов устойчивой капусты белокочанной («Anju») и восприимчивой брокколи («GC»). Вследствие использования в этих исследованиях различающихся генетических источников устойчивости и изолятов патогена, сопоставление данных QTL-анализов невозможно, несмотря на известные последовательности праймеров и маркеров. И для лучшего понимания генетики и геномики устойчивости к киле B.oleracea требуется разработка общих молекулярных маркеров (Piao et al., 2009).
Одним из первых, созданных килоустойчивых сортов B.oleracea, является сорт белокочанной капусты «Badger Shipper», внедренный в производство в Северной Америке в 1960-х гг. Его устойчивость, определяемая одной генной группой (локусом) с неизвестным числом генов (Chiang, Crete, 1976), вскоре была преодолена патогеном (Crute et al., 1980). В дальнейшем также предпринимались попытки создания устойчивых сортов капусты белокочанной и брокколи на ос нове использования внутривидовых источников устойчивости, однако все создаваемые сорта B.oleracea обладали низкой устойчивостью к киле (Chiang, Crete, 1970; Seaman et al., 1963; Proudfoot, 1976; Voorrips, 1996).
Использование рецессивной устойчивости или устойчивости на основе взаимодействующих доминантных генов в селекции устойчивых коммерческих F1 -гибридов затруднительно, особенно при использовании цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС), т.к. обе родительские линии должны быть гомозиготными по рецессивным аллелям или нескольким доминантным локусам устойчивости (Diederichsen et al., 2009). Это стало причиной использования в практике селекции B.oleracea высоко эффективных доминантных генов близкородственных видов B.napus и В.г ара.
В Канаде сорт брюквы {B.napus) «Wilhelmsburger», который устойчив к самым распространенным расам P.brassicae в США и Канаде, был выбран в качестве источника для создания устойчивых растений вида B.oleracea (Chiang et al., 1977; Chiang, Crete, 1983). В результате интродукции генов устойчивости из B.napus были получены два сорта капусты белокочанной «Acadie» и «Richelain», которые обладают устойчивостью к расе 6, как и сорт брюквы «Wilhelmsburger» (Chiang et al., 1980; Chiang, Crete, 1989). Однако устойчивость этих сортов преодолевается в европейских условиях из-за высокой частоты встречаемости вирулентных рас P.brassicae (Diederichsen et al., 2009).
В селекции B.oleracea селекционеры компании Syngenta Seeds В V. использовали вид В. гара как источник устойчивости киле, при этом необходимо было преодолеть барьер видовой несовместимости для стабильной интрогрессии устойчивости из генома А в геном С (рис. 1.1.3). Первые межвидовые гибриды между брокколи и F1-гибридом пекинской капусты «Parkin», содержащим один доминантный ген устойчивости, были получены в 1987 г. с применением метода спасения зародышей.
Схема передачи гена устойчивости к киле из дайкона в капусту белокочанную
Как было указано выше (параграф 1.1.7.2), устойчивость к киле внутривидовых доноров B.oleracea имеет полигенный рецессивный генетический контроль, а их использование в селекции капусты белокочанной не позволяет создавать сорта с высокой и надежной устойчивостью (Монахос, Теренина, 1998; Chiang, Crete, 1970; Seaman et al., 1963; Proudfoot, 1976; Voorrips, 1996). Кроме того, использование рецессивных генов в селекция F1-гибридов требует гомози-готности по рецессивным аллелям обеих родительских линий, что существенно осложняет селекционный процесс особенно при использовании ЦМС (Diederichsen et al., 2009). По этим причинам единственно возможным способом создания килоустойчивых F1-гибридов капусты белокочанной является отдаленная гибридизация с передачей высоко эффективных доминантных генов близкородственных видов.
В истории селекции на устойчивость есть два успешных примера межвидовой гибридизации и передачи доминантных генов устойчивости к киле в капусту белокочанную {B.oleracea): половой гибридизацией брюквы (B.napus) «Wilhelmsburger» с тетраплоидной капустой (Chiang et al., 1977; Chiang, Crete, 1983); и применением метода спасения зародышей в скрещивании капусты пекинской (B.rapa)\ «Parkin» с брокколи (Diederichsen et al., 2009). Устойчивость созданных коммерческих F1 -гибридов капусты белокочанной выше и надежнее по сравнению с сортами, созданными на основе рецессивной полигенной устойчивости, однако она также преодолевается из-за встречаемости и образования в результате генетической изменчивости патогена вирулентных рас P.brassicae (Diederichsen et al., 2009; Osaki et al., 2008).
Семейство Brassicaceae включает порядка 338 родов и 3709 видов (Warwick, 2006), из них культуры Brassica и Raphanus представляют наибольшую агрономическую ценность. Их возделывают по всему миру и используют в качестве масличных, овощных, пряных, декоративных и кормовых культур.
Среди шести культивируемых видов Brassica три моногеномных диплоидных вида: B.rapa L. (2п = 20, геном АА) (капуста пекинская, капуста китайская, репа, сурепица и др.), В.nigra (L.) Koch (2n = 16, ВВ) (горчица черная) и B.oleracea L. (2п = 18, СС) (капуста белокочанная, капуста цветная, брокколи, кольраби, капуста листовая и др.); и образовавшиеся в результате их спонтанной гибридизации три аллотетраплоидных вида: B.napus L. (2п = 38, ААСС) (рапс, брюква), B.juncea (L.) Czern. and Coss. (2n = 36, AABB) (горчица листовая) и B.carinata A. Braun (2n = 34, BBCC) (горчица эфиопская) (рис. 2.1.1) (Morinaga, 1934; U, 1935).
Схема происхождения амфи-диплоидных видов Brassica . треугольник U (1935). Прописными буквами А, В, С обозначены геномы диплоидных видов, строчными а, в, с - цитоплазмы соответствующих видов В. carimtln ВСЪ, п = 17 Род Raphanus содержит один имеющий агрономическую ценность вид -R.sativus (2п =18, RR) (редис, редька, редька масличная) (Mizushima, 1950). Другие виды культурных растений семейства - Eruca sativa L. (руккола), Nasturtium officinale R. Br. (водяной кресс), Wasabia japonica Matsumura (васаби), Matthiola incana (L.) R. Br. (левкой), Erysimum cheiri (L.) Crantz (лакфиоль) и многие другие. В то же время, множество дикорастущих родственных видов изучены в качестве генетических источников для создания новых сортов с устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам, для повышения генетического разнообразия (Qiong, 2009).
Выявленный в начале XX века метод восстановления фертильности стерильных межродовых гибридов Raphanobrassica (Карпеченко, 1927) вдохновил исследователей на проведение работ по отдаленной гибридизации. В итоге множество всевозможных комбинаций межвидовой, межродовой и межтрибовой гибридизации Brassicaceae привело к получению разнообразных дву-, тригеном-ных гибридов (Warwick et al., 2009). Накопленный многолетний опыт межвидовой и межродовой гибридизации к настоящему времени дает четкое представление о скрещиваемости капустных растений и возможности передачи хозяйственно ценных признаков в культуры Brassica и Raphanus. Детальный обзор и сводная информация относительно скрещиваемости видов Brassicaceae с использованием традиционной гибридизации, технологий спасения зародыша или соматической гибридизации представлена в работах (FitzJohn et al., 2007; Warwick et al., 2009). Относительно близкородственные виды способны скрещиваться естественным путем, однако среди них встречаются трудно или вообще не поддающиеся скрещиванию комбинации.
В настоящем понимании барьеры отдаленных скрещиваний проявляются как в презиготической, так и постзиготической фазах полового размножения (Chen et al, 2011). Презиготический барьер проявляется в форме неудачного прорастания пыльцы, роста пыльцевой трубки, проникновения пыльцевой трубки в завязь, постзиготический - по причине деградации гибридного зародыша, стерильности мужского и женского гаметофита гибридного растения, а также летальности гибридного потомства (Карпеченко, 1935; Kaneko, Bang, 2014).
Для оценки презиготического барьера отдаленной гибридизации разработаны и предложены индексы прорастания пыльцы P.G.I. (pollen germination index) (Matsuzawa, 1983) и совместимости при опылении (I) (Kerlan et al., 1992). Разработаны и применяются различные способы преодоления нескрещиваемости капустных растений, такие как прививка, удвоение хромосомного набора растений отцовского вида, опыление в бутонах, использование для опыления смеси пыльцы, оплодотворение in vitro (Hosoda et al., 1963; Namai, 1971; Kameya, Hinata, 1970) и многие другие. По мнению Капеко и Bang (2014), часто барьеры презиготической несовместимости при отдаленной гибридизации могут быть преодолены опылением в бутонах, а также выбором материнского растения для опыления. Проявление презиготических барьеров имеет сходство с самонесовместимостью и при использовании самосовместимой линии в качестве материнской пыльцевые трубки культивируемых видов хорошо прорастают и проникают в семяпочки (Udagawa et al, 2010).
Постзиготический барьер несовместимости предложено оценивать анатомическими исследованиями развития и роста зародышей, что показано на примере капусты брюссельской (Brassica oleracea L.) с применением методов культуры in vitro опыленных цветков, завязей, семяпочек и зародышей (Wilmar, Hel-lendoorn, 1968).
Абортация гибридного зародыша (семени) при межвидовой и межродовой гибридизации происходит вследствие аномального развития эндосперма и лежащий в основе механизм объяснен несколькими различными гипотезами: балансовым числом эндосперма (Johnston et al., 1980), активацией полярных ядер (Nishiyama, Yabuno, 1978) и геномным импринтингом в эндосперме (Kinoshita, 2007).
В случае невозможности получить гибридное потомство при естественном созревании семян на растении используют биотехнологические методы спасения зародышей: эмбриокультуру (Nishi et al., 1970), культуру завязей (Inomata, 1977, 1990), культуру семяпочек (Momotaz et al., 1998), культуру оплодотворенных яйцеклеток (Takeshita et al., 1980); а также метод слияния протопластов (Schenk, Robbelen, 1982).
Продолжительность и сроки подготовки донорных растений капусты пекинской и белокочанной для культуры изолированных микроспор в условиях открытого грунта и теплицы
Генотип растения является одним из самых существенных факторов, влияющих на эффективность технологии культуры изолированных микроспор. Генотип растения определяет частоту формирования эмбриоидов, качество формирующихся эмбриоидов и регенерационную способность эмбриоидов - частоту формирования проростков (Chuong et al., 1988; Arnison, Keller, 1990; Ferrie et al., 1995), а также частоту спонтанного удвоения хромосомного набора. По данным Ockendon and Sutherland (1987), около половины выявляемого варьирования отзывчивости донорных растений может быть обусловлено генетическими факторами.
Генотипическая зависимость андрогенеза описана у всех видов Brassica, у которых применяли технологию культуры пыльников или микроспор (Arnison et al., 1990а, 19906; Arnison and Keller, 1990; Baillie et al., 1992; Burnett et al., 1992; Cardy, 1986; Choung et al., 1988; Dunwell et al., 1985; Ockendon, 1985; Thurling and Chay, 1984; Takahata, 1997). Даже в пределах одного сорта возможно существенное варьирование отношения к культуре микроспор от растения к растению (Fer-rie and Keller, 1995; Ockendon, 1985; Phippen and Ockendon, 1990; Seguin-Swartz et al., 1983). Данная ситуация еще более усложняется взаимодействием генотип-среда (Dunwell et al., 1985; Roulund et al., 1990; Thurling and Chay, 1984).
Генотипическая зависимость эмбриогенной способности микроспор отражается не только в отзывчивости отдельных растений к культуре микроспор, но и в генотипическом варьировании среди растений, полученных в культуре изолированных микроспор (Foisset et al., 1996; Monakhos et al., 2012). Неконтролируемый отбор определенных генотипов вследствие неслучайной регенерации растений из эмбриоидов является еще одной неразрешенной проблемой технологии получения удвоенных гаплоидов (Takahata, 1997).
Практически отсутствует доступная информация относительно размаха ге-нотипического варьирования, реализуемого в популяциях удвоенных гаплоидов, полученных на основе F1-гибридов, а также генетической составляющей таких популяций в сравнении с традиционными инбредными линиями (Siebel and Pauls, 1989; Chen, Beversdorf, 1990). Для селекционеров важно отсутствие неконтролируемого отбора в андрогенезе, сужающего генотипическое варьирование получаемых в культуре микроспор популяций. В тоже время возможность селекционера контролировать отбор эмбриоидов in vitro стала бы дополнительным инструментом в его руках для отбора желаемых генотипов (Hormaza, Herrero, 1992).
Первые свидетельства влияния генотипа донорного растения на андрогенез представлены в исследованиях высоко и низкоотзывчивых генотипов (Cardy, 1986; Dunwell et al., 1985; Wenzel, 1980; Rudolf et al., 1999). В исследовании Rudolf et al. (1999), при скрещивании отзывчивого (28,7 шт. эмбриоидов на чашку Петри) и неотзывчивого (0,1 шт. эмбриоид на чашку Петри) генотипов капусты белокочанной (B.oleracea L.) показано промежуточное (18,9 шт. эмбриоидов на чашку Петри) и превосходящее лучшего родителя проявление эмбриогенной способности гибридного потомства (52,9 шт. и 64,0 шт. эмбриоидов на чашку Петри). В другом исследовании показано, что при скрещивании высокоотзывчивых линий - удвоенных гаплоидов их потомства также обладают высокой отзывчивостью к культуре микроспор; при скрещивании высокоотзывчивого и низкоотзывчивого потомства различаются, но преобладает промежуточное проявление отзывчивости; при скрещивании низкоотзывчивых потомства также являются низкоотзывчивыми (Arnison and Keller, неопубл). Четкое различие генотипов по отзывчивости и промежуточное проявления этого признака в гибридных потомствах свидетельствует об участии в контроле эмбриогенной способности небольшого числа генов. Тем не менее, дать полную генетическую интерпретацию подобных результатов, установить точное количество вовлеченных генов и их взаимодействие очень сложно, так как наблюдается существенное различие эмбриогенной способности между потомствами реципрокных скрещиваний. Некоторые растения определяют низкую отзывчивость потомства, только при использовании в качестве материнского, т.е. фактор цитоплазмы может иметь предопределяющее влияние (Palmer et al, 1996).
В силу высокой сложности и трудоемкости проведения генетического анализа эмбриогенной способности микроспор в литературе встречается мало информации относительно наследования данного признака. У капусты пекинской {B.campestris) и рапса (B.napus) впервые частота эмбриогенеза в системе диал-лельных скрещиваний (4 х 4) линий разной степени отзывчивости изучена Zhang и Takahata (2001). Ими показано, что у обоих видов выход эмбриоидов у большинства F1-гибридов аналогичен либо немного превышает показатель высокоотзывчивого родителя и только немногие F1-гибриды показывают промежуточный выход эмбриоидов между двумя родительскими формами. Диаллельный анализ выявил достоверное влияние аддитивных и доминантных генов на эм-бриогенную способность микроспор капусты пекинской и рапса на 1 %-м уровне значимости. Доминантные гены оказывали положительный эффект на эмбриогенез, у рапса преобладали аддитивные эффекты генов, у капусты пекинской - доминантные. Наследование в широком и узком смысле составило 0,972 и 0,811 для рапса и 0,959 и 0,659 для капусты пекинской.
На основе результатов гибридологического анализа - расщепления по признаку эмбриогенная способность в Р2-потомстве от скрещивания сортов рапса «Lisandra» х «Kamikita», Zhang и Takahata (2001) сделали предположение о контроле эмбриогенной способности двумя локусами с аддитивными эффектами.
Скрининг маркеров с отклоняющимся от ожидаемого расщеплением в популяции линий - удвоенных гаплоидов, но соответствующим ожидаемому расщеплению в популяции F2, и сопоставление расщепления маркеров с частотой формирования эмбриоидов каждого растения потомства F2 позволило Zhang et al. (2003) найти RAPD-маркеры, связанные с эмбриогенной способностью микроспор капусты пекинской и рапса.