Введение к работе
1,1. Актуальность проблемы. Синтез белка - основной процесс, обеспечивающий реализацию генетической информации в морфологические и физиологические особенности организмов. Относительно большой объем клеток эукариот и появление у них ядра, в котором осуществляется транскрипция генов, снижают оперативность регуляции синтеза белка этих организмов на уровне транскрипции. Посттранскрипционный уровень регуляции синтеза белка является более оперативным и реализуется через целый ряд молекулярных механизмов: процессинг ядерной РНК, транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, выбор мРНК для трансляции, регуляцию скоростей инициации, элонгации и терминации синтеза белка и другие механизмы.
В последние десятилетия стало очевидным, что наиболее лабильным звеном посттранскрипционной регуляции синтеза белка является модуляция стабильности цитоплазматических мРНК. Индивидуальные мРНК значительно различаются по периоду полураспада, который варьирует в клетках эукариот от минут до недель. В настоящее время интенсивно изучаются факторы, определяющие стабильность мРНК, к которым в первую очередь относится структура самих мРНК и активность РНКаз. Методы генной инженерии позволили эффективно показать участие тех или иных структур в определении времени жизни молекул мРНК [28]. Эти исследования необходимы для понимания глубинных механизмов регуляции экспрессии генов в ходе онтогенеза, при стрессовых условиях среды, а также для оптимизации экспрессии трансгенов. Однако посттранскрипционная регуляция синтеза белка у растений на уровне дифференциальной стабильности мРНК изучена крайне слабо.
Созревающее зерно кукурузы представляет собой хорошую модель для изучения тканеспецифической регуляции синтеза белка, поскольку здесь синтезируется в большом количестве ограниченный набор запасных белков - зеи-нов, биохимия и генетика которых хорошо изучены. Этому в значительной степени способствуют широкомасштабные исследования биохимического и молекулярно-биологического действия мутации гена opaque-2, определяющей глобальное перераспределение синтеза белковых фракций в зерне кукурузы. Фундаментальные исследования, конечной целью которых является создание высоколизиновой кукурузы, уже к концу 80-ых годов привели к тому, что были клонированы и секвенированы как структурные гены зеинов, так и регуляторний ген opaque-2, осуществляющий трапскрипциошіую регуляцию синтеза
ЗеИНОВ. ; _
* Научный консультант по диссертации - д.с.-х.н., профессор, почетный доктор университета Феррары, заслуженный деятель науки Кубани, академик Алешин Николай Евгеньевич.
Одновременно накапливались факты, свидетельствующие о том, что большое значение в регуляции синтеза этих белков играет посттранскрипци-онный уровень. Но оставались не ясными конкретные механизмы посттранскрипционной регуляции (Shmidt,1993).
Значение исследований этих механизмов выходит за рамки регуляции синтеза только запасных белков, так как многие молекулярные процессы, связанные с формированием хозяйственно-цешшх признаков растений, таких как стрессоустойчивость и фотопериодизм, регулируются на транскрипционном и постгранскрипционном уровнях.
1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью исследования было
изучение роли дифференциальной стабильности мРНК в посттранскрипцион
ной регуляции синтеза белка у растений и создание на основе этого новых ме
тодов, повышающих эффективность селекционного процесса. В задачи иссле
дования входило изучить:
закономерности формирования белкового комплекса созревающего зерна кукурузы при разных уровнях активности РНКаз в тканях и в условиях блокады транскрипции актиномицином Д.
трансляционную активность полирибосом in vitro созревающего зерна кукурузы, проростков пшеницы и ячменя в оптимальных и стрессовых условиях роста растений.
стабильность мРНК зеинов 19 кД и 22 кД при блокаде транскрипции генома созревающего зерна кукурузы актиномицином Д (in vivo) и в бесклеточной системе синтеза белка.
влияние мутации гена opaque-2 на стабильность мРНК созревающего зерна кукурузы.
влияние условий окружающей среды на стабильность мРНК проростков пшеницы и ячменя.
создать на основе экспериментальных и литературных данных гипотетическую модель молекулярного механизма действия мутации гена opaque-2 по изменению белкового и аминокислотного состава зерна кукурузы. Экспериментально показать сходство молекулярных механизмов формирования высоколизинового и адаптационного синдромов в растительной клетке.
создать новый охраноспособный метод оценки исходного материала пшеницы и ячменя по ряду генетико-физиологических признаков на основании сортоспецифических особенностей функционирования компонентов бе-локсинтезирующего аппарата растений.
1.3. Научная новизна работы. Роспатент выдал патент на изобретение
[38]:"Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур". В
основе способа лежат оригинальные исследования реакции компонентов бе-
локсинтезирующей системы растений на различные эндогенные и экзогенные факторы.
Впервые проведено комплексное исследование феномена дифференциальной стабильности мРНК и его роли в регуляции синтеза белка в клетках злаковых растений. В работе впервые доказана дифференциальная стабильность мРНК запасных белков зерна кукурузы - зеинов 19 кД и 22 кД. Установлено, что мутация гена opaque-2 изменяет стабильность мРНК зерна кукурузы. Впервые экспериментально доказано, что основным фактором, формирующим как высоколизиновый, так и адаптационный синдромы в созревающем зерне кукурузы, является высокая лабильность мРНК зеинов.
Впервые обнаружено, что в ходе двуциклической аффинной хроматографии РНК созревающего зерна кукурузы, проростков пшеницы и ячменя па поли(У)-сефарозе, а также при инкубации водных препаратов суммарной РНК (in vitro) происходит дифференциальный распад мРНК по тем же закономерностям, что и в живой клетке (in vivo). Показано, что распад мРНК детерминирован структурой мРНК, белками, ассоциированными с мРНК, и не зависит от основного клеточного метаболизма, но определяется генотипом и условиями роста растения.
При исследовании трансляционной активности белоксинтезирующего аппарата растений in vitro впервые обнаружено, что под влиянием стрессовьтх условий среды (обезвожившгае, засоление, низкие положительные температуры) происходит неспецифический прирост трансляционной активности полисом проростков пшеницы и ячменя. Это явление имеет генотипический характер. Блокада транскрипции актиномшщном Д генома кукурузы предотвращает в зерне распад полирибосом и мРНК под действием теплового шока, что доказывает активное участие генома в ответе на тепловой шок.
Полученные в работе данные вносят существенный вклад в изучение молекулярных процессов формирования зерна и адаптации растений к неблагоприятным факторам среды, расширяют и углубляют теоретические основы селекции.
1^.Практическая ценность работы. Предложен молекулярный метод оценки физиологического состояния зерновых культур, защищенный патентом [38]. Предложен новый метод оценки стабильности мРНК, полностью независимый от основного клеточного метаболизма и уменьшающий объем экспериментальных работ. Это метод открывает новый класс молекулярных маркеров хозяйственно-ценных признаков злаковых растеїпш. Обнаруженная сортоспецифичиость реакции белоксинтезирующего аппарата на изменение внешних условий создает принципиально новую основу для разработки методов оценки стрессоустойчивости и фотопериодизма зерновых культур для це-
лей селекции. Предложен метод стабилизации мРНК in vitro (обработка цели-том).
Материалы работы используются в курсах лекций и в качестве задачи большого практикума по молекулярной биологии па биологических факультетах Кубанского государственного университета и Кубанского государственного аграрного университета.
1.5.Основные положения, вынесенные на защиту. Дифференциальная стабильность мРНК является важнейшим звеном посттранскрипционной регуляции экспрессии генов злаковых растений. Стабильность мРНК определяется кодирующим его геном и условиями роста растений.
Регуляция синтеза запасных белков - зеинов осуществляется в значительной степени на уровне стабильности мРНК, что является основным компонентом сходства молекулярно-биологических механизмов формирования высоколизинового и адаптационного синдромов в созревающем зерне кукурузы.
На примере созревающих зерновок кукурузы и проростков пшеницы и ячменя показано, что изменение условий произрастания растений (температуры, освещения) приводят к генотипическому ответу на уровне стабильности мРНК in vitro. Распад мРНК при инкубации водных препаратов РІЖ происходит аналогично распаду в живой клетке.
Установлена взаимосвязь между степенью полиаденилирования мРНК, ее вторичной структурой и стабильностью. Обработка высокоочищенных препаратов суммарной РНК целитом, специфически связывающим белки, приводит к остановке деаденилирования и стабилизации мРНК, что свидетельствует о наличии ассоциированных с мРНК РНКаз белковой природы, устойчивых к действию традиционных депротеинизирующих агентов.
Явление дифференциальной стабильности мРНК in vitro открывает принципиально новые возможности для оценки селекционного материала по ряду хозяйственно ценных свойств.
1.6.Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждены на четвертой конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Алма-Ата,1980), на 3 Всесоюзной научно-технической конференции по проблемам кукурузы (Днепропетровск, 1981), на Всесоюзном совещании "Производство и использование растительного белка" (Краснодар, 1981), на 6 и 7 Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987, 1990), на 5 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), на Всесоюзной конференции по биотехнологии зерновых культур (Алма-Ата, 1988), на Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990), на 2 съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990),
на Международном симпозиуме "Проблемы синтеза и практического применения олигонуклеотидов" ( Москва, 1991 ), на 1, 2 и 3 симпозиумах "Новые направления биотехнологии растений" (Пущино, 1991, 1993, 1995), на 1 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), на 16 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), на 3 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на 2 съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997).
