Содержание к диссертации
Введение
2 Основная часть 11
2.1 Обзор литературы 11
2.1.1 Общая характеристика стрессов у сельскохозяйственных животных 11
2.1.2 Механизм развития ответных адаптационных реакций в организме сельскохозяйственных животных при стрессе 16
2.1.3 Функционирование иммунной системы макроорганизма при стрессовой реакции 20
2.1.4 Взаимодействие иммунной системы и желудочно-кишечного тракта макроорганизма при стрессе 24
2.1.5 Фармакологическая регуляция состояний дезадаптации сельскохозяйственных животных 27
2.1.6 Перспективы практического применения пробиотиков на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus 30
2.1.7 Свойства и лечебно-профилактическое действие пробиотического препарата Биоспорин 32
2.2 Собственные исследования 35
2.2.1 Материалы и методы 35
2.2.1.1 Объекты экспериментального исследования 35
2.2.1.2 Экспериментальные модели хронического стресса 36
2.2.1.3 Группы животных и схемы применения Биоспорина при экспериментальном моделировании хронического стресса 38
2.2.1.4 Методы лабораторной диагностики функционирования иммунной системы лабораторных животных в условиях хронического стресса 40
2.2.2 Результаты собственных исследований 49
2.2.2.1 Определение количества форменных элементов белой крови и некоторых морфометрических показателей органов белых мышей при иммобилизационном стрессе 49
2.2.2.2 Изучение влияния Биоспорина на реакции клеточного звена иммунитета экспериментальных белых мышей в условиях хронического иммобилизационного стресса 55
2.2.2.3 Влияние Биоспорина на гуморальный иммунный ответ белых мышей в условиях иммобилизационного стресса 63
2.2.2.4 Определение лейкоцитарной формулы крови и некоторых морфометрических показателей тимуса и лимфатических узлов у лабораторных мышей в тесте Порсолта 65
2.2.2.5 Исследование функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата у белых мышей в тесте Порсолта 70
2.2.2.6 Определение лейкоцитарной формулы крови и некоторых морфометрических показателей органов у лабораторных животных при экспериментальном воздействии мигающего светового раздражителя 72
2.2.2.7 Определение уровня Т- антигенспецифических лимфоцитов у лабораторных белых мышей в условиях мигающего светового раздражителя 80
2.2.2.8 Определение количества антителообразующих клеток в селезенке лабораторных мышей при экспериментальном воздействии мигающего светового раздражителя 82
3 Заключение 85
3.1 Выводы 93
3.2 Практические предложения 94
Список сокращений и условных обозначений 95
Список литературы
- Механизм развития ответных адаптационных реакций в организме сельскохозяйственных животных при стрессе
- Свойства и лечебно-профилактическое действие пробиотического препарата Биоспорин
- Группы животных и схемы применения Биоспорина при экспериментальном моделировании хронического стресса
- Исследование функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата у белых мышей в тесте Порсолта
Введение к работе
Актуальность темы. В современном промышленном комплексе животные могут
подвергаться воздействию многочисленных стрессовых факторов, сильное и
продолжительное влияние которых нередко приводит к нарушению здоровья животных, снижению их продуктивности, а порой и к гибели (Околышев С., 2013). Стрессорами могут стать нарушения температурно-влажностного режима в помещениях, смена рациона кормления, технологические приемы, ветеринарно-зоотехнические мероприятия (Данилкина О. П., 2016; Плященко С. И., 1983).
Различные по природе стрессовые факторы трансформируются в общее неспецифическое звено патогенеза многих заболеваний, которое дезорганизует работу различных органов и систем организма, истощая антистрессовые механизмы защиты (Калуев A. B., 2004).
Одной из систем, являющейся первой мишенью при воздействии стрессоров, становится иммунная система, исследование которой особенно актуально на фоне все возрастающих физиологических и эмоциональных нагрузок, связанных в животноводстве с внедрением новых технологий производства (Фисинин В. И., Фурай С. П., 2013; Segerstrom S. C., 2004; Voikar V., 2006).
В последнее время исследователи рассматривают деятельность иммунной системы при стрессе в совокупности с функционированием кишечной микрофлоры. Теоретическими и экспериментальными исследованиями ряда авторов (Фисинин В. И., Фурай С. П., 2013; Бердичевский Б. А., 2001; Хавкин А. И., 2003; Хаитов Р. М., 1998) показано, что продолжительный или очень сильный стресс негативным образом влияет не только на иммунную систему, но и на нормальную микрофлору кишечника животных, которая играет важную пусковую роль в механизме формирования защитных реакций организма.
В свою очередь, нормофлора кишечника находится в прямой зависимости от иммунного статуса макроорганизма. Нарушение равновесия в результате воздействия стрессовых факторов в одной из систем сразу приводит к нарушению функционирования другой (Sternberg E. M., Licino J., 1995). Поэтому своевременная коррекция кишечной микрофлоры и стимулирование иммунной системы имеет большое значение для повышения устойчивости организма животного к воздействию повреждающих факторов (Коляда Т. И., Волянский Ю. Л., Васильев И. В., Мальцев В. И., 1995; Порядин Г. В., 2009).
Увеличение продолжительности и интенсивности воздействия стрессоров вызывает адаптивный эффект стрессовой реакции. При низкой адаптационной способности животных снижается их продуктивность, повышается расход кормов и, как следствие, животноводческие предприятия и фермы несут значительные экономические потери (Устинов Д. А., 1976). Поэтому наиболее мощным механизмом профилактики возникновения патологического состояния при стрессе является повышение адаптивных возможностей организма животных к повреждающим факторам окружающей среды (Бородкин Ю. С., Зайцев Ю. В., Лосев В. В., Богославская С. И., 1989).
В связи с этим, одной из основных задач современной ветеринарии является изыскание средств, которые бы расширили границы адаптации и устойчивости организма животного к стрессовым воздействиям.
Для предупреждения развития стресса и снижения его отрицательных последствий, повышения общей резистентности и продуктивности животных, наряду с оптимизацией условий содержания и кормления, предусматривается использование фармакологических средств и биологически активных добавок (Брылин А.П., 2004; Бузлама В. С., 2003; Кириллов О. И., 1966; Лоуренс Д. Р., Бенитт П. Н., 1991; Мосолов С. Н., 1996; Бородин В. И., 2000).
При этом все большее внимание ученых и специалистов - практиков привлекают пробиотики, что связано, в первую очередь, с их широким применением в качестве средств лечения и различной этиологии у сельскохозяйственных животных (Малик Н. И., Панин А. Н., 2001).
В последнее время в научной литературе все чаще встречаются сообщения об успешном применении пробиотических препаратов в качестве адаптогенов, при различного рода, стрессовых состояниях у сельскохозяйственных животных (Учасов Д. С., Ярован Н. И., Сеин О. Б., 2013; Данилевская А. Н., Груздев В. Р., Сипко Т. П., 2004).
Некоторые пробиотические препараты могут повышать устойчивость организма к гипоксии, радиации, жаре, холоду и другим негативным воздействиям (Абакумова Т. В., 2003; Макарова Г. А., 2003). Необходимо отметить, что для многих пробиотических препаратов общим существенным качеством является отсутствие побочных реакций, и как следствие этого, противопоказаний к применению (Похиленко В. Д., Перелыгин В. В., 2007).
Среди введенных в клиническую практику пробиотиков большую популярность завоевал препарат Биоспорин, созданный на основе двух штаммов спорообразующих бактерий – Bacillus subtilis 3 и Bacillus licheniformis 31, обеспечивающих комплексный механизм действия. Положительное действие пробиотика обусловлено, с одной стороны, выраженной антагонистической активностью Биоспорина по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, с другой – его иммуностимулирующим влиянием на макроорганизм (Федчук А. А., Чебыкин А. М., 1999; Лобзин Ю. В., Поздняк А. Л., Захаренко С. М., Литусов Н. В., Мисников О. П., Степанов А. В., 1997).
Таким образом, учитывая фармакологическое действие Биоспорина, а также тот факт, что одними из основных мишеней при воздействии стресса становятся иммунная система и нормофлора кишечника, представлялось актуальным изучить его влияние на адаптивные реакции иммунной системы белых мышей при экспериментальном хроническом стрессе.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование влияния Биоспорина на адаптационные реакции иммунной системы белых мышей при различных видах стресса.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Исследовать общие закономерности и особенности функционирования иммунной системы лабораторных животных в условиях экспериментального хронического стресса.
-
Определить особенности влияния Биоспорина на клеточное и гуморальное звенья иммунитета белых мышей при иммобилизационном стрессе.
-
Изучить характер иммунологических изменений в организме лабораторных животных при применении Биоспорина в тесте Порсолта.
-
Исследовать эффективность использования Биоспорина при экспериментальном воздействии мигающего светового раздражителя на организм лабораторных мышей путем оценки иммунологических показателей.
Научная новизна. Впервые установлено, что изменения реакций иммунной системы, формирующиеся в условиях экспериментального хронического стресса, корректируются при применении пробиотического препарата Биоспорин. Данное обстоятельство подтверждается экспериментальными исследованиями, свидетельствующими о полном или частичном восстановлении комплекса показателей иммунных реакций в организме лабораторных мышей.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Экспериментальный хронический стресс приводит к угнетению иммунологических реакций в организме белых мышей.
-
Пробиотический препарат Биоспорин, применяемый на фоне экспериментального хронического стресса, оказывает иммуностимулирующее влияние на адаптационные реакции иммунной системы лабораторных животных.
Теоретическая и практическая значимость. Анализ данных, полученных в ходе проведенного экспериментального исследования, позволяет расширить представление о
приспособительных реакциях иммунной системы лабораторных мышей к различным видам экспериментального хронического стресса. Благодаря полученным результатам внесен вклад в изучение общих закономерностей и особенностей развития иммунного ответа, возникающего на фоне введения пробиотического препарата Биоспорин при хроническом стрессе. На основании новых знаний о свойствах Биоспорина, полученных при проведении экспериментальных исследований, этот препарат может быть рекомендован для использования в современном животноводстве с целью повышения адаптационных реакций иммунной системы сельскохозяйственных животных при воздействии на них стрессов различной этиологии. Материалы и результаты исследований используются в учебной и научной работе на кафедре морфологии, экспертизы и хирургии Уральского ГАУ, а также на кафедрах морфологического профиля Пермской ГСХА, Ивановской ГСХА, ГАУ Северного Зауралья, Омского ГАУ, Южноуральского ГАУ и Мордовского государственного университета, в курсе патологической анатомии и патофизиологии, при написании соответствующих разделов учебных руководств и пособий по иммунологии и иммуноморфологии, для дальнейшего изучения влияния пробиотического препарата Биоспорин на организм сельскохозяйственных животных с целью повышения резистентности организма в стрессовых ситуациях.
Степень ее разработанности. На протяжении последних лет над решением проблемы эффективности применения пробиотических препаратов при возникновении стрессовых состояний у животных работали многие специалисты (Абакумова Т. В., 2003; Учасов Д. С., Ярован Н. И., Сеин О. Б., 2013; Данилевская А. Н., Груздев В. Р., Сипко Т. П., 2004). При этом внимание исследователей было сосредоточено, в основном, на эффективности пробиотиков как средств профилактики и лечения и на исследовании иммунобиохимического статуса, а также на изменении продуктивности животных при стрессовых состояниях.
Зарубежные авторы также занимались изучением данной проблемы , 2013; Messaoudi M., 2011; Rao, A. A., 2009). В опубликованных научных работах изложены результаты доклинических и клинических исследований эффективности применения пробиотиков при стрессовых состояниях и изучения факторов нервной и эндокринной систем макроорганизма.
Возможность успешного использования Биоспорина в промышленном
животноводстве показана в работах ряда российских авторов (Берсенева Е. В., 2004; Семенова, А. Г., 2011; Блажнова М. В., 2004; Таранова Л. А., 2000).
Однако, несмотря на многочисленные данные научной литературы о благоприятных эффектах Биоспорина, его влияние на иммунный статус животного находящегося в состоянии стресса, в частности, на иммуноморфологические показатели до сих пор остается малоизученным.
В связи с этим, представлялось актуальным изучить влияние Биоспорина на адаптацтонные реакции иммунной системы лабораторных мышей при различных видах хронического стресса.
Методология и методы исследования. При выполнении настоящей работы были использованы различные адекватные модели стресса, которые позволили исследовать влияние стрессовой реакции на состояние иммунной системы белых мышей.
Во время проведения опытов и учета результатов были использованы общепринятые гематологические, иммуноморфологические и статистические методы исследования (Медведева М. А., 2013; Кондратьева И. А., 2004; Клауса Д., 1990; Платонов А. Е., 2000).
Полученные экспериментальные данные были подвергнуты статистической обработке при помощи программы «Microsoft Excel - 2008» и сгруппированы в таблицы и графики. При фотографировании препаратов крови использовали увеличение объектива100 и окуляр10. Степень достоверности определяли с помощью t – критерия Стьюдента (Лакин Г. Ф., 1990; Платонов А. Е., 2000).
Степень достоверности и апробация результатов. Исходные данные получены на сертифицированном оборудовании. Материалы диссертации были представлены и обсуждены:
на 18-й Международной научно-методической конференции: «Современные проблемы патологической анатомии патогенеза и диагностики болезней животных», Москва, 20-25 октября 2014 г;
на Лапшинских чтениях, Саранск, 2016 г;
на Международной научно-методической конференции: «Стратегия научно-технологического развития сельского хозяйства и природопользования: взгляд в будущее», Екатеринбург, 15-16 февраля 2017г.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы отражены в девяти научных статьях, в том числе семь - в изданиях, рекомендованных Высшей Аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введения, основной части, заключения, списка литературы. Материал диссертации содержит 4 таблицы, 25 рисунков и 196 ссылок на литературные источники, из них 178 работ отечественных и 18 работ иностранных авторов.
Механизм развития ответных адаптационных реакций в организме сельскохозяйственных животных при стрессе
В конвейерной технологии промышленного животноводства имеет также место стресс, связанный с перегруппировками и перемещениями животных. Ведущим фактором при указанном виде стресса становится борьба за лидерство, что приводит к перевозбуждению животных и, как следствие этого, к травмам, каннибализму, потере аппетита, снижению интенсивности роста, уменьшению продуктивности [48].
В специализированном животноводстве большое распространение имеет транспортный стресс, основными признаками которого являются потеря массы тела в период транспортировки, а в последующем и угнетение роста [54].
По сообщению Ибрагимовой Л. Л. с соавт. [55], во время перевозки у животных повышаются мышечный тонус, диурез и дефекация, увеличиваются рефлекторная возбудимость и потоотделение. Транспортный стресс часто провоцирует возникновение желудочно-кишечных, респираторных инфекций и незаразных болезней.
Вакцинальный стресс характерен для промышленного животноводства. Развитие данного вида стресса начинается на 3-5-й день после вакцинации и заканчивается на 12-18-й день, что обусловлено формированием специфического иммунитета.
Согласно данным Данилкиной О. П. [2], вакцинальный стресс влияет на интенсивность роста, продуктивность сельскохозяйственных животных, а также повышает чувствительность к другим стрессовым факторам.
С повышением уровня механизации на фермах все чаще возникает проблема шумового стресса. Под действием шума у животных развивается угнетенность, изменяется артериальное давление, ухудшаются функциональные свойства сердечной мышцы, повышается возбудимость, которая часто проявляется каннибализмом и высокой агрессивностью, особенно у высокопродуктивных линий и пород птиц и свиней [47].
Достаточно часто встречаются в хозяйствах стрессы, связанные с кормлением животных, наиболее чувствительными к которым является молодняк в период интенсивного роста.
Семенов В. В. в своей работе отмечает [56], что кормовой стресс вызывает у животных нарушение работы сосудов, сердца, щитовидной железы и других органов, а при хроническом недокорме и голодании снижаются защитные функции организма, замедляется половое развитие.
Следует отметить, что большой ущерб промышленному животноводству наносит адинамический (гипокинезический) стресс. В промышленных комплексах гипокинезия является ведущим стресс-фактором.
По материалам Магер С. Н. с соавт. [57], гипокинезия приводит к нарушению энергетического обмена, в крови повышается содержание липопротеидов и холестерина. Это неизбежно ускоряет развитие атеросклероза сосудов мозга, сердца и других органов. Авторы подчеркивают, что при гипокинезе нарушаются все виды обмена веществ. Резко снижается потребность скелетных мышц в кислороде, а значит, и в снабжении их кровью.
По наблюдениям исследователей одним из проявлений «атрофии бездействия» является уменьшение емкости всей сосудистой системы, снижение числа капилляров в мышце сердца, в скелетных мышцах. Резкие изменения наблюдаются в костях: они теряют прочность вследствие того, что кальций начинает выделяться из костной ткани в кровь и откладываться на стенках сосудов. У крупного рогатого скота гипокинезия вызывает потерю аппетита, атонию преджелудков, снижение молочной продуктивности и процента жира в молоке. Гипокинезия ухудшает работу многих органов и систем отрицательно сказывается на росте и развитии телят и является серьезной проблемой в промышленном животноводстве [58]. К экологически неблагоприятным стрессовым факторам, влияющим на рост, развитие, резистентность и адаптивные способности сельскохозяйственных животных, относят снижение интенсивности, продолжительности, периодичности, а также спектрального состава освещенности помещений. Известно, что свет, падая на сетчатку глаза, усиливает поток нервных импульсов от зрительных рецепторов в центральную нервную систему. Свет способствует поддержанию хорошего тонуса ретикулярной формации ствола мозга, что является необходимым условием ее нормального функционирования. Кроме того, зрительное восприятие оказывает влияние на гипоталамические ядра, а через них на вегетативную нервную систему и эндокринные функции. При продолжительном нахождении животных в условиях малой освещенности снижаются тонус и реактивность вегетативной нервной системы, особенно симпатической. Изменение уровня и продолжительности освещения также влияет на железы внутренней секреции, в частности, на функцию надпочечников и щитовидной железы [59].
Чрезмерные физические нагрузки также могут быть причиной стрессового состояния у сельскохозяйственных животных. Условия эксплуатации в значительной мере влияют на общее состояние, работоспособность, устойчивость к инфекционным заболеваниям. Максимально тяжелая и длительная работа, слишком быстрая езда на дальние расстояния без предоставления животному отдыха, неумелое и грубое обращение с животными во время работы, длительное транспортирование по железным дорогам нередко вызывают стресс, обусловленный сильным переутомлением животных [60].
Свойства и лечебно-профилактическое действие пробиотического препарата Биоспорин
Исследования по теме диссертации проведены в 2009 - 2014 годах на кафедре анатомии и физиологии ФГБОУ ВПО «Уральский государственный аграрный университет» и на базе филиала ФГБУ «48 ЦНИИ» МО РФ г. Екатеринбург. Работа выполнена в рамках программы «Морфология гистогематических барьеров в норме и при разных видах воздействия на организм животных» № государственной регистрации 01960013289 и «Безопасность и контроль за качеством сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов в экологических условиях Среднего Урала» № государственной регистрации 01200208408.
Объектом исследования настоящей работы являлись лабораторные животные – беспородные инбредные белые мыши, половозрелые самцы массой 20-26 г. Общее количество животных использованных в экспериментальном исследовании составило 720 особей. Животные содержались в соответствии со стандартом (GLP) - надлежащей лабораторной практики [157, 158]. Мониторинг здоровья животных осуществляли согласно «Положению о государственном ветеринарном надзоре в РФ» от 16.04. 2001 № 295 [159].
В работе использовали ампульную форму пробиотического препарата Биоспорин, созданного на основе ассоциации двух видов живых аэробных непатогенных бактерий B.subtilis 3 (ВКМП № 2335) и B.licheniformis 31 (ВКМП № 2336), лиофильно высушенных в сахарозо-желатиновой среде и имеющих вид кристаллической или пористой массы разных оттенков белого и бежевого цвета, без запаха, сладковатого вкуса. Одна доза препарата содержит живых микробных клеток B.subtilis3 - от 1109 до 8109и B.licheniformis 31 - от 1108 до 2109 [151].
Экспериментальное моделирование стрессов позволяет исследовать характер дисфункции иммунной и кроветворной систем, а сравнительный анализ полученных результатов иммунологических исследований дает возможность сделать заключение о наличии или отсутствии чувствительности указанных систем к различным чрезвычайным факторам.
В экспериментальных исследованиях применяли хронический стресс, поскольку длительность воздействия стрессора гарантирует развитие стрессовой реакции. Тогда как при использовании кратковременных раздражителей, формирование острого стресса не гарантировано.
Моделирование стресса у экспериментальных животных чаще всего производят посредством иммобилизации, болевых воздействий, чрезвычайных мышечных нагрузок, охлаждения, лишения сна и т. д.
В настоящей работе в качестве модели хронических стрессовых воздействий применяли иммобилизационный стресс (ИС) – ограничение движения, вынужденное плавание – тест Порсолта (ТП), а также стресс, создаваемый с помощью мигающего светового раздражителя (МСР). Указанные виды стрессоров позволили смоделировать наиболее часто встречающиеся в животноводстве стрессы у сельскохозяйственных животных, такие как: гипокинезический стресс, который возникает при длительном стойловом безвыгульном содержании животных, световой стресс, обусловленный недостаточным естественным освещением помещений для содержания животных, а также стресс, возникающий в результате сильного переутомлением животных при их чрезмерной эксплуатации.
Иммобилизационный стресс является одной из наиболее удобных экспериментальных моделей для исследования характера дисфункции иммунной системы при воздействии экстремальных факторов. Указанный вид экспериментального стресса позволяет изучать направленность и глубину изменений в работе иммунной системы, а также оценивать эффективность препаратов, претендующих на роль стимуляторов, модуляторов, адаптогенов и т. д. [160].
Стресс провоцировали методом жесткой фиксации конечностей животного к стальной решетке в положении на спине по 19 ч в течение 10 суток [161].
Тест Порсолта или метод вынужденного плавания представляет собой комбинированный жесткий вид стресса, сочетающий в себе физический и эмоциональный компоненты [162].
В качестве сосуда для плавания белых мышей использовали эксикатор диаметром 28 см, высотой 20 см. Температуру воды поддерживали в пределах (28±2) 0С. Критическим являлся момент, когда животное было не в состоянии удержаться над поверхностью воды самостоятельно. В этот момент мышь вынимали из воды, помещали в клетку и сушили потоками теплого воздуха при помощи электрического фена. Животные каждой опытной группы плавали по одному разу в сутки по 3-3,5 ч, в течение 5 суток.
Мигающий световой раздражитель. По данным ряда авторов любая деятельность живого организма происходит в определенные временные интервалы, с которыми связана реализация различных физиологических процессов. Цикличность смены фаз света и темноты сформировала периодический адаптивный механизм выработки множества физиологических функций и процессов у человека и животных, для которых характерна суточная ритмичность [163-165]. В многочисленных экспериментах на животных зафиксировано существование суточных ритмов двигательной и психической активности, частоты дыхания, сердечнососудистых сокращений и артериального давления, температуры тела, диуреза и т. д. [166, 167].
В настоящей работе была использована модель хронического сбоя биоритма при помощи мигающего света. Стресс создавали путем постоянного яркого мерцания лампы накаливания мощностью 220 Вт в затемненном боксе по типу «светло – темно» в течение 21 суток. Интервал между вспышками составлял 3,0 сек, а длительность светового сигнала – 1,5 секунд.
В качестве контроля при всех моделях хронического стресса были использованы лабораторные мыши, находящиеся в стандартных условиях содержания.
Группы животных и схемы применения Биоспорина при экспериментальном моделировании хронического стресса
В результате проведенных исследований было установлено, что хронический иммобилизационный стресс подавляет способность Т- и В-лимфоцитов к образованию прочных розеткообразующих комплексов. Так, относительные и абсолютные значения Т- РОК и В- РОК у стрессируемых мышей второй группы, ниже аналогичных показателей у животных контрольной группы почти в четыре и более чем в два раза соответственно, что свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета у белых мышей.
Известно, что процесс образования розеток требует активного функционирования клеточной поверхности лимфоцита и значительных энергетических затрат. Иммуносупрессия клеток, вызванная иммобилизационным хроническим стрессом, может быть обусловлена нарушением дифференцировочных механизмов, а также, возможно, блокированием рецепторного аппарата лимфоцитов. Предварительное введение Биоспорина лабораторным мышам первой группы оказывает иммуностимулирующее влияние на сниженную в результате стресса розеткообразующую способность Т- и В- лимфоцитов. Относительное и абсолютное количество Т- РОК выше аналогичных значений у животных второй группы на 47,6 и 25,7 %, а В-РОК – на 54,1 и 35,0 %, соответственно, что свидетельствует о проявлении Биоспорином иммуностимулирующих свойств в отношении иммунокомпетентных клеток, способных под воздействием пробиотика к образованию прочных розеткообразующих комплексов.
Влияние Биоспорина на фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов определяли по поглотительной способности нейтрофилов периферической крови лабораторных мышей в отношении тест-объекта. На рисунках 10 и 11 представлены нейтрофильные гранулоциты крови белой мыши, фагоцитировавшие частицы латекса.
Показатели поглотительной способности нейтрофилов в периферической крови белых мышей по окончании экспериментального хронического иммобилизационного стресса (десятые сутки) Анализ результатов проведенных исследований показал, что иммобилизация животных в течение длительного времени приводит к угнетению поглотительной способности нейтрофилов периферической крови (НПК) экспериментальных животных, что сопровождается снижением значений фагоцитарного показателя (ФП) и фагоцитарного числа (ФЧ) полиморфноядерных фагоцитов. Так, значение фагоцитарного показателя во второй группе стрессируемых мышей без введения Биоспорина снижено на 50,3 % по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы.
Предварительное введение Биоспорина белым мышам первой группы приводит к увеличению поглотительной способности нейтрофилов. Иммуностимуляция функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток при иммобилизационном стрессе на фоне приема Биоспорина вызвана не только модуляцией активности фагоцитов, но и увеличением их количества в крови белых мышей. Эффективность Биоспорина, в данном случае, проявляется увеличением показателей фагоцитарного числа, свидетельствующего об интенсивности фагоцитоза, на 40,5 % по сравнению с аналогичным значением у мышей второй группы, что сопоставимо с таковым показателем у животных контрольной группы.
Обращают на себя внимание значения фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа в группе 3, где мыши получали Биоспорин без стрессирования. Поглотительная активность нейтрофильных фагоцитов настолько высока, что перекрывает указанные значения у интактных животных контрольной группы.
Анализ результатов НСТ-теста представленных на рисунке 14, указывает на угнетение метаболической активности НПК в группе стрессируемых белых мышей. Так, показатели спонтанного и стимулированного тестов во второй группе животных снижены по сравнению с аналогичными значениями у мышей в контрольной группе на 35,8 и 58,0 % соответственно. Данное обстоятельство свидетельствует о низких резервных возможностях внутриклеточных систем фагоцитов. Коэффициент стимуляции в указанной группе не превышает 0,80 у.е., что свидетельствует о недостаточности метаболической активности фагоцитов.
Предварительное введение пробиотика стрессируемым мышам первой группы приводит к увеличению показателей НСТ- спонтанного и НСТ-стимулированного в 1,5 и 1,7 раза соответственно, по сравнению с аналогичными значениями у животных второй группы. Коэффициент стимуляции у белых мышей получавших Биоспорин, также выше аналогичного значения у стрессированных животных без введения пробиотика почти в 1,5 раза, что свидетельствует об активации внутриклеточных микробоцидных систем и высокой готовности фагоцитов к завершенному фагоцитозу. На следующем этапе исследований было изучено влияние Биоспорина на гуморальный иммунный ответ белых мышей в условиях иммобилизационного стресса.
В последние годы большое диагностическое значение придают определению в сыворотке крови концентрации и размеров циркулирующих иммунных комплексов. Они представляют собой растворимые комплексы антиген-антитело, которые в норме фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Появление мелких ЦИК в большом количестве может приводить к иммунопатологическим процессам в органах и тканях макроорганизма.
Исследование функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата у белых мышей в тесте Порсолта
Проблема низкой адаптационной способности к воздействию стрессоров у сельскохозяйственных животных обусловлена современными методами ведения промышленного животноводства, а также ухудшением экологических факторов окружающей среды. В связи с этим изменяется комплекс приспособленческих механизмов, в процессе реализации которых происходит либо адаптация к стрессору, либо полная утрата резистентности, завершающаяся гибелью животных.
В период адаптации к острым или хроническим воздействиям неблагоприятных факторов нарушается гармоничность функционирования всех систем организма животных, и в первую очередь, угнетается деятельность иммунной системы.
Необходимо отметить, что в последние годы исследователи рассматривают функционирование иммунной системы при стресс-реакции в совокупности с работой кишечника, принимающего активное участие в реализации иммунных механизмов. Кишечная микрофлора обеспечивает формирование ключевых сигналов для созревания иммунной системы и активно контролирует связанный с кишечником иммунный гомеостаз [189].
С другой стороны, иммунодефицитное состояние макроорганизма, вызванное стрессом, является предпосылкой для изменения кишечного микробиоценоза, что обусловлено утратой способности у нормальной микрофлоры прикрепляться к рецепторам эпителиальных клеток слизистой оболочки и проявляется резким выведением бактерий-пробионтов из кишечника [110].
Предупреждение или минимизация отрицательных последствий стрессов является одним из важнейших факторов сохранения здоровья, повышения продуктивности животных и снижения затрат на получение продукции.
Одним из способов решения проблемы стрессовых состояний у сельскохозяйственных животных является применение лекарственных препаратов, способных предотвратить отрицательные последствия воздействия неблагоприятных факторов. Однако имеющиеся на сегодняшний день фармакологические средства не способны в полной мере решить вопросы адаптации стрессовых состояний из-за побочных реакций, оказывающих негативное влияние на организм сельскохозяйственных животных. Перспективным направлением решения проблемы дезадаптации сельскохозяйственных животных является использование пробиотических препаратов, сочетающих в себе такие важнейшие характеристики как эффективность и безопасность применения.
Исследованиями ряда авторов [23, 24] показано, что некоторые микроорганизмы, входящие в состав пробиотических препаратов способны не только оптимизировать микрофлору кишечника, но и стимулировать иммунную систему при воздействии на организм стрессовых факторов. С этих позиций особый интерес представляет препарат Биоспорин, созданный на основе двух штаммов спорообразующих бактерий – В. subtilis 3 и B.licheniformis 31. Биоспорин широко применяется для коррекции нарушений микрофлоры кишечника, вызванных не рациональным применением антибиотиков, нарушением питания, перенесенными инфекционными заболеваниями, для профилактики и лечения острых кишечных инфекций. Имеются данные, что препарат оказывает положительное влияние на иммунную систему макроорганизма, повышая неспецифическую резистентность к инфекционным заболеваниям посредством индукции эндогенного интерферона, стимуляции фагоцитарной активности лейкоцитов крови, а также синтеза иммуноглобулинов [190, 191].
Несмотря на достаточно длительное изучение и использование пробиотика Биоспорина в медицинской и ветеринарной практике, его потенциальные возможности раскрыты далеко не полностью. В частности, вопросы влияния Биоспорина на изменение реакций иммунной системы макроорганизма при хроническом стрессе остаются не изученными. В связи с вышеизложенным, исследование влияния пробиотического препарата Биоспорин на адаптационные реакции иммунной системы экспериментальных животных при различных видах хронического стресса является актуальной задачей.
В экспериментах на лабораторных мышах были использованы различные адекватные модели стресса, которые позволили исследовать влияние стрессовой реакции на состояние иммунной системы и изучить возможность коррекции нарушений иммунного статуса при помощи Биоспорина.
Для этого использовали три модели экспериментального воздействия: иммобилизационный стресс, тест Порсолта, а также мигающий световой раздражитель.
На первом этапе экспериментальных исследований оценивали влияние пробиотического препарата Биоспорин на адаптационные реакции иммунной системы организма лабораторных мышей при их многократной иммобилизации.
На основании полученных результатов было установлено, что системное ограничение движения лабораторных мышей приводит к угнетению факторов неспецифической резистентности в организме животных, что проявляется изменением морфологического состава клеток периферической крови и некоторых морфометрических показателей тимуса, селезенки и надпочечников.
Также выявлено, что хронический иммобилизационный стресс подавляет способность Т- и В- лимфоцитов к образованию прочных розеткообразующих комплексов, что сопровождается недостаточностью клеточного иммунного ответа, вызванного раздражителем и обусловлено, возможно, нарушением дифференцировочных механизмов или блокированием рецепторного аппарата лимфоцитов.